Preparazione di liposomi mediante ultrasuoni

I liposomi prodotti mediante ultrasuoni presentano un’efficienza di intrappolamento molto elevata, un’elevata capacità di carico e dimensioni sferiche uniformemente ridotte. Di conseguenza, i liposomi prodotti mediante ultrasuoni offrono un’eccellente biodisponibilità. Hielscher Ultrasonics offre sonicatori per la produzione affidabile di liposomi di grado farmaceutico in modalità batch e continua.

Vantaggi della produzione di liposomi mediante ultrasuoni

L’incapsulamento liposomiale mediante ultrasuoni è una tecnica utilizzata per incapsulare farmaci o altri agenti terapeutici all’interno dei liposomi utilizzando l’energia ultrasonica. Rispetto ad altri metodi di incapsulamento liposomiale, l’incapsulamento mediante ultrasuoni presenta diversi vantaggi che lo rendono una tecnica di produzione superiore.

• Elevato carico, elevata efficienza di intrappolamento: La produzione di liposomi mediante ultrasuoni è nota per ottenere liposomi con un elevato carico di principi attivi, ad esempio vitamina C, molecole di farmaci ecc. Allo stesso tempo, il metodo di sonicazione presenta un’elevata efficienza di intrappolamento. Ciò significa che un’elevata percentuale della sostanza attiva viene incapsulata mediante ultrasuoni. Questo rende la sonicazione un metodo altamente efficiente per la produzione di liposomi.
• Liposomi di dimensioni uniformemente ridotte: Un vantaggio dell’incapsulamento liposomiale mediante ultrasuoni è la capacità di produrre liposomi altamente uniformi con una distribuzione dimensionale ristretta. L’energia ultrasonica può essere utilizzata per frammentare liposomi più grandi o aggregati lipidici in liposomi più piccoli e uniformi. Ciò determina una maggiore uniformità delle dimensioni e della forma dei liposomi, che può essere importante nelle applicazioni di veicolazione dei farmaci, in cui le dimensioni delle particelle possono influire sulla loro farmacocinetica ed efficacia.
• Applicabile a qualsiasi molecola: Un altro vantaggio dell’incapsulamento liposomiale mediante ultrasuoni è la capacità di incapsulare un’ampia gamma di farmaci e altri agenti terapeutici. La tecnica può essere utilizzata per incapsulare sia farmaci idrofili sia farmaci idrofobi, operazione che può risultare difficile con altri metodi. Inoltre, l’energia ultrasonica può essere utilizzata per incapsulare macromolecole e nanoparticelle, che potrebbero essere troppo grandi per essere incapsulate con altri metodi.
• Rapido e affidabile: L’incapsulamento liposomiale mediante ultrasuoni è anche un processo relativamente semplice e rapido. Non richiede l’impiego di sostanze chimiche aggressive o temperature elevate, che possono danneggiare gli agenti terapeutici da incapsulare.
• Passaggio a scala maggiore: Inoltre, la tecnica può essere facilmente trasferita alla produzione su larga scala, rendendola un’opzione economicamente vantaggiosa per le applicazioni di veicolazione dei farmaci.

In sintesi, l’incapsulamento liposomiale mediante ultrasuoni è una tecnica superiore per l’incapsulamento nei liposomi grazie alla capacità di produrre liposomi uniformi con una distribuzione dimensionale ristretta, di incapsulare un’ampia gamma di agenti terapeutici e alla sua semplicità e scalabilità.

Dopo la formazione di un film lipidico e la successiva reidratazione, la sonicazione viene utilizzata per favorire l’intrappolamento dei principi attivi nel liposoma. Inoltre, la sonicazione consente di ottenere le dimensioni desiderate dei liposomi.

Preparazione di liposomi mediante ultrasuoni per prodotti farmaceutici e cosmetici

I liposomi (vescicole a base lipidica), i transferosomi (liposomi ultradeformabili), gli etosomi (vescicole ultradeformabili ad alto contenuto alcolico) e i niosomi (vescicole sintetiche) sono vescicole microscopiche che possono essere preparate artificialmente come vettori globulari nei quali incapsulare molecole attive. Queste vescicole, con diametri compresi tra 25 e 5000 nm, sono spesso utilizzate come vettori di farmaci nell’industria farmaceutica e cosmetica, ad esempio per la somministrazione orale o topica di farmaci, la terapia genica e l’immunizzazione. La sonicazione è un metodo scientificamente comprovato per la produzione altamente efficiente di liposomi. I sonicatori Hielscher producono liposomi con elevati carichi di principi attivi e una biodisponibilità superiore.

Liposomi e formulazione liposomiale

I liposomi sono sistemi vescicolari unilamellari, oligolamellari o multilamellari e sono costituiti dallo stesso materiale di una membrana cellulare (doppio strato lipidico). In base alla composizione e alle dimensioni, i liposomi si distinguono come segue:

• vescicole multilamellari (MLV, 0,1–10μm)
• vescicole unilamellari piccole (SUV, <100 nm)
• vescicole unilamellari grandi (LUV, 100–500 nm)
• vescicole unilamellari giganti (GUV, ≥1 μm)

La struttura principale dei liposomi è costituita da fosfolipidi. I fosfolipidi hanno un gruppo di testa idrofilo e un gruppo di coda idrofobo, costituito da una lunga catena idrocarburica.
La membrana dei liposomi ha una composizione molto simile a quella della barriera cutanea, per cui i liposomi possono integrarsi facilmente nella pelle umana. Fondendosi con la pelle, i liposomi possono rilasciare gli agenti intrappolati direttamente nel sito di destinazione, dove i principi attivi possono svolgere le loro funzioni. I liposomi migliorano quindi la penetrabilità/permeabilità cutanea agli agenti farmaceutici e cosmetici intrappolati. Anche i liposomi privi di agenti incapsulati, ossia le vescicole vuote, sono potenti principi attivi per la pelle, poiché la fosfatidilcolina contiene due sostanze essenziali che l’organismo umano non può produrre autonomamente: l’acido linoleico e la colina.
I liposomi sono utilizzati come vettori biocompatibili di farmaci, peptidi, proteine, DNA plasmidico, oligonucleotidi antisenso o ribozimi per scopi farmaceutici, cosmetici e biochimici. L’enorme versatilità delle dimensioni delle particelle e dei parametri fisici dei lipidi offre un interessante potenziale per la realizzazione di vettori su misura per un’ampia gamma di applicazioni. (Ulrich 2002)

Formazione di liposomi mediante ultrasuoni

I liposomi possono essere formati mediante ultrasuoni. Il materiale di base per la preparazione dei liposomi è costituito da molecole anfifiliche derivate dai lipidi delle membrane biologiche o basate su di essi. Per la formazione di vescicole unilamellari piccole (SUV), la dispersione lipidica viene sottoposta a sonicazione delicata – ad esempio con il dispositivo a ultrasuoni portatile UP50H (50W, 30kHz), il VialTweeter o il reattore a ultrasuoni CupHorn – in un bagno di ghiaccio. La durata di questo trattamento a ultrasuoni è di circa 5 – 15 minuti. Un altro metodo per produrre vescicole unilamellari piccole è la sonicazione di liposomi costituiti da vescicole multilamellari.
Dinu-Pirvu et al. (2010) riportano l’ottenimento di transferosomi mediante sonicazione delle MLV a temperatura ambiente.
Hielscher Ultrasonics offre diversi dispositivi a ultrasuoni, sonotrodi e accessori e può quindi fornire la configurazione a ultrasuoni più adatta per un incapsulamento liposomiale altamente efficiente a qualsiasi scala.

Incapsulamento di sostanze attive nei liposomi mediante ultrasuoni

I liposomi fungono da vettori per principi attivi quali vitamine, molecole terapeutiche, peptidi ecc. Gli ultrasuoni sono uno strumento efficace per preparare e formare liposomi destinati all’intrappolamento di agenti attivi. Al contempo, la sonicazione favorisce il processo di incapsulamento e intrappolamento, consentendo di produrre liposomi con un elevato carico di principi attivi. Prima dell’incapsulamento, i liposomi tendono a formare aggregati a causa dell’interazione superficiale tra le cariche delle teste polari dei fosfolipidi (cfr. Míckova et al. 2008); inoltre, devono essere aperti. Ad esempio, Zhu et al. (2003) descrivono l’incapsulamento di biotina in polvere nei liposomi mediante ultrasuoni. Dopo l’aggiunta della biotina in polvere alla soluzione contenente la sospensione di vescicole, la soluzione è stata sottoposta a sonicazione. Dopo questo trattamento, la biotina risultava intrappolata nei liposomi.
Scopri di più sull’incapsulamento di peptidi GLP-1 (ad es. semaglutide) nei liposomi mediante ultrasuoni!

Emulsioni liposomiali mediante sonicazione

Per potenziare l’effetto nutriente di creme idratanti o antietà, lozioni, gel e altre formulazioni cosmeceutiche, alle dispersioni liposomiali vengono aggiunti emulsionanti per stabilizzare quantità maggiori di lipidi. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che la capacità dei liposomi è generalmente limitata. Con l’aggiunta di emulsionanti, questo effetto si manifesta prima e gli emulsionanti aggiuntivi indeboliscono l’affinità della fosfatidilcolina per la barriera cutanea. Le nanoparticelle – composte da fosfatidilcolina e lipidi – sono la risposta a questo problema. Queste nanoparticelle sono costituite da una goccia d’olio ricoperta da un monostrato di fosfatidilcolina. L’impiego di nanoparticelle consente di ottenere formulazioni in grado di incorporare più lipidi e rimanere stabili, senza necessità di emulsionanti aggiuntivi.
La sonicazione è un metodo comprovato per la produzione di nanoemulsioni e nanodispersioni. Gli ultrasuoni ad alta intensità forniscono la potenza necessaria per disperdere una fase liquida (fase dispersa) in piccole goccioline all’interno di una seconda fase (fase continua). Nella zona di dispersione, le bolle di cavitazione che implodono provocano intense onde d’urto nel liquido circostante e determinano la formazione di getti di liquido ad alta velocità. Per stabilizzare le goccioline appena formate della fase dispersa contro la coalescenza, all’emulsione vengono aggiunti emulsionanti (sostanze ad attività superficiale, tensioattivi) e stabilizzanti. Poiché la coalescenza delle goccioline dopo la frammentazione influisce sulla distribuzione dimensionale finale delle goccioline, si utilizzano emulsionanti con un’efficace azione stabilizzante per mantenere tale distribuzione uguale a quella presente immediatamente dopo la frammentazione delle goccioline nella zona di dispersione a ultrasuoni.

Dispersioni liposomiali mediante sonicazione

Le dispersioni liposomiali a base di fosfatidilcolina insatura presentano una scarsa stabilità all’ossidazione. La stabilizzazione della dispersione può essere ottenuta mediante antiossidanti, ad esempio un complesso di vitamine C ed E.
 

Formazione di liposomi mediante il metodo di evaporazione in fase inversa con sonicazione

 
Ortan et al. (2002) hanno ottenuto buoni risultati nel loro studio sulla preparazione mediante ultrasuoni di olio essenziale di Anethum graveolens nei liposomi. Dopo la sonicazione, le dimensioni dei liposomi erano comprese tra 70–150 nm e, per le MLV, tra 230–475 nm; questi valori sono rimasti approssimativamente costanti anche dopo 2 mesi, ma sono aumentati dopo 12 mesi, soprattutto nella dispersione di SUV (vedere gli istogrammi di seguito). Le misurazioni della stabilità, relative alla perdita di olio essenziale e alla distribuzione dimensionale, hanno inoltre mostrato che le dispersioni liposomiali mantenevano il contenuto di olio volatile. Ciò suggerisce che l’intrappolamento dell’olio essenziale nei liposomi ne abbia aumentato la stabilità.

Ortan et al. (2009): stabilità delle dispersioni di MLV e SUV dopo 1 anno. Le formulazioni liposomiali sono state conservate a 4±1 ºC.

I processori a ultrasuoni Hielscher sono i dispositivi ideali per le applicazioni nell’industria cosmetica e farmaceutica. I sistemi costituiti da più processori a ultrasuoni, ciascuno con una potenza fino a 16.000 watt, forniscono la capacità necessaria per trasformare questa applicazione di laboratorio in un metodo di produzione efficiente per ottenere emulsioni finemente disperse in flusso continuo o in batch – raggiungendo risultati paragonabili a quelli dei migliori omogeneizzatori ad alta pressione oggi disponibili, come quelli con valvole a orifizio. Oltre a questa elevata efficienza nell’emulsificazione continua, i dispositivi a ultrasuoni Hielscher richiedono pochissima manutenzione e sono molto facili da utilizzare e pulire. Gli ultrasuoni favoriscono effettivamente la pulizia e il risciacquo. La potenza ultrasonica è regolabile e può essere adattata a prodotti specifici e alle esigenze di emulsificazione. Sono disponibili anche speciali reattori con cella di flusso che soddisfano i requisiti avanzati CIP (pulizia in loco) e SIP (sterilizzazione in loco).

Domande frequenti sui liposomi

Quali tipi di liposomi si distinguono?

I liposomi sono classificati in diversi tipi in base alle loro dimensioni e al numero di doppi strati che contengono. Queste categorie comprendono:

• Vescicole unilamellari piccole (SUV): Sono i liposomi più piccoli, con un unico doppio strato lipidico.
• Vescicole unilamellari grandi (LUV): Più grandi delle SUV, anch’esse presentano un unico doppio strato.
• Vescicole multilamellari (MLV): Contengono più doppi strati concentrici.
• Vescicole multivescicolari (MVV): Sono composte da più vescicole piccole all’interno di una vescicola più grande.

 
Altri tipi specializzati comprendono:

• Liposomi PEGilati: Liposomi modificati con polietilenglicole (PEG) per migliorare la stabilità e il tempo di permanenza in circolo.
• Nanoliposomi: Liposomi molto piccoli, tipicamente utilizzati per la veicolazione mirata dei farmaci.

Quali strutture vescicolari possono presentare i liposomi?

I liposomi sono ulteriormente suddivisi in sette tipi principali in base alla loro struttura vescicolare:

• Vescicole multilamellari grandi (MLV): Contengono più doppi strati.
• Vescicole oligolamellari (OLV): Presentano pochi doppi strati.
• Vescicole unilamellari piccole (SUV): Le più piccole, con un unico doppio strato.
• Vescicole unilamellari di medie dimensioni (MUV): Di dimensioni intermedie, con un unico doppio strato.
• Vescicole unilamellari grandi (LUV): Più grandi, con un unico doppio strato.
• Vescicole unilamellari giganti (GUV): Molto grandi, con un unico doppio strato.
• Vescicole multivescicolari (MVV): Più vescicole all’interno di un’unica vescicola grande.

Quali sono le differenze tra liposomi e niosomi?

I liposomi e i niosomi differiscono principalmente per la composizione:
Liposomi: Costituiti da fosfolipidi a doppia catena, che possono essere neutri o carichi.
Niosomi: Costituiti da tensioattivi non carichi a catena singola e colesterolo.
Entrambe le strutture si formano mediante sonicazione, che favorisce l’assemblaggio delle vescicole a doppio strato.

Qual è la dimensione ideale di un liposoma?

Per la veicolazione terapeutica, la dimensione ideale di un liposoma è teoricamente compresa tra 50 e 200 nanometri di diametro. Questo intervallo dimensionale ottimizza la stabilità e la biodisponibilità. La sonicazione viene comunemente utilizzata per ridurre la vescicola alle dimensioni desiderate.

I liposomi possono trasportare farmaci idrofili?

Sì, i liposomi possono trasportare farmaci idrofili. Sono apprezzati nelle applicazioni biomediche per la loro capacità di incapsulare sia agenti idrofobi sia agenti idrofili. Inoltre, offrono un’elevata biocompatibilità e biodegradabilità, che li rendono sistemi di veicolazione efficaci.

Come si preparano i liposomi?

Le tecniche più comuni per la preparazione dei liposomi sono il metodo del film sottile e il metodo di evaporazione in fase inversa.
Metodo di idratazione del film sottile:

1. Sciogliere i lipidi in un solvente organico.
2. Far evaporare il solvente per formare un film lipidico sottile.
3. Idratare il film con una soluzione acquosa utilizzando la sonicazione per formare vescicole multilamellari.

Metodo di evaporazione in fase inversa:

1. Sciogliere i lipidi in acqua ed etanolo.
2. Sottoporre la soluzione a sonicazione a 60°C per circa 10 minuti per creare una pasta lipidica.
3. Raffreddare la sospensione lipidica e aggiungere acqua o tampone goccia a goccia sotto agitazione.
4. Idratare la sospensione per 1 ora per formare vescicole multilamellari.
5. Ridurre le dimensioni dei liposomi mediante un’ulteriore sonicazione.

Che cosa sono gli archeosomi?

Gli archeosomi sono liposomi costituiti da lipidi degli archei, noti per la loro stabilità e resistenza a condizioni estreme. Queste proprietà rendono gli archeosomi particolarmente utili per la veicolazione dei farmaci e lo sviluppo di vaccini in ambienti difficili.

Come si preparano gli archeosomi?

Procedura di sonicazione secondo Pise (2022): gli archeosomi possono essere prodotti dalla frazione lipidica polare “PLF” di Sulfolobussolfataricus mediante sonicazione a 60°C, senza necessità di un apporto esterno di lipidi. A 0°C, i lipidi polari di Sulfolobusacidocaldarius sono stati efficacemente sottoposti a sonicazione per formare archeosomi. Gli archeosomi caricati con BMD e i liposomi convenzionali, così come i lipidi degli archei isolati da Archaea H. salinarum e arricchiti con fosfatidilcolina, sono stati preparati utilizzando tecniche di sonicazione. Le vescicole sonicate per la somministrazione topica sono state prodotte sottoponendo a sonicazione dispersioni di MLV all’80 percento di ampiezza per 4 minuti utilizzando un sonicatore a sonda Hielscher UP50H (vedere l’immagine a sinistra).

Bibliografia/Riferimenti

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.