Preparazione di Liposomi attraverso l’Uso di Ultrasuoni

I liposomi prodotti con ultrasuoni mostrano un'efficienza di intrappolamento molto elevata, un'alta capacità di carico e dimensioni sferiche uniformemente ridotte. I liposomi prodotti con ultrasuoni offrono quindi un'eccellente biodisponibilità. Hielscher Ultrasonics offre ultrasuonatori per la produzione affidabile di liposomi di qualità farmaceutica in modalità batch e continua.

Vantaggi della produzione di liposomi a ultrasuoni

L'incapsulamento ultrasonico dei liposomi è una tecnica utilizzata per incapsulare farmaci o altri agenti terapeutici all'interno di liposomi utilizzando energia ultrasonica. Rispetto ad altri metodi di incapsulamento dei liposomi, l'incapsulamento a ultrasuoni presenta diversi vantaggi che la rendono una tecnica di produzione superiore.

• Elevato carico, elevata efficienza di intrappolamento: La produzione di liposomi con ultrasuoni è ben nota per produrre liposomi con un elevato carico di principi attivi, ad esempio vitamina C, molecole di farmaci ecc. Allo stesso tempo, il metodo di sonicazione mostra un'elevata efficienza di intrappolamento. Ciò significa che un'alta percentuale di principio attivo viene incapsulata con gli ultrasuoni. In conclusione, ciò rende l'ultrasonicazione un metodo altamente efficiente per la produzione di liposomi.
• Liposomi uniformemente piccoli: Un vantaggio dell'incapsulamento liposomico a ultrasuoni è la capacità di produrre liposomi altamente uniformi con una distribuzione dimensionale ristretta. L'energia ultrasonica può essere utilizzata per rompere i liposomi più grandi o gli aggregati lipidici in liposomi più piccoli e uniformi. Questo porta a una maggiore coerenza nelle dimensioni e nella forma dei liposomi, che può essere importante per le applicazioni di somministrazione di farmaci in cui le dimensioni delle particelle possono influire sulla loro farmacocinetica ed efficacia.
• Applicabile a qualsiasi molecola: Un altro vantaggio dell'incapsulamento a ultrasuoni dei liposomi è la capacità di incapsulare un'ampia gamma di farmaci e altri agenti terapeutici. La tecnica può essere utilizzata per incapsulare sia farmaci idrofili che idrofobici, cosa difficile da fare con altri metodi. Inoltre, l'energia degli ultrasuoni può essere utilizzata per incapsulare macromolecole e nanoparticelle, che potrebbero essere troppo grandi per essere incapsulate con altri metodi.
• Veloce e affidabile: L'incapsulamento dei liposomi a ultrasuoni è anche un processo relativamente semplice e veloce. Non richiede l'uso di sostanze chimiche aggressive o di temperature elevate, che possono essere dannose per gli agenti terapeutici incapsulati.
• Scala di sviluppo: Inoltre, la tecnica può essere facilmente scalata per la produzione su larga scala, rendendola un'opzione economicamente vantaggiosa per le applicazioni di somministrazione di farmaci.

In sintesi, l'incapsulamento liposomico a ultrasuoni è una tecnica superiore per l'incapsulamento dei liposomi grazie alla sua capacità di produrre liposomi uniformi con una distribuzione dimensionale ristretta, di incapsulare un'ampia gamma di agenti terapeutici e alla sua semplicità e scalabilità.

Dopo la formazione di una pellicola lipidica e la successiva reidratazione, si ricorre alla sonicazione per favorire l'intrappolamento dei principi attivi nel liposoma. Inoltre, la sonicazione consente di ottenere le dimensioni desiderate del liposoma.

Preparazione di Liposomi attraverso l’Uso di Ultrasuoni per il Settore Farmaceutico e Cosmetico

I liposomi (vescicole a base lipidica), i transferosomi (liposomi ultradeformabili), gli etosomi (vescicole ultradeformabili ad alto contenuto alcolico) e i niosomi (vescicole sintetiche) sono vescicole microscopiche che possono essere preparate artificialmente come vettori globulari in cui incapsulare molecole attive. Queste vescicole con diametro compreso tra 25 e 5000 nm sono spesso utilizzate come vettori di farmaci nell'industria farmaceutica e cosmetica, ad esempio per la somministrazione di farmaci per via orale o topica, per la geneterapia e per l'immunizzazione. L'ultrasonicazione è un metodo scientificamente provato per la produzione di liposomi ad alta efficienza. Gli ultrasuonatori Hielscher producono liposomi con elevati carichi di principi attivi e biodisponibilità superiore.

Liposomi e formulazione liposomiale

I liposomi sono sistemi vescicolari unilamellari, oligolamellari o multilamellari e sono composti dallo stesso materiale della membrana cellulare (bilayer lipidico). In base alla loro composizione e alle loro dimensioni, i liposomi si differenziano come segue:

• vescicole multilamellari (MLV, 0,1-10μm)
• piccole vescicole unilamellari (SUV, <100 nm)
• grandi vescicole unilamellari (LUV, 100-500 nm)
• vescicole unilamellari giganti (GUV, ≥1 μm)

La struttura principale dei liposomi è costituita da fosfolipidi. I fosfolipidi hanno un gruppo di testa idrofilo e un gruppo di coda idrofobo, costituito da una lunga catena di idrocarburi.
. La membrana del liposoma ha una composizione molto simile a quella della barriera cutanea e questo gli consente di essere facilmente innestato nella pelle umana. Dal momento che i liposomi si possono facilmente innestare nella pelle umana possono scaricare gli agenti attivi direttamente alla destinazione finale, permettendo così ai suddetti principi attivi, di cui sono vettori, di svolgere più efficacemente le loro funzioni. Così operando i liposomi permettono un miglioramento nella penetrazione degli agenti attivi sotto pelle e dunque una miglior efficacia del principio attivo. I liposomi tuttavia non svolgono soltanto la funzione di trasportatori di agenti attivi, bensì anche senza alcun agente incapsulato al loro interno sono ad esempio potenti principi attivi per la pelle, ad esempio il fosfatidilcolina incorpora due elementi essenziali, che l'organismo umano da solo non riesce a produrre: l’acido linoleico e il colina.
I liposomi vengono utilizzati come vettori biocompatibili per farmaci, peptidi, proteine, DNA plasmatico, oligonucleotidi antisenso o ribozimi nel settore farmaceutico o cosmetico. Grazie al diametro altamente variabile e versatile dei liposomi, questo consente di creare veicoli su misura per una vasta gamma di applicazioni. (Ulrich 2002)

Processo di Formazione di Liposomi attraverso l’Utilizzo di Ultrasuoni

I liposomi possono essere formati attraverso l’utilizzo di ultrasuoni. Il materiale di base per la preparazione dei liposomi è costituito da molecole di amfifillico derivato o amfifillico basato sulla membrana biologica dei lipidi. Per la formazione di liposomi unilamellari piccoli (SUV), la dispersione dei lipidi è sonicata delicatamente – Ad esempio, con il dispositivo portatile a ultrasuoni UP50H (50W, 30kHz), il VialTweeter o il reattore a ultrasuoni CupHorn. – in un bagno di ghiaccio. La durata di tale trattamento ad ultrasuoni dura circa dai 5 ai 15 minuti. Un altro metodo per la produzione di liposomi unilamellari piccoli consiste nella sonicazione di liposomi multilamellari.
Dinu-Pirvu (et al. 2010) è riuscito ad ottenere dei transfersomi attraverso la sonicazione di liposomi multilamellari a temperatura ambiente.
Hielscher Ultrasonics offre diversi dispositivi a ultrasuoni, sonotrodi e accessori ed è quindi in grado di fornire la configurazione a ultrasuoni più adatta per un incapsulamento di liposomi altamente efficiente su qualsiasi scala.

Incapsulamento a ultrasuoni di sostanze attive in liposomi

I liposomi funzionano come vettori di principi attivi come vitamine, molecole terapeutiche, peptidi, ecc. Gli ultrasuoni sono uno strumento efficace per preparare e formare i liposomi per l'intrappolamento degli agenti attivi. Contemporaneamente, la sonicazione favorisce il processo di incapsulamento e intrappolamento, in modo da produrre liposomi con un elevato carico di principi attivi. Prima dell'incapsulamento, i liposomi tendono a formare cluster a causa dell'interazione carica-superficie delle teste polari dei fosfolipidi (cfr. Míckova et al. 2008), inoltre devono essere aperti. A titolo di esempio, Zhu et al. (2003) descrivono l'incapsulamento della polvere di biotina nei liposomi mediante ultrasuoni. Quando la polvere di biotina è stata aggiunta alla soluzione di sospensione delle vescicole, la soluzione è stata sonicata. Dopo questo trattamento, la biotina è stata intrappolata nei liposomi.

Emulsioni liposomiali con ultrasuoni

Per migliorare l'effetto nutritivo o quello anti-invecchiamento di creme idratanti, gel o altre formulazioni cosmetiche, gli emulsionanti vengono aggiunti alle dispersioni liposomiali per stabilizzare una maggiore quantità di lipidi. Ma le indagini avevano dimostrato che la capacità dei liposomi è generalmente limitata. Con l'aggiunta di emulsionanti questo effetto comparirà prima e un’ulteriore aggiunta di emulsionanti causerà l’indebolimento dell'affinità di barriera di fosfatidilcolina. Le nanoparticelle – composti di fosfatidilcolina e lipidi – sono la risposta a questo problema. Queste nanoparticelle sono formate da una piccola goccia di olio ricoperta da un monostrato di fosfatidilcolina. L'uso delle nanoparticelle permette la creazione di formulazioni capaci di assorbire più lipidi e quindi in grado di rimanere stabili, così da non richiedere l’ulteriore aggiunta di emulsionanti.
L'ultrasuonoterapia è un metodo collaudato per la produzione di nanoemulsioni e nanodispersioni. Gli ultrasuoni ad alta intensità forniscono la potenza necessaria per disperdere una fase liquida (fase dispersa) in piccole gocce in una seconda fase (fase continua). Nella zona di dispersione, l'implosione delle bolle di cavitazione provoca intense onde d'urto nel liquido circostante e porta alla formazione di getti di liquido ad alta velocità. Per stabilizzare le goccioline appena formate della fase dispersa contro la coalescenza, all'emulsione vengono aggiunti emulsionanti (sostanze tensioattive, tensioattivi) e stabilizzatori. Poiché la coalescenza delle goccioline dopo la disgregazione influenza la distribuzione finale delle dimensioni delle goccioline, si utilizzano emulsionanti efficacemente stabilizzanti per mantenere la distribuzione finale delle dimensioni delle goccioline a un livello uguale alla distribuzione immediatamente successiva alla disgregazione delle goccioline nella zona di dispersione a ultrasuoni.

Dispersioni liposomiali mediante ultrasuoni

Le dispersioni liposomiale, che sono basate su fosfatidilcolina insatura, mancano di stabilità contro l'ossidazione. La stabilizzazione di tali dispersioni può essere raggiunta grazie a antiossidanti, come ad esempio un complesso di vitamine C ed E.
 

Formazione di liposomi attraverso il metodo dell'evaporazione in fase inversa con la sonicazione

 
Ortan (et al. 2002) nel suo studio riguardante la preparazione ad ultrasuoni di olio essenziale di Anethum graveolens sottoforma di liposomi ha conseguito buoni risultati. Dopo il processo di sonicazione, la dimensione dei liposomi era compresa tra i 70 e i 150 nm e per le MLV tra i 230 e i 475 nm; questi valori sono rimasti approssimativamente costanti anche dopo due mesi dalla produzione, ma trascorsi dodici mesi sono aumentati, soprattutto nella dispersione SUV (vedi istogramma qui sotto). Misurando la stabilità dell’olio essenziale si è compreso che vi è stata una perdita nella dimensione di distribuzione delle gocce, ma si è anche appreso che la dispersione liposomiale ha mantenuto volatile il contenuto di olio. Questo fenomeno suggerisce che l’incapsulamento dell’olio essenziale nei liposomi ne ha aumentato la stabilità.

Ortan et al. (2009): Stabilità delle dispersioni MLV e SUV dopo 1 anno. Le formulazioni liposomiali sono state conservate a 4±1 ºC.

I processori a ultrasuoni Hielscher sono i dispositivi ideali per le applicazioni nell'industria cosmetica e farmaceutica. Sistemi composti da più processori a ultrasuoni fino a 16.000 watt ciascuno, forniscono la capacità necessaria per tradurre questa applicazione di laboratorio in un efficiente metodo di produzione per ottenere emulsioni finemente disperse in flusso continuo o in batch. – ottenendo risultati paragonabili a quelli dei migliori omogeneizzatori ad alta pressione oggi disponibili, come le valvole a orifizio. Oltre a questa elevata efficienza nell'emulsione continua, i dispositivi a ultrasuoni Hielscher richiedono una manutenzione molto ridotta e sono molto facili da usare e da pulire. Gli ultrasuoni supportano infatti la pulizia e il risciacquo. La potenza degli ultrasuoni è regolabile e può essere adattata a particolari prodotti e requisiti di emulsionamento. Sono disponibili anche reattori speciali a cella di flusso che soddisfano i requisiti avanzati CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place).

Domande frequenti sui liposomi

Quali tipi di liposomi si distinguono?

I liposomi sono classificati in diversi tipi in base alle loro dimensioni e al numero di bilayer che contengono. Queste categorie comprendono:

• Piccole vescicole unilamellari (SUV): Si tratta dei liposomi più piccoli con un singolo bilayer lipidico.
• Grandi vescicole unilamellari (LUV): Più grandi dei SUV, hanno anch'essi un singolo strato bilayer.
• Vescicole multilamellari (MLV): Questi contengono più bilayer concentrici.
• Vescicole multivescicolari (MVV): Sono composti da più vescicole più piccole all'interno di una vescicola più grande.

 
Altri tipi specializzati includono:

• Liposomi pegilati: Liposomi modificati con polietilenglicole (PEG) per aumentare la stabilità e il tempo di circolazione.
• Nanoliposomi: Liposomi molto piccoli, tipicamente utilizzati per la somministrazione mirata di farmaci.

Quali strutture vescicolari possono presentare i liposomi?

I liposomi sono ulteriormente classificati in base alla loro struttura vescicolare in sette tipi principali:

• Grandi vescicole multilamellari (MLV): Contengono più bilayer.
• Vescicole oligolamellari (OLV): Avere alcuni bilayer.
• Piccole vescicole unilamellari (SUV): Il più piccolo con un singolo bilayer.
• Vescicole unilamellari di medie dimensioni (MUV): Dimensioni intermedie con un singolo bilayer.
• Grandi vescicole unilamellari (LUV): Più grande con un singolo bilayer.
• Vescicole unilamellari giganti (GUV): Molto grande con un singolo bilayer.
• Vescicole multivescicolari (MVV): Vescicole multiple all'interno di un'unica grande vescicola.

Quali sono le differenze tra liposomi e niosomi?

I liposomi e i niosomi differiscono principalmente per la loro composizione:
Liposomi: Sono costituiti da fosfolipidi a doppia catena, che possono essere neutri o carichi.
Niosomi: A base di tensioattivi a catena singola non caricati e colesterolo.
Entrambe le strutture si formano attraverso la sonicazione, che favorisce l'assemblaggio delle vescicole bilayered.

Qual è la dimensione ideale di un liposoma?

Per la somministrazione terapeutica, la dimensione ideale di un liposoma è teoricamente compresa tra 50 e 200 nanometri di diametro. Questo intervallo di dimensioni ottimizza la stabilità e la biodisponibilità. La sonicazione è comunemente utilizzata per ridurre la vescicola alle dimensioni desiderate.

I liposomi possono trasportare farmaci idrofili?

Sì, i liposomi possono trasportare farmaci idrofili. Sono apprezzati nelle applicazioni biomediche per la loro capacità di incapsulare agenti sia idrofobici che idrofili. Inoltre, offrono un'elevata biocompatibilità e biodegradabilità, che li rende efficaci sistemi di somministrazione.

Come si producono i liposomi?

Le tecniche più comuni di preparazione dei liposomi sono il metodo a film sottile e il metodo di evaporazione in fase inversa.
Metodo di idratazione a film sottile:

1. Sciogliere i lipidi in un solvente organico.
2. Far evaporare il solvente per formare un sottile film lipidico.
3. Idratare il film con una soluzione acquosa mediante sonicazione per formare vescicole multilamellari.

Metodo di evaporazione in fase inversa:

1. Sciogliere i lipidi in acqua ed etanolo.
2. Sonicare la soluzione a 60°C per circa 10 minuti per creare una pasta lipidica.
3. Raffreddare lo slurry lipidico e aggiungere acqua o tampone a goccia mescolando.
4. Idratare la sospensione per 1 ora per formare vescicole multilamellari.
5. Ridurre le dimensioni del liposoma mediante ulteriore sonicazione.

Cosa sono gli archeosomi?

Gli archeosomi sono liposomi prodotti con lipidi di origine arcaica, noti per la loro stabilità e resistenza a condizioni estreme. Queste proprietà rendono gli archeosomi particolarmente utili per la somministrazione di farmaci e lo sviluppo di vaccini in ambienti difficili.

Come si preparano gli archeosomi?

Procedura di sonicazione secondo Pise (2022): Gli archeosomi possono essere prodotti a partire dalla frazione lipidica polare “PLF” di Sulfolobussolfataricus mediante sonicazione a 60°C senza necessità di reintegrare i lipidi esterni. A 0°C, i lipidi polari di Sulfolobusacidocaldarius sono stati efficacemente sonicati per formare archeosomi. Gli archeosomi caricati con BMD e i liposomi convenzionali, così come i lipidi arcaici isolati dall'archaea H. salinarum e arricchiti con fosfatidilcolina, sono stati realizzati con tecniche di sonicazione. Le vescicole sonicate sono state create per la somministrazione topica sonicando le dispersioni di MLV all'80% di ampiezza per 4 minuti con un sonicatore a sonda Hielscher UP50H (vedi immagine a sinistra).

Letteratura/riferimenti