Ekstraksi Protein dari Jaringan Tumor Berbantuan Sonikasi – Protokol

Protokol ini menjelaskan metode ekstraksi protein dari jaringan tumor berbantuan sonikasi yang menyempurnakan alur kerja lisis urea standar CPTAC dengan menambahkan langkah sonikasi probe terkontrol selama disrupsi jaringan. Berdasarkan strategi preparasi proteom dan fosfoproteom CPTAC mendalam yang telah mapan, modifikasi ini meningkatkan disrupsi sel dan struktur subseluler, mengurangi viskositas sampel, serta meningkatkan pelepasan protein yang biasanya lebih sulit diperoleh hanya dengan lisis urea, terutama protein yang terikat pada membran serta protein pengikat DNA atau yang berasosiasi dengan inti sel. Dalam penelitian yang mendasarinya, alur kerja berbantuan sonikasi meningkatkan deteksi protein maupun fosfopeptida sekaligus mempertahankan kompatibilitas dengan rangkaian proses hilir bergaya CPTAC yang mencakup digesti, pelabelan TMT, fraksinasi, pengayaan fosfopeptida, dan analisis LC-MS/MS.

Ekstraksi Protein dari Jaringan Tumor Berbantuan Sonikasi untuk Analisis Proteomik dan Fosfoproteomik Mendalam

Protokol berikut dioptimalkan untuk ekstraksi protein dari jaringan tumor yang telah dihaluskan secara kriogenik dalam buffer lisis urea 8 M: Penambahan langkah sonikasi tipe probe meningkatkan perolehan golongan protein yang sulit diekstraksi, terutama protein yang berasosiasi dengan membran serta DNA/inti sel, sebelum digesti dan analisis LC-MS/MS hilir. Dalam penelitian yang mendasarinya oleh Li et al. (2025), penambahan sonikasi meningkatkan deteksi protein yang berasosiasi dengan membran dan inti sel serta mendukung cakupan mendalam yang mencakup >12.000 protein dan >25.000 fosfopeptida dalam alur kerja mereka.

Bidang Penerapan Protokol

Gunakan prosedur ini untuk:

• jaringan tumor yang dibekukan dalam keadaan segar dan dihaluskan secara kriogenik
• pelet sel atau spesimen biologis lainnya yang telah memiliki metode ekstraksi berbasis urea yang mapan
• alur kerja proteomik global dan fosfoproteomik yang menggunakan digesti tripsin dan pelabelan TMT opsional

Penelitian oleh Li et al. (2025) menyatakan bahwa alur kerja ini juga dapat diterapkan pada jenis spesimen lain seperti lini sel, darah, dan urine, tetapi optimasi mungkin diperlukan sesuai jenis sampel.

Alur kerja preparasi sampel yang dioptimalkan dengan penerapan langkah sonikasi. Alur kerja yang dioptimalkan dan rancangan eksperimen didasarkan pada protokol preparasi sampel CPTAC untuk analisis proteomik global dan fosfoproteomik.
Penelitian dan skema: ©Li et al., 2025

Prinsip Kerja

Penelitian asli menambahkan sonikasi ke alur kerja lisis urea standar CPTAC dan menemukan peningkatan deteksi protein yang berasosiasi dengan membran dan inti sel. Para penulis menyatakan bahwa parameter sonikasi harus disesuaikan secara cermat dengan ukuran/konsentrasi sampel – dengan memilih ukuran sonotrode, masukan energi, dan pengaturan waktu pulsa.

Sebagai contoh, untuk Hielscher UP200Ht dan UP200St, hal ini berarti:

• gunakan amplitudo dan mode pulsa sebagai variabel kontrol utama
• jaga sampel tetap dingin sepanjang proses (yaitu di atas es)
• mulai dengan pengaturan konservatif
• lakukan optimasi berdasarkan kejernihan sampel, suhu, hasil perolehan protein, dan kualitas peptida pada tahap hilir

 
Kedua model sonikator Hielscher berdaya 200 watt, UP200Ht dan UP200St, dirancang untuk volume sampel kecil dan sedang, dengan pengaturan amplitudo dan pulsa yang dapat disesuaikan; kedua homogenizer ultrasonik menyediakan kontrol layar sentuh digital untuk penyesuaian parameter yang presisi, pencatatan data otomatis, sensor suhu yang dapat dipasang, kendali jarak jauh, dan pencahayaan sampel.
 

Reagen untuk Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

Buffer lisis urea

Siapkan yang baru tepat sebelum digunakan:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea harus dilarutkan sepenuhnya sebelum bahan tambahan dimasukkan; inhibitor harus ditambahkan tepat sebelum digunakan; buffer harus disimpan di atas es; dan setelah bahan tambahan dimasukkan, disarankan mencampur dengan gerakan memutar perlahan daripada melakukan vorteks kuat.
 

Reagen tambahan:

• Reagen uji protein BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodoasetamida
• LysC
• Tripsin
• Asam format
• Reagen TMT, jika menggunakan proteomik kuantitatif multipleks
• Reagen IMAC, jika melakukan pengayaan fosfopeptida

Peralatan untuk Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

Diperlukan

Pemilihan Probe yang Direkomendasikan

Untuk sampel sekitar 200–1000 µL, gunakan sonotrode berdiameter kecil yang sesuai untuk pemrosesan langsung berintensitas tinggi pada volume kecil. Hielscher menyediakan berbagai diameter sonotrode, dan diameter ujung yang lebih kecil menghasilkan intensitas yang lebih tinggi pada ujungnya.

Catatan praktis: Gunakan probe terkecil yang menghasilkan pencampuran efisien tanpa pembentukan busa berlebihan atau kontak dengan dinding wadah.

Jika Anda menangani beberapa sampel sekaligus, Anda dapat mempertimbangkan Sonikator Multitabung VialTweeter atau Sonikator Mikroplat UIP400MTP!

Petunjuk Langkah demi Langkah: Prosedur Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

A. Dinginkan Terlebih Dahulu dan Siapkan

1. Dinginkan sentrifus hingga 4°C.
2. Siapkan buffer lisis urea yang baru dan simpan di atas es.
3. Pasang UP200Ht atau UP200St pada statif di dalam kotak peredam suara.
4. Siapkan bak es yang cukup besar untuk menampung tabung sampel dalam posisi tegak dan stabil.

Penyiapan buffer yang baru dan penanganan dalam kondisi dingin sangat penting.

B. Ekstraksi Awal dengan Urea

1. Simpan jaringan yang telah dihaluskan secara kriogenik di atas es.
2. Tambahkan 200 µL buffer lisis urea dingin untuk setiap 50 mg jaringan basah.
3. Lakukan vorteks selama 5–10 s pada kecepatan tinggi.
4. Inkubasi selama 15 min pada 4°C.
5. Ulangi langkah vorteks disertai inkubasi satu kali lagi.
6. Sentrifugasi pada 20.000g selama 10 min pada 4°C.
7. Pindahkan lisat/supernatan ke tabung bersih dengan daya ikat rendah.

C. Sonikasi Menggunakan UP200Ht atau UP200St

Kondisi Awal untuk Sonikasi

• Amplitudo: mulai pada 20–30%
• Durasi pulsa: 5 s AKTIF
• Pendinginan: 2 min di atas es di antara pulsa
• Jumlah siklus: 4 siklus
• Total waktu sonikasi aktif: 20 s
• Total waktu proses termasuk pendinginan: sekitar 8–10 min

Langkah Sonikasi

1. Pindahkan lisat ke tabung yang sesuai untuk sonikasi. Gunakan tabung sempit berdinding tipis yang memungkinkan pertukaran panas yang baik dan pencelupan probe secara aman.
2. Tempatkan tabung di dalam bak es. Artikel penelitian tersebut menyatakan bahwa pendinginan selama sonikasi sangat penting untuk mencegah kerusakan akibat panas.
3. Celupkan ujung probe ke dalam sampel. Pastikan ujungnya terendam cukup dalam untuk menghasilkan kavitasi yang stabil, tetapi jangan biarkan ujungnya menyentuh dinding atau dasar tabung.
4. Jalankan satu pulsa selama 5 s pada amplitudo awal.
5. Segera kembalikan seluruh sampel ke dalam es selama 2 min.
6. Ulangi hingga 4 siklus selesai.
7. Periksa lisat setelah siklus.
8. Lanjutkan hanya jika diperlukan, dengan satu pulsa tambahan selama 5 s setiap kali, yang selalu diikuti pendinginan penuh.
9. Hentikan setelah lisat menjadi lebih seragam dan tidak terlalu berserat/kental.
   Titik akhir ditandai dengan lisat yang lebih tembus cahaya dan membentuk tetesan, alih-alih aliran kental yang kontinu.
10. Sentrifugasi pada sekitar 16.000g selama 15 min pada 4°C.
11. Pindahkan supernatan yang telah dijernihkan ke tabung baru dan ukur konsentrasi protein.

Perbandingan proteomik global dan fosfoproteomik antara sampel yang disonikasi dan yang tidak disonikasi.
a. Jumlah protein yang teridentifikasi (proteomik global) pada seluruh jaringan tumor PDX dengan atau tanpa sonikasi. b. Jumlah fosfopeptida yang teridentifikasi (pengayaan IMAC) pada seluruh jaringan tumor PDX dengan atau tanpa sonikasi. Hanya protein dan fosfopeptida dengan rasio kelimpahan lebih besar dari atau sama dengan persentil ke-25 yang dihitung. Rasio kelimpahan dihitung antara jenis sampel yang sama.
Penelitian dan grafik: ©Li et al., 2025

Digesti dan Analisis Hilir

Setelah sonikasi dan penjernihan, lanjutkan sebagaimana dijelaskan dalam alur kerja asli bergaya CPTAC:

1. Encerkan lisat 1:3 (v/v) dengan 50 mM Tris-HCl pH 8,0 untuk menurunkan konsentrasi urea hingga <2 M.
2. Tambahkan LysC sebanyak 1 mAU per 50 µg protein dan inkubasi selama 2 h pada 25°C.
3. Tambahkan tripsin dengan rasio enzim:substrat 1:49 (w/w) dan lakukan digesti semalaman pada 25°C.
4. Hentikan reaksi dengan asam format hingga konsentrasi akhir 1%.
5. Lanjutkan ke penghilangan garam, pelabelan TMT, fraksinasi, pengayaan fosfopeptida, dan LC-MS/MS sesuai kebutuhan.

Ekspresi diferensial fosfopeptida dari MS berlabel TMT.
a. Subtipe basal, yang menyoroti beberapa fosfopeptida manusia (awal dan akhir urutan protein) yang mengalami peningkatan ekspresi pada sampel yang disonikasi dibandingkan dengan sampel yang tidak disonikasi. b. Subtipe luminal, yang menyoroti beberapa fosfopeptida manusia (awal dan akhir protein_sequence) yang mengalami peningkatan ekspresi pada sampel yang disonikasi dibandingkan dengan sampel yang tidak disonikasi. c. Jalur KEGG yang diperkaya berdasarkan protein dari fosfopeptida yang mengalami peningkatan ekspresi pada subtipe basal tumor yang disonikasi. d. Jalur KEGG yang diperkaya berdasarkan protein dari fosfopeptida yang mengalami peningkatan ekspresi pada subtipe luminal tumor yang disonikasi.
Penelitian dan grafik: ©Li et al., 2025

Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

Sonikator ultrasonik Hielscher terkenal karena standar kualitas dan desainnya yang tertinggi. Ketangguhan dan kemudahan pengoperasian memungkinkan integrasi sonikator ultrasonik kami ke dalam fasilitas industri secara lancar. Sonikator ultrasonik Hielscher mampu menangani kondisi berat dan lingkungan yang menuntut dengan mudah.

Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikasi ISO yang memberikan perhatian khusus pada sonikator ultrasonik berkinerja tinggi dengan teknologi mutakhir dan kemudahan penggunaan. Tentu saja, sonikator ultrasonik Hielscher mematuhi CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA, dan RoHs.

Literatur / Referensi

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.