Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi dari Jaringan Tumor – Protokol

Protokol ini menjelaskan metode ekstraksi protein dengan bantuan sonikasi untuk jaringan tumor yang memajukan alur kerja lisis urea CPTAC standar dengan menambahkan langkah sonikasi probe terkontrol selama gangguan jaringan. Dibangun di atas strategi persiapan proteome dan fosfoproteome CPTAC skala dalam yang sudah mapan, modifikasi ini meningkatkan gangguan struktur sel dan subseluler, mengurangi viskositas sampel, dan meningkatkan pelepasan protein yang biasanya lebih sulit untuk dipulihkan dengan lisis urea saja, terutama yang terikat pada membran dan pengikatan DNA atau protein yang terkait dengan nukleus. Dalam studi yang mendasari, alur kerja yang dibantu sonikasi meningkatkan deteksi protein dan fosfopeptida sambil menjaga kompatibilitas dengan pencernaan gaya CPTAC hilir, pelabelan TMT, fraksinasi, pengayaan fosfopeptida, dan pipa analisis LC-MS / MS.

Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi dari Jaringan Tumor untuk Analisis Proteomik dan Fosfoproteomik Mendalam

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Area Aplikasi untuk Protokol

Gunakan prosedur ini untuk:

• jaringan tumor segar yang dibekukan dan dikriopulverisasi
• pelet sel atau spesimen biologis lainnya di mana ekstraksi berbasis urea sudah ditetapkan
• alur kerja proteomik dan fosfoproteomik global menggunakan pencernaan tryptic dan pelabelan TMT opsional

Studi oleh Li dkk. (2025) menyatakan bahwa alur kerja ini juga dapat diterapkan pada jenis spesimen lain seperti garis sel, darah, dan urin, namun pengoptimalan mungkin diperlukan berdasarkan jenis sampel.

Alur kerja persiapan sampel yang dioptimalkan dengan langkah sonikasi yang diimplementasikan. Alur kerja yang dioptimalkan dan desain eksperimental didasarkan pada protokol persiapan sampel CPTAC untuk analisis proteomik dan fosfoproteomik global.
Studi dan skema: ©Li dkk., 2025

prinsip kerja

Penelitian asli menambahkan sonikasi ke dalam alur kerja lisis urea CPTAC standar dan menemukan peningkatan deteksi protein yang terkait dengan membran dan inti. Para penulis menyatakan bahwa parameter sonikasi harus disesuaikan dengan ukuran/konsentrasi sampel – dengan memilih ukuran sonotrode, input energi, dan waktu denyut nadi.

Teladan, untuk Hielscher UP200Ht dan UP200St, ini berarti:

• menggunakan mode amplitudo dan pulsa sebagai variabel kontrol utama
• menjaga sampel tetap dingin (yaitu di atas es)
• mulai dengan pengaturan konservatif
• mengoptimalkan kejernihan sampel, suhu, hasil protein, dan kualitas peptida hilir

 
Kedua model sonikator Hielscher 200 watt UP200Ht dan UP200St dirancang untuk volume sampel kecil dan menengah, dengan pengaturan amplitudo dan denyut nadi yang dapat disesuaikan; kedua penghomogen ultrasonik menyediakan kontrol layar sentuh digital untuk penyesuaian parameter yang tepat, perekaman data otomatis, sensor suhu yang dapat dicolokkan, kendali jarak jauh, pencahayaan sampel.
 

Reagen untuk Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

Penyangga lisis urea

Siapkan segera sebelum digunakan:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg / mL aprotinin
• 10 µg / mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktail Penghambat Fosfatase 2, 1:100 (v/v)
• Koktail Penghambat Fosfatase 3, 1:100 (v/v)

Urea harus benar-benar larut sebelum menambahkan aditif; inhibitor harus ditambahkan segera sebelum digunakan; buffer harus disimpan di atas es; dan disarankan untuk memutar daripada berputar-putar dengan kuat setelah menambahkan aditif.
 

Reagen tambahan:

• Reagen uji protein BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• Iodoacetamide
• LysC
• Tripsin
• Asam format
• Reagen TMT, jika menggunakan proteomik kuantitatif multipleks
• Reagen IMAC, jika melakukan pengayaan fosfopeptida

Peralatan untuk Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

Diperlukan

Pemilihan probe yang disarankan

Untuk sampel sekitar 200-1000 µL, gunakan sonotrode berdiameter kecil yang sesuai untuk pemrosesan langsung dengan intensitas tinggi pada volume kecil. Hielscher menawarkan beberapa diameter sonotrode, dan diameter ujung yang lebih kecil memberikan intensitas yang lebih tinggi pada ujungnya.

Catatan praktis: Gunakan probe terkecil yang menghasilkan pencampuran yang efisien tanpa pembusaan yang berlebihan atau kontak dengan dinding bejana.

Jika Anda bekerja dengan beberapa sampel pada saat yang bersamaan, Anda dapat mempertimbangkan VialTweeter Sonicator Multi-Tube Sonicator atau Microplate Sonicator UIP400MTP!

Petunjuk Langkah-demi-Langkah: Prosedur Ekstraksi Protein Berbantuan Sonikasi

A. Pra-pendinginan dan Persiapan

1. Dinginkan sentrifus hingga suhu 4°C.
2. Siapkan buffer lisis urea segar dan simpan di atas es.
3. Siapkan UP200Ht atau UP200St di atas dudukan di dalam penutup suara.
4. Siapkan penangas es yang cukup besar untuk menahan tabung sampel dengan tegak dan stabil.

Persiapan buffer segar dan penanganan dingin sangat penting.

B. Ekstraksi Urea Awal

1. Simpan jaringan kriopulver di atas es.
2. Tambahkan 200 µL buffer lisis urea dingin per 50 mg jaringan basah.
3. Pusaran 5-10 detik pada kecepatan tinggi.
4. Inkubasi 15 menit pada suhu 4°C.
5. Ulangi langkah vortex-plus-inkubasi sekali lagi.
6. Sentrifus pada 20.000 g selama 10 menit pada suhu 4°C.
7. Pindahkan lisat/supernatan ke tabung bersih yang tidak berikatan.

C. Sonikasi dengan menggunakan UP200Ht atau UP200St

Kondisi Awal untuk Sonikasi

• Amplitudo: mulai dari 20-30%
• Panjang pulsa: 5 detik AKTIF
• Pendinginan: 2 menit di atas es di antara denyut nadi
• Jumlah siklus: 4 siklus
• Total waktu sonikasi aktif: 20 detik
• Total waktu proses termasuk pendinginan: sekitar 8-10 menit

Langkah-langkah Sonikasi

1. Pindahkan lisat ke tabung yang sesuai untuk sonikasi. Gunakan tabung sempit berdinding tipis yang memungkinkan pertukaran panas yang baik dan pencelupan probe yang aman.
2. Tempatkan tabung di dalam penangas es. Makalah ini mengidentifikasi pendinginan selama sonikasi sebagai hal yang sangat penting untuk mencegah kerusakan akibat panas.
3. Celupkan ujung probe ke dalam sampel. Jaga agar ujungnya tetap terendam secukupnya untuk kavitasi yang stabil, tetapi jangan sampai menyentuh dinding atau dasar tabung.
4. Jalankan satu pulsa 5 detik pada amplitudo awal.
5. Segera kembalikan sampel sepenuhnya ke dalam es selama 2 menit.
6. Ulangi sampai 4 siklus selesai.
7. Periksa lisat setelah siklus.
8. Lanjutkan hanya jika diperlukan, dengan menggunakan satu pulsa tambahan 5 detik setiap kali, selalu diikuti dengan pendinginan penuh.
9. Hentikan setelah lisat menjadi lebih seragam dan tidak terlalu berserabut/kental.
   Titik akhirnya adalah lisat yang lebih tembus cahaya yang membentuk tetesan daripada aliran kental yang terus menerus.
10. Sentrifus dengan kecepatan sekitar 16.000 g selama 15 menit pada suhu 4°C.
11. Pindahkan supernatan yang telah diklarifikasi ke tabung baru dan ukur konsentrasi protein.

Perbandingan proteomik global dan fosfoproteomik antara sampel yang disonikasi dan yang tidak disonikasi.
a. Jumlah protein yang teridentifikasi (proteomik global) di semua jaringan tumor PDX dengan atau tanpa sonikasi. b. Jumlah fosfopeptida yang teridentifikasi (pengayaan IMAC) di semua jaringan tumor PDX dengan atau tanpa sonikasi. Hanya protein dan fosfopeptida dengan rasio kelimpahan lebih besar atau sama dengan persentil ke-25 yang dihitung. Rasio kelimpahan dihitung antara jenis sampel yang sama.
Studi dan grafik: ©Li dkk., 2025

Pencernaan dan Analisis Hilir

Setelah sonikasi dan klarifikasi, lanjutkan seperti yang dijelaskan dalam alur kerja gaya CPTAC yang asli:

1. Encerkan lisat 1:3 (v/v) dengan 50 mM Tris-HCl pH 8.0 untuk mengurangi urea menjadi <2 M.
2. Tambahkan LysC pada 1 mAU per 50 µg protein dan inkubasi selama 2 jam pada suhu 25°C.
3. Tambahkan tripsin dengan perbandingan 1:49 enzim:substrat (w/w) dan cerna semalaman pada suhu 25°C.
4. Padamkan dengan asam format hingga 1% akhir.
5. Lanjutkan desalting, pelabelan TMT, fraksinasi, pengayaan fosfopeptida, dan LC-MS/MS sesuai kebutuhan.

Ekspresi diferensial fosfopeptida dari MS berlabel TMT.
a. Subtipe basal, menyoroti beberapa fosfopeptida manusia (urutan protein awal dan akhir) yang diregulasi dalam sampel yang disonikasi dibandingkan dengan sampel yang tidak disonikasi. b. Subtipe luminal, menyoroti beberapa fosfopeptida manusia (urutan protein awal dan akhir) yang diregulasi dalam sampel yang disonikasi dibandingkan dengan sampel yang tidak disonikasi. c. Jalur KEGG yang diperkaya berdasarkan protein fosfopeptida yang diregulasi pada subtipe basal tumor yang disonikasi. d. Jalur KEGG yang diperkaya berdasarkan protein fosfopeptida yang diregulasi pada subtipe luminal tumor yang disonikasi.
Studi dan grafik: ©Li dkk., 2025

Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

Ultrasonicators Hielscher terkenal dengan kualitas dan standar desainnya yang tertinggi. Ketahanan dan pengoperasian yang mudah memungkinkan integrasi ultrasonicator kami ke dalam fasilitas industri. Kondisi kasar dan lingkungan yang menuntut mudah ditangani oleh ultrasonicator Hielscher.

Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikat ISO dan memberikan penekanan khusus pada ultrasonicators berkinerja tinggi yang menampilkan teknologi canggih dan keramahan pengguna. Tentu saja, ultrasonicators Hielscher sesuai dengan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA dan RoHs.

Literatur / Referensi