Persiapan Ultrasonik Sampel C. elegans

C. elegans, cacing nematoda, adalah organisme model yang banyak digunakan dalam biologi. Persiapan sampel sebelum analisis membutuhkan lisis, ekstraksi protein dan lipid serta fragmentasi RNA, yang dapat dilakukan dengan andal melalui sonikasi. Pengganggu sel ultrasonik adalah perangkat yang andal, canggih, dan mudah digunakan untuk persiapan sampel C. elegans dengan cepat.

Persiapan Ultrasonik Sampel C. elegans

C. elegans adalah cacing gelang, yang banyak digunakan di laboratorium penelitian untuk menyelidiki genomik, biologi perkembangan, dan penyakit. Banyak gen dalam genom C. elegans memiliki rekan fungsional pada manusia. Dengan demikian, cacing nematoda adalah model yang sangat berguna untuk penyakit manusia. Keuntungan lain untuk penggunaan C. elegans secara luas adalah budidayanya yang mudah dan murah di atas piring yang mengandung bakteri (misalnya, E.), transparansi, penanganan yang mudah, serta kemungkinan untuk membekukan dan menyimpan cacing untuk waktu yang lebih lama.
Analisis protein dan lipid adalah prosedur reguler di laboratorium dan persiapan sampel ultrasonik adalah metode yang ditetapkan untuk melisiskan nematoda C. elegans di setiap tahap perkembangan (yaitu embrio, larva L1-L4, dewasa). Karena C. elegans juga digunakan sebagai sistem ekspresi protein untuk mengekspresikan protein yang ditargetkan secara berlebihan, diperlukan metode lisis dan ekstraksi protein yang andal dan dapat direproduksi, yang memberikan hasil protein yang tinggi. Sistem gangguan dan ekstraksi sel ultrasonik tersedia sebagai homogenizer tipe probe dan sebagai ultrasonicator multi-sampel. Melayani persiapan sampel yang nyaman dan semua jenis ukuran sampel angka, Hielscher Ultrasonics memiliki pengganggu sel ultrasonik yang ideal untuk prosedur lab Anda.

Protokol Ultrasonik untuk Gangguan dan Lisis C. elegans

Homogenisasi ultrasonik dan lisis C. elegans dan ekstraksi protein dan lipid berikutnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai prosedur menggunakan buffer homogenisasi dan lisis yang berbeda, dll. Semua protokol lisis memiliki kesamaan bahwa sampel harus terus disimpan di atas es untuk mencegah degradasi protein. Di bawah ini, kami menyajikan kepada Anda beberapa protokol lisis dan ekstraksi ultrasonik yang andal dan cepat untuk persiapan sampel C. elegans yang mengandung protein atau lipid berkualitas tinggi.

Keuntungan dari Ultrasonic C. elegans Lysis

• dapat diandalkan
• direproduksi
• Suhu yang dikontrol dengan tepat
• Kontrol proses yang andal
• Metode lembut
• Mudah diaplikasikan
• Aman

Ekstraksi Protein Ultrasonik dari Sampel C. elegans

Lisis ultrasonik dan ekstraksi protein cacing C. elegans dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai protokol. Di bawah ini kami menyajikan kepada Anda beberapa protokol lisis yang andal dan cepat untuk hasil ekstraksi protein yang dapat direproduksi.

Persiapan Cepat Ekstrak Sitosol dari Cacing C. elegans dengan Sonikasi

Dengan protokol berikut Anda dapat menyiapkan lisat C. elegans dalam waktu kurang dari 30 menit.
Koleksi C. elegans
Pilih cacing C. elegans yang diinginkan ke dalam tabung fosfat buffer garam (PBS) 1,5ml atau cuci dari piring dengan 1,5ml PBS. Centrifuge selama 1 menit pada 2000rpm untuk pelet. Simpan sampel setiap saat di atas es.
Kemudian, cuci cacing dua kali dengan PBS.
Setelah itu, cuci cacing dua kali dengan ddH₂O.
Suspensikan kembali cacing setidaknya dalam 500ul buffer homogenisasi (HB). Sampel cacing sekarang siap untuk lisis ultrasonik.
Untuk kualitas ekstrak protein yang lebih tinggi, Anda mungkin ingin mengurangi kontaminasi bakteri dengan mencuci cacing masing-masing selama 5 menit dalam PBS dan air steril dan ultra-murni (ddH₂O) atau melakukan pengapungan sukrosa. Simpan sampel cacing terus menerus di atas es.

Protokol Lisis Ultrasonik C. elegans

• Pastikan Anda menyiapkan ultrasonicator di muka sehingga homogenizer ultrasonik siap digunakan (probe terpasang, program sonikasi yang telah diatur sebelumnya).

Jika ultrasonicator Anda terpasang di tempat berdiri, tempatkan penangas es dengan tabung sampel di bawah probe ultrasonik dan masukkan probe ultrasonik ke dalam tabung 1.5ml.

• Untuk lisis C. elegans dengan UP200St atau UP200Ht, ultrasonication harus dilakukan menggunakan microtip (misalnya, probe 2mm S26d2; lihat gambar kiri) pada amplitudo 40% selama 1 detik dengan jeda 30 detik di antaranya. 5 siklus sonikasi untuk setiap 1 detik dengan jeda 30 detik sangat ideal untuk lisis C. elegans. Jika Anda melakukan lisis untuk pertama kalinya, Anda dapat memeriksa perkembangan lisis dalam alikuot kecil sampel setelah setiap pulsa menggunakan mikroskop.
• Lisis berhasil diselesaikan ketika cacing terganggu. Sonikasi berlebihan mengakibatkan kerusakan inti dan menjadi terlihat ketika sampel menjadi kental atau berbusa. Untuk mencegah degradasi sampel, gunakan lebih banyak pulsa jika diperlukan. Jangan menambah waktu setiap siklus pulsa ultrasonik untuk mendapatkan ekstrak protein berkualitas tinggi.
• Bersihkan lisat sel dengan memudarkan cacing yang dilisis secara ultrasonik pada 14.000rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC.
• Kemudian, pindahkan supernatan ke tabung baru dan bersiaplah untuk imunopresipitasi atau pengujian lainnya.

Catatan untuk buffer homogenisasi: Siapkan buffer homogenisasi untuk protokol lisis ultrasonik di atas sebagai berikut:

Lisis Throughput Tinggi C. elegans dalam Pelat 96 Sumur menggunakan Sonicator Pelat UIP400MTP

C. elegans Lysis (nematoda dewasa)
UIP400MTP 80% amplitudo, 20 siklus (setiap siklus sonikasi: 30 detik ON, 30 detik OFF)
Penyangga lisis:

• Opsi 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• Opsi 2) untuk Ko-imunopresipitasi (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Koktail penghambat proteinase lengkap)

Fragmentasi DNA Throughput Tinggi
C. elegans (nematoda dewasa) DNA 200-300bp: UIP400MTP pelat sonicator – Atur 80% amplitudo, 30pulsa – Setiap 30 detik aktif, 30 detik mati

UIP400MTP Plate Sonicator untuk persiapan sampel throughput tinggi secara seragam sonikasi sampel dalam multi-sumur, pelat mikrotiter, dan pelat 96 sumur

Lisis Ultrasonik C. elegans untuk Uji Pemurnian Afinitas Kuantitatif

Embrio C. elegans (∼2 juta per replikasi) baru dipanen dalam rangkap tiga kali lipat biologis dengan memutihkan hermafrodit gravid muda dan disonikasi di atas es (siklus: 0,5 detik, amplitudo: 40–45%, 5 pukulan/sesi, 5 sesi, interval antar sesi: 30 detik; Prosesor ultrasonik UP200S dengan ujung mikro S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) dalam buffer lisis (volume total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% gliserol, campuran penghambat protease, 0.1% Nonidet P-40 Substitute). Setelah sonikasi, Nonidet P-40 Substitute ditambahkan hingga 1% dan lisat diinkubasi dengan rotasi kepala di atas ekor pada 4 °C selama 30 menit, diikuti dengan sentrifugasi pada 20.000 × g selama 20 menit pada 4 °C. Lisat yang dibersihkan kemudian disedot tanpa mengganggu lapisan lipid atas dan dibagi setengahnya menjadi manik-manik agarosa anti-GFP atau manik-manik kontrol yang diblokir (40-50 μl). Setelah rotasi kepala di atas ekor pada 4°C selama 60–90 menit, manik-manik dicuci sekali dengan buffer lisis yang mengandung 0,1% Nonidet P-40 Substitute, diikuti dengan dua kali pencucian dalam buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) atau buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) atau keduanya. Untuk pull-down GFP:MBK-2, dua percobaan terpisah dilakukan dengan menggunakan kondisi pencucian yang berbeda. Protein dielusi dengan pengocok orbital dalam 50 μl urea 6 m/2 M thiourea pada suhu kamar. Untuk percobaan pull-down MBK-1::GFP, protein dielusi dua kali dengan mengocok dalam 50μl guanidinium klorida 8 m pada suhu 90°C, diikuti dengan presipitasi etanol. Sampel protein yang dielusi kemudian dicerna dalam larutan.
(lih. Chen et al., 2016)

Homogenisasi dan Lisis Cacing Ultrasonik

Untuk prosedur lisis C.elegans dan ekstraksi protein, 30.000 nemotode dari tahap yang relevan dikumpulkan per sampel dan dicuci dalam S-basal sedingin es, terkonsentrasi dengan sentrifugasi pada 1500 rpm selama 2 menit, dicuci enam kali dengan S-basal sedingin es untuk menghilangkan sisa bakteri, dan kemudian disimpan di atas es sampai siap digunakan. Untuk ekstraksi protein, cacing gravid-dewasa dibiarkan membentuk pelet kompak setelah pencucian S-basal terakhir. Pelet cacing kemudian disuspensi kembali dalam 1 ml Buffer Ekstraksi dingin es [20 mM kalium fosfat, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitor protease (Sigma P2714)] dan segera diproses.
∼30.000 cacing gravid-dewasa (sesuai dengan ∼100 mg berat basah), disonikasi di atas es menggunakan ultrasonicator tipe probe (misalnya UP50H dengan microtip MS2) pada amplitudo 40% selama 10 siklus 3 detik aktif, 30 detik mati, dalam 1 ml buffer ekstraksi dingin. (lih. Baskharan et al. 2012)

Ekstraksi Lipid Ultrasonik dari C. elegans

Dalam lipidomik, cabang metabolomik, komplemen lipid sistem biologis dikarakterisasi dan dianalisis. C. elegans banyak digunakan dalam lipidomik untuk menyelidiki interaksi lipid metabolik dan pengaruhnya terhadap kesehatan dan umur.
Lisis dan ekstraksi ultrasonik digunakan untuk melepaskan lipid seperti sphingolipid dari embrio C. elegans, larva, dan cacing dewasa. Ultrasonikasi digunakan untuk menyiapkan homogenat cacing dan selanjutnya untuk mengekstrak lipid dari sampel.
Protokol untuk Ekstraksi Lipid Ultrasonik dari C. elegans
Lelehkan pelet C. elegans di atas es dan tangguhkan kembali dengan 0,5 ml ultrawater. 
Sonicasi sampel C. elegans dalam tabung reaksi 1,5mL, sambil menjaga sampel terus menerus di atas es.
Sonikasi dapat dilakukan dengan menggunakan probe-ultrasonicstor seperti UP200Ht, unit persiapan sampel ultrasonik VialTweeter (sonikasi simultan dari 10 sampel) atau UIP400MTP (untuk sonikasi pelat multi-sumur seperti pelat 96-sumur). Untuk lisis ultrasonik dengan UP200Ht, gunakan ujung mikro S26d2. Atur mode siklus ultrasonik di menu digital. Atur amplitudo ke 10% dan mode siklus sonikasi 2 detik pulsa 20 siklus dengan jeda 30 detik antara setiap ledakan denyut ultrasonik.
Pindahkan supernatan ke tabung kaca dengan tutup sekrup. 
Lakukan ekstraksi Folch dengan menambahkan 1 ml ultrawater ke setiap tabung kaca, diikuti dengan menambahkan 6 ml campuran kloroform/metanol (rasio = 2:1) ke setiap tabung kaca.
Putar setiap tabung kaca selama 30 detik selama 4 kali. 
Centrifuge tabung pada 1,258 x g selama 15 menit (Eppendorf, 5810 R) untuk lebih meningkatkan pemisahan fase. 
Pindahkan fraksi hidrofobik yang lebih rendah ke tabung kaca bersih dengan pipet kaca Pasteur. 
Keringkan fraksi hidrofobik yang lebih rendah di bawah aliran nitrogen dalam evaporator nitrogen. 
Simpan pelet kering dalam freezer -80 °C sampai digunakan.

Persiapan Ultrasonik Lisat Cacing

Lisat cacing: Cacing tahap L4 dipanen dan dicuci tiga kali dengan buffer M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl, dan 0,87 mM MgSO₄) untuk menghilangkan semua bakteri. Setelah menghilangkan buffer M9 sebanyak mungkin, cacing disuspensi kembali dalam buffer lisis: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-gliserol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrium fluorida, 1 mM natrium ortovanadat, 5 mM natrium pirofosfat, 0,2 mM fenilmetanasulfonilfluorida dan penghambat protease. Cacing dibekukan dalam nitrogen cair dan dicairkan pada suhu 37 °C selama tiga kali, kemudian cacing disonikasi pada es kering dengan unit VialTweeter ultrasonik untuk persiapan simultan 10 tabung sampel. Sonikasi dilakukan pada amplitudo 50% dalam 10 siklus 2 detik dengan jeda 30 detik antara semburan sonikasi. Setelah itu, sampel disentrifugasi pada 12000 rpm pada 4°C selama 15 menit. Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu -70°C. Aliquot digunakan untuk kuantifikasi protein dengan uji Bradford.
Penentuan total glutathione, GSH, dan GSSG: Untuk kuantifikasi glutathione, lisat dan penentuan dibuat pada hari yang sama. Larva L4 yang diberi makan glukosa dan kontrol dipanen dan dicuci dengan buffer M9 tiga kali. Setelah menghilangkan buffer M9 sebanyak mungkin, cacing ditangguhkan kembali dalam asam metafosfat dingin es (5% w / v), kemudian cacing disonikasi dalam es dengan VialTweeter ultrasonik pada amplitudo 50% dalam sepuluh siklus sonikasi 2 detik dengan jeda 30 detik di antara setiap siklus. Setelah itu, sentrifugasi pada 12000 rpm pada 4 ̊C selama 15 menit.
(lih. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Persiapan Sampel C. elegans sebelum Imunopresipitasi dan Western Blotting

Singkatnya, untuk ekstrak embrio, larva C. elegans L1 ditanam dalam kultur S-medium cair skala besar hingga dewasa. Embrio dikumpulkan menggunakan metode pemutih standar dan tersuspensi dalam buffer lisis (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% gliserol, 0,05% NP-40, 1 Protease Inhibitor Cocktail, dan 1 Phosphatase Inhibitor Cocktail I dan II), dengan cepat dibekukan dalam nitrogen cair, dan dilisis dengan gangguan sel ultrasonik menggunakan ultrasonicator dengan microtip seperti UP200Ht dengan S26d2 untuk 10 pulsa lebih dari 10 detik pada amplitudo 30%. Jika sampel dalam jumlah yang lebih besar harus disiapkan, ultrasonik VialTweeter atau MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP untuk pelat sumur direkomendasikan. Setelah sonikasi, ekstrak telah dibersihkan sebelumnya dengan sentrifugasi pada 30.000g selama 20 menit pada 4 °C. Ekstrak yang telah dibersihkan sebelumnya (300μg protein total) diinkubasi dengan 40μg antibodi yang dimurnikan afinitas anti-CDC-25.1 (penelitian ini) yang dihubungkan silang dengan protein A-agarosa, atau sebagai kontrol, jumlah imunoglobulin kelinci (Ig)G yang serupa yang dihubungkan silang dengan protein A-agarosa digunakan dalam volume total 200μl buffer lisis yang mengandung 1% NP-40, yang dimasukkannya mengurangi pengikatan nonspesifik protein ke matriks. Sampel diputar selama 1 jam pada suhu 4°C, manik-manik dicuci tiga kali dengan buffer lisis, dan dielusi dengan 30μl glisin/HCl dan 200 mM NaCl, pH 2.2. Setelah imunopresipitasi, eluat diencerkan dalam 30μll buffer sampel SDS, dipanaskan hingga 95°C selama 4 menit, dan biasanya 3% dari total untuk input dan 30% untuk eluat dioleskan ke SDS-PAGE diikuti dengan Western blotting dengan anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500), atau antibodi anti-β-aktin (1:2000). Jika ekstrak tidak mengalami imunopresipitasi, jumlah protein total yang sama yang berasal dari ekstrak tersebut disuspensi kembali dalam buffer sampel SDS, dipanaskan hingga 95°C, dan kemudian langsung dioleskan ke SDS-PAGE dan dianalisis dengan Western blotting. (lih. Segref et al. 2020)

Lisis Ultrasonik di bawah Kontrol Suhu Prescise

Kontrol suhu yang tepat dan andal sangat penting saat menangani sampel biologis. Suhu tinggi memulai degradasi protein yang diinduksi secara termal dalam sampel.
Seperti semua teknik persiapan sampel mekanis, sonikasi menciptakan panas. Namun, suhu sampel dapat dikontrol dengan baik saat menggunakan VialTweeter. Kami menyajikan berbagai opsi untuk memantau dan mengontrol suhu sampel Anda sambil menyiapkannya dengan VialTweeter dan VialPress untuk analisis.

1. Memantau suhu sampel: Prosesor ultrasonik UP200St, yang menggerakkan VialTweeter, dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dicolokkan. Colokkan sensor suhu ke UP200St dan masukkan ujung sensor suhu ke salah satu sample tabung. Melalui layar sentuh berwarna digital, Anda dapat mengatur di menu UP200St kisaran suhu tertentu untuk sonikasi sampel Anda. Ultrasonicator akan berhenti secara otomatis ketika suhu maksimum tercapai dan berhenti sampai sample suhu turun ke nilai yang lebih rendah dari ∆ suhu yang disetel. Kemudian sonikasi dimulai secara otomatis lagi. Fitur pintar ini mencegah degradasi yang disebabkan oleh panas.
2. Blok VialTweeter dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
3. Gunakan es kering untuk mendinginkan selama sonikasi. Gunakan nampan dangkal berisi es kering dan letakkan VialTweeter di atas es kering agar panas dapat menghilang dengan cepat.

Temukan Pengganggu Sel Ultrasonik yang Optimal untuk Aplikasi Lisis Anda

Hielscher Ultrasonics adalah produsen pengganggu sel ultrasonik dan homogenizer berkinerja tinggi yang berpengalaman lama untuk laboratorium, bench-top dan sistem skala industri. Ukuran kultur sel bakteri Anda, tujuan penelitian atau produksi Anda, dan volume sel yang akan diproses per jam atau hari adalah faktor penting untuk menemukan pengganggu sel ultrasonik yang tepat untuk aplikasi Anda.
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk sonikasi simultan multi-sampel (hingga 10 vial) serta sampel massa (yaitu, pelat mikrotiter / pelat 96-sumur), ultrasonicator laboratorium tipe probe klasik dengan tingkat daya yang berbeda dari 50 hingga 400 watt untuk prosesor ultrasonik industri sepenuhnya dengan hingga 16.000watt per unit untuk gangguan sel komersial dan ekstraksi protein dalam produksi besar. Semua ultrasonicator Hielscher dibangun untuk operasi 24/7/365 di bawah beban penuh. Kekokohan dan keandalan adalah fitur inti dari perangkat ultrasonik kami.
Semua homogenizer ultrasonik digital dilengkapi dengan perangkat lunak pintar, layar sentuh berwarna, dan protokol data otomatis, yang membuat perangkat ultrasonik menjadi alat kerja yang nyaman di laboratorium dan fasilitas produksi.
Beri tahu kami, jenis sel apa, volume apa, dengan frekuensi apa dan dengan target apa yang Anda miliki untuk memproses sampel biologis Anda. Kami akan merekomendasikan Anda pengganggu sel ultrasonik yang paling cocok untuk kebutuhan proses Anda.

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami dari homogenizer genggam kompak dan Ultrasonicators MultiSample hingga prosesor ultrasonik industri untuk aplikasi komersial: