Preparasi Ultrasonik Sampel C. Elegans

C. elegans, sejenis cacing nematoda, merupakan organisme model yang banyak digunakan dalam biologi. Preparasi sampel sebelum analisis memerlukan lisis, ekstraksi protein dan lipid, serta fragmentasi RNA, yang dapat dilakukan secara andal melalui sonikasi. Perangkat disrupsi sel ultrasonik merupakan perangkat yang andal, canggih, dan mudah digunakan untuk preparasi cepat sampel C. elegans.

Preparasi Ultrasonik Sampel C. elegans

Caenorhabditis elegans merupakan cacing gilig yang banyak digunakan di laboratorium penelitian untuk mempelajari genomika, biologi perkembangan, dan penyakit. Banyak gen dalam genom C. elegans memiliki padanan fungsional pada manusia. Oleh karena itu, cacing nematoda ini merupakan model yang sangat berguna untuk penyakit manusia. Keunggulan lain yang mendukung penggunaan C. elegans secara luas adalah pembiakannya yang mudah dan murah pada cawan yang mengandung bakteri (misalnya, E. coli), transparansinya, kemudahan penanganannya, serta kemungkinan untuk membekukan dan menyimpan cacing dalam jangka waktu yang lebih lama.
Analisis protein dan lipid merupakan prosedur rutin di laboratorium, dan preparasi sampel ultrasonik merupakan metode yang telah mapan untuk melisis nematoda C. elegans pada setiap tahap perkembangan (yaitu embrio, larva L1-L4, dan dewasa). Karena C. elegans juga digunakan sebagai sistem ekspresi protein untuk mengekspresikan protein target secara berlebih, diperlukan metode lisis dan ekstraksi protein yang andal dan dapat direproduksi serta menghasilkan rendemen protein yang tinggi. Sistem disrupsi sel dan ekstraksi ultrasonik tersedia dalam bentuk homogenizer tipe probe dan sonikator multisampel. Untuk memenuhi kebutuhan preparasi sampel yang praktis serta berbagai ukuran dan jumlah sampel, Hielscher Ultrasonics menyediakan perangkat disrupsi sel ultrasonik yang ideal untuk prosedur laboratorium Anda.

Protokol Ultrasonik untuk Disrupsi dan Lisis C. Elegans

Homogenisasi dan lisis ultrasonik C. elegans serta ekstraksi protein dan lipid selanjutnya dapat dilakukan dengan beragam prosedur menggunakan berbagai bufer homogenisasi dan lisis, dan sebagainya. Semua protokol lisis memiliki satu kesamaan, yaitu sampel harus terus dijaga di atas es untuk mencegah degradasi protein. Di bawah ini, kami menyajikan beberapa protokol lisis dan ekstraksi ultrasonik yang andal dan cepat untuk preparasi sampel C. elegans berkualitas tinggi yang mengandung protein atau lipid.

Keunggulan Lisis Ultrasonik C. elegans

• andal
• dapat direproduksi
• suhu dikendalikan secara presisi
• pengendalian proses yang andal
• metode yang lembut
• mudah diterapkan
• aman

Ekstraksi Protein Ultrasonik dari Sampel C. elegans

Lisis ultrasonik dan ekstraksi protein cacing C. elegans dapat dilakukan menggunakan berbagai protokol. Di bawah ini kami menyajikan beberapa protokol lisis yang andal dan cepat untuk hasil ekstraksi protein yang dapat direproduksi.

Preparasi Cepat Ekstrak Sitosolik dari Cacing C. elegans melalui Sonikasi

Dengan protokol berikut, Anda dapat menyiapkan lisat C. elegans dalam waktu kurang dari 30 menit.
Pengumpulan C. elegans
Pindahkan cacing C. elegans yang diinginkan ke dalam tabung 1,5ml berisi larutan garam berbufer fosfat (PBS), atau bilas cacing dari cawan dengan 1,5ml PBS. Sentrifugasi selama 1min pada 2000rpm untuk membentuk pelet. Jaga sampel tetap di atas es sepanjang waktu.
Kemudian, cuci cacing dua kali dengan PBS.
Setelah itu, cuci cacing dua kali dengan ddH₂O.
Suspensikan kembali cacing dalam setidaknya 500ul bufer homogenisasi (HB). Sampel cacing kini siap untuk lisis ultrasonik.
Untuk memperoleh ekstrak protein berkualitas lebih tinggi, Anda dapat mengurangi kontaminasi bakteri dengan mencuci cacing masing-masing selama 5min dalam PBS dan air ultramurni steril (ddH₂O), atau melakukan flotasi sukrosa. Jaga sampel cacing terus berada di atas es.

Protokol Lisis Ultrasonik C. elegans

• Pastikan Anda menyiapkan sonikator terlebih dahulu agar homogenizer ultrasonik siap digunakan (probe terpasang, program sonikasi telah diatur sebelumnya). 

Jika sonikator Anda dipasang pada statif, tempatkan penangas es berisi tabung sampel di bawah probe ultrasonik dan masukkan probe ultrasonik ke dalam tabung 1,5ml.

• Untuk lisis C. elegans dengan UP200St atau UP200Ht, sonikasi harus dilakukan menggunakan ujung mikro (misalnya, probe S26d2 berukuran 2mm; lihat gambar di sebelah kiri) pada amplitudo 40% selama 1sec dengan jeda 30sec di antaranya. Sebanyak 5 siklus sonikasi, masing-masing selama 1 detik dengan jeda 30sec, ideal untuk lisis C. elegans. Jika Anda melakukan lisis untuk pertama kalinya, Anda dapat memeriksa perkembangan lisis pada alikuot kecil sampel setelah setiap pulsa menggunakan mikroskop.
• Lisis berhasil diselesaikan ketika cacing telah mengalami disrupsi. Sonikasi berlebihan mengakibatkan pecahnya inti sel dan terlihat ketika sampel menjadi kental atau berbusa. Untuk mencegah degradasi sampel, gunakan lebih banyak pulsa jika diperlukan. Jangan menambah durasi setiap siklus pulsa ultrasonik agar diperoleh ekstrak protein berkualitas tinggi.
• Jernihkan lisat sel dengan menyentrifugasi cacing yang telah dilisis secara ultrasonik pada 14.000rpm selama 10min pada 4ºC.
• Kemudian, pindahkan supernatan ke tabung baru dan siapkan untuk imunopresipitasi atau uji lainnya.

Catatan untuk bufer homogenisasi: Siapkan bufer homogenisasi untuk protokol lisis ultrasonik di atas sebagai berikut:

Lisis C. elegans dengan Kapasitas Pemrosesan Sampel yang Tinggi dalam Pelat 96 Sumur menggunakan Sonikator Pelat UIP400MTP

Lisis C. elegans (nematoda dewasa)
UIP400MTP amplitudo 80%, 20 siklus (setiap siklus sonikasi: 30 sec AKTIF, 30 sec NONAKTIF)
Bufer lisis:

• Opsi 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opsi 2) untuk koimunopresipitasi (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktail inhibitor proteinase Complete)

Fragmentasi DNA dengan Kapasitas Pemrosesan Sampel yang Tinggi
DNA C. elegans (nematoda dewasa) 200–300bp: sonikator pelat UIP400MTP – atur amplitudo 80%, 30 pulsa – masing-masing 30sec aktif, 30sec nonaktif

Sonikator Pelat UIP400MTP untuk preparasi dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi meny sonikasi sampel secara seragam dalam pelat multisumur, pelat mikrotiter, dan pelat 96 sumur

Lisis Ultrasonik C. elegans untuk Uji Pemurnian Afinitas Kuantitatif

Embrio C. elegans (∼2 juta per replikasi) dipanen segar dalam tiga replikasi biologis dengan perlakuan pemutih pada hermafrodit muda yang mengandung telur dan disonikasi di atas es (siklus: 0,5 s, amplitudo: 40–45%, 5 pulsa/sesi, 5 sesi, interval antarsesi: 30 s; prosesor ultrasonik UP200S dengan ujung mikro S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) dalam bufer lisis (volume total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% gliserol, campuran inhibitor protease, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Setelah sonikasi, Nonidet P-40 Substitute ditambahkan hingga 1%, dan lisat diinkubasi dengan rotasi ujung-ke-ujung pada 4°C selama 30 min, diikuti dengan sentrifugasi pada 20.000 × g selama 20 min pada 4°C. Lisat yang telah dijernihkan kemudian diaspirasi tanpa mengganggu lapisan lipid atas dan dibagi menjadi dua bagian, masing-masing dimasukkan ke manik agarosa anti-GFP atau manik kontrol yang telah diblokir (40–50 μl). Setelah rotasi ujung-ke-ujung pada 4°C selama 60–90 min, manik dicuci sekali dengan bufer lisis yang mengandung 0,1% Nonidet P-40 Substitute, diikuti dengan pencucian dua kali dalam bufer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) atau bufer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) atau keduanya. Untuk uji pull-down GFP:MBK-2, dilakukan dua eksperimen terpisah menggunakan kondisi pencucian yang berbeda. Protein dielusi dengan pengocokan orbital dalam 50 μl larutan 6 m urea/2 M tiourea pada suhu ruang. Untuk eksperimen pull-down MBK-1::GFP, protein dielusi dua kali dengan pengocokan dalam 50μl larutan 8 m guanidinium klorida pada 90°C, diikuti dengan presipitasi etanol. Sampel protein yang telah dielusi kemudian didigesti dalam larutan.
(bdk. Chen et al., 2016)

Homogenisasi dan Lisis Ultrasonik Cacing

Untuk prosedur lisis dan ekstraksi protein C.elegans, 30.000 nematoda pada tahap yang relevan dikumpulkan per sampel dan dicuci dalam S-basal sedingin es, dipekatkan dengan sentrifugasi pada 1500 rpm selama 2 min., dicuci enam kali dengan S-basal sedingin es untuk menghilangkan sisa bakteri, lalu disimpan di atas es hingga siap digunakan. Untuk ekstraksi protein, cacing dewasa yang mengandung telur dibiarkan membentuk pelet padat setelah pencucian S-basal terakhir. Pelet cacing kemudian disuspensikan kembali dalam 1 ml Bufer Ekstraksi sedingin es [20 mM kalium fosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitor protease (Sigma P2714)] dan segera diproses.
∼30.000 cacing dewasa yang mengandung telur (setara dengan ∼100 mg berat basah) disonikasi di atas es menggunakan sonikator tipe probe (misalnya UP50H dengan ujung mikro MS2) pada amplitudo 40% selama 10 siklus, masing-masing 3 sec aktif dan 30 sec nonaktif, dalam 1 ml bufer ekstraksi sedingin es. (bdk. Baskharan et al. 2012)

Ekstraksi Lipid Ultrasonik dari C. elegans

Dalam lipidomika, salah satu cabang metabolomika, keseluruhan lipid dalam sistem biologis dikarakterisasi dan dianalisis. C. elegans banyak digunakan dalam lipidomika untuk mempelajari interaksi lipid metabolik serta pengaruhnya terhadap kesehatan dan masa hidup.
Lisis dan ekstraksi ultrasonik digunakan untuk melepaskan lipid seperti sfingolipid dari embrio, larva, dan cacing dewasa C. elegans. Sonikasi digunakan untuk menyiapkan homogenat cacing dan kemudian mengekstraksi lipid dari sampel.
Protokol Ekstraksi Lipid Ultrasonik dari C. elegans
Cairkan pelet C. elegans di atas es dan suspensikan kembali dengan 0,5 ml ultrawater. Sonikasi sampel C. elegans dalam tabung reaksi 1,5mL, sambil terus menjaga sampel di atas es.
Sonikasi dapat dilakukan menggunakan sonikator tipe probe seperti UP200Ht, unit preparasi sampel ultrasonik VialTweeter (sonikasi 10 sampel secara simultan) atau UIP400MTP (untuk sonikasi pelat multisumur seperti pelat 96 sumur). Untuk lisis ultrasonik dengan UP200Ht, gunakan ujung mikro S26d2. Atur terlebih dahulu mode siklus ultrasonik pada menu digital. Atur amplitudo ke 10% dan mode siklus sonikasi berupa pulsa 2 sec sebanyak 20 siklus dengan jeda 30 sec. di antara setiap semburan pulsa ultrasonik.
Pindahkan supernatan ke tabung kaca bertutup ulir. Lakukan ekstraksi Folch dengan menambahkan 1 ml ultrawater ke setiap tabung kaca, diikuti dengan penambahan 6 ml campuran kloroform/metanol (rasio = 2:1) ke setiap tabung kaca.
Vorteks setiap tabung kaca selama 30 sec sebanyak 4 kali. Sentrifugasi tabung pada 1.258 x g selama 15 min (Eppendorf, 5810 R) untuk lebih meningkatkan pemisahan fase. Pindahkan fraksi hidrofobik bawah ke tabung kaca bersih menggunakan pipet Pasteur kaca. Keringkan fraksi hidrofobik bawah di bawah aliran nitrogen dalam evaporator nitrogen. Simpan pelet yang telah dikeringkan dalam freezer -80 °C hingga digunakan. 


Preparasi Ultrasonik Lisat Cacing

Lisat cacing: Cacing tahap L4 dipanen dan dicuci tiga kali dengan bufer M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl, dan 0,87 mM MgSO₄) untuk menghilangkan seluruh bakteri. Setelah membuang bufer M9 sebanyak mungkin, cacing disuspensikan kembali dalam bufer lisis: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-gliserol fosfat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrium fluorida, 1 mM natrium ortovanadat, 5 mM natrium pirofosfat, 0,2 mM fenilmetanasulfonilfluorida dan inhibitor protease. Cacing dibekukan dalam nitrogen cair dan dicairkan pada 37°C sebanyak tiga kali, kemudian cacing disonikasi di atas es kering dengan unit ultrasonik VialTweeter untuk preparasi 10 tabung sampel secara simultan. Sonikasi dilakukan pada amplitudo 50% dalam 10 siklus selama 2 sec. dengan jeda 30 sec di antara semburan sonikasi. Setelah itu, sampel disentrifugasi pada 12.000 rpm pada 4°C selama 15 min. Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada -70°C. Satu alikuot digunakan untuk kuantifikasi protein melalui uji Bradford.
Penetapan glutation total, GSH, dan GSSG: Untuk kuantifikasi glutation, pembuatan lisat dan penetapan dilakukan pada hari yang sama. Larva L4 yang diberi glukosa dan larva kontrol dipanen dan dicuci dengan bufer M9 tiga kali. Setelah membuang bufer M9 sebanyak mungkin, cacing disuspensikan kembali dalam asam metafosfat sedingin es (5% w/v), kemudian cacing disonikasi dalam es dengan VialTweeter ultrasonik pada amplitudo 50% dalam sepuluh siklus sonikasi selama 2 sec. dengan jeda 30 sec. di antara setiap siklus. Setelah itu, disentrifugasi pada 12.000 rpm pada 4 ̊C selama 15 min.
(bdk. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparasi Sampel C. elegans sebelum Imunopresipitasi dan Western Blotting

Secara singkat, untuk ekstrak embrio, larva L1 C. elegans ditumbuhkan dalam kultur medium S cair berskala besar hingga dewasa. Embrio dikumpulkan menggunakan metode pemutih standar dan disuspensikan dalam bufer lisis (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% gliserol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Koktail Inhibitor Protease, dan 1􏰅 Koktail Inhibitor Fosfatase I dan II), dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cair, dan dilisis melalui disrupsi sel ultrasonik menggunakan sonikator dengan ujung mikro seperti UP200Ht dengan S26d2 sebanyak 10 pulsa selama 10 s pada amplitudo 30%. Jika jumlah sampel yang harus disiapkan lebih banyak, disarankan menggunakan perangkat ultrasonik VialTweeter atau sonikator multisampel UIP400MTP untuk pelat sumur. Setelah sonikasi, ekstrak dijernihkan terlebih dahulu dengan sentrifugasi pada 30.000g selama 20 min pada 4°C. Ekstrak yang telah dijernihkan (300µg protein total) diinkubasi dengan 40µ􏰂g antibodi anti-CDC-25.1 yang dimurnikan berdasarkan afinitas (penelitian ini) dan diikat silang dengan protein A-agarosa, atau sebagai kontrol digunakan imunoglobulin (Ig)G kelinci dalam jumlah serupa yang diikat silang dengan protein A-agarosa, dalam volume total 200µl bufer lisis yang mengandung 1% NP-40, yang penambahannya mengurangi pengikatan nonspesifik protein pada matriks. Sampel diputar selama 1 h pada 4°C, manik dicuci tiga kali dengan bufer lisis, dan dielusi dengan 30µl glisin/HCl dan 200 mM NaCl, pH 2,2. Setelah imunopresipitasi, eluat diencerkan dalam 30µ􏰂l bufer sampel SDS, dipanaskan hingga 95°C selama 4 min, dan biasanya 3% dari total untuk input serta 30% untuk eluat diaplikasikan pada SDS-PAGE, diikuti dengan Western blotting menggunakan antibodi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500), atau anti-􏰁β-actin (1:2000). Jika ekstrak tidak menjalani imunopresipitasi, protein total dalam jumlah yang sama yang berasal dari ekstrak tersebut disuspensikan kembali dalam bufer sampel SDS, dipanaskan hingga 95°C, kemudian langsung diaplikasikan pada SDS-PAGE dan dianalisis melalui Western blotting. (bdk. Segref et al. 2020)

Lisis Ultrasonik dengan Pengendalian Suhu yang Presisi

Pengendalian suhu yang presisi dan andal sangat penting saat menangani sampel biologis. Suhu tinggi memicu degradasi protein akibat panas dalam sampel.
Seperti semua teknik preparasi sampel mekanis, sonikasi menghasilkan panas. Namun, suhu sampel dapat dikendalikan dengan baik ketika menggunakan VialTweeter. Kami menyajikan berbagai opsi untuk memantau dan mengendalikan suhu sampel Anda saat menyiapkannya dengan VialTweeter dan VialPress untuk analisis.

1. Pemantauan suhu sampel: Prosesor ultrasonik UP200St, yang menggerakkan VialTweeter, dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dicolokkan. Hubungkan sensor suhu ke UP200St dan masukkan ujung sensor suhu ke salah satu tabung sampel. Melalui layar sentuh digital berwarna, Anda dapat menetapkan rentang suhu tertentu untuk sonikasi sampel Anda pada menu UP200St. Sonikator akan berhenti secara otomatis ketika suhu maksimum tercapai dan menjeda hingga suhu sampel turun ke nilai bawah dari ∆ suhu yang telah diatur. Kemudian sonikasi dimulai kembali secara otomatis. Fitur cerdas ini mencegah degradasi akibat panas.
2. Blok VialTweeter dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium terlebih dahulu, sehingga membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
3. Gunakan es kering untuk pendinginan selama sonikasi. Gunakan baki dangkal yang diisi dengan es kering dan letakkan VialTweeter di atas es kering agar panas dapat cepat terdisipasi.

Temukan Perangkat Disrupsi Sel Ultrasonik yang Optimal untuk Aplikasi Lisis Anda

Hielscher Ultrasonics merupakan produsen berpengalaman panjang dalam pembuatan perangkat disrupsi sel dan homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk laboratorium, sistem di atas meja, dan sistem skala industri. Ukuran kultur sel bakteri Anda, tujuan penelitian atau produksi Anda, serta volume sel yang akan diproses per jam atau per hari merupakan faktor penting untuk menemukan perangkat disrupsi sel ultrasonik yang tepat bagi aplikasi Anda.
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk sonikasi multisampel secara simultan (hingga 10 vial) maupun sampel dalam jumlah besar (yaitu pelat mikrotiter / pelat 96 sumur), sonikator laboratorium klasik tipe probe dengan berbagai tingkat daya dari 50 hingga 400 watt, hingga prosesor ultrasonik yang sepenuhnya dirancang untuk industri dengan daya hingga 16.000watt per unit untuk disrupsi sel komersial dan ekstraksi protein dalam produksi skala besar. Semua sonikator Hielscher dibuat untuk pengoperasian 24/7/365 pada beban penuh. Ketangguhan dan keandalan merupakan fitur utama perangkat ultrasonik kami.
Semua homogenizer ultrasonik digital dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas, layar sentuh berwarna, dan pencatatan data otomatis, yang menjadikan perangkat ultrasonik sebagai alat kerja yang praktis di laboratorium dan fasilitas produksi.
Beri tahu kami jenis sel, volume, frekuensi pemrosesan, serta target pemrosesan sampel biologis Anda. Kami akan merekomendasikan perangkat disrupsi sel ultrasonik yang paling sesuai dengan kebutuhan proses Anda.

Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami, mulai dari homogenizer genggam ringkas dan sonikator multisampel hingga prosesor ultrasonik industri untuk aplikasi komersial: