Teknologi ultrasound Hielscher

Ultrasonic Lisis E. Coli

  • E. bakteri coli adalah bakteri yang paling umum digunakan dalam mikrobiologi dan bioteknologi.
  • pengganggu sel ultrasonik memberikan hasil yang handal dan direproduksi untuk lisis E. coli.
  • kavitasi dan geser pasukan intens namun justru dikontrol mengakibatkan gangguan lengkap dan hasil ekstraksi yang tinggi (misalnya protein, DNA).

Sel Gangguan oleh Cavitation

bakteri Escherichia coli yang andal segaris menggunakan homogenizers jaringan ultrasonik.Ultrasonic probe-jenis pengaduk mekanik beroperasi dengan approx. 20.000 siklus per detik (pada 20kHz) dan menyebabkan kavitasi dalam cairan atau supsensions. kavitasi daerah mikroskopis akustik dari tekanan vakum-seperti dan suhu tinggi yang merobek sel terpisah. Meskipun suhu dapat mencapai beberapa ribu derajat Celcius, volume kavitasi begitu kecil mereka tidak panas proses secara signifikan. USG yang dihasilkan kavitasi akustik dan gaya geser melubangi atau menghancurkan membran sel E.coli – tergantung pada pengaturan perangkat dari homogenizer ultrasonik.

Keuntungan dari Ultrasonic Lisis

  • kontrol yang tepat dari lisis (intensitas, amplitudo, suhu)
  • adaptasi yang optimal untuk sampel tertentu
  • pengatur suhu
  • untuk sampel yang sangat besar sangat kecil (uL ke liter)
  • perlakuan mekanik murni
  • linear skala-up dari laboratorium ke produksi
Perangkat Ultrasonik VialTweeter memungkinkan untuk preparasi sample simultan hingga 10 botol di bawah kondisi proses yang sama. (Klik untuk memperbesar!)

VialTweeter untuk lisis ultrasonik

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Sementara kimia dan enzymtic lisis dapat bermasalah – karena lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan memperkenalkan masalah pemurnian dan lisis enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang panjang dan tidak direproduksi – gangguan ultrasonik adalah, sel cepat metode gangguan canggih.
Ultrasonic lysis didasarkan pada kekuatan mekanik saja. Tidak ada bahan kimia yang ditambahkan, sonikasi merusak dinding sel dengan gaya geser. Lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan memperkenalkan masalah pemurnian. Gangguan enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi. Gangguan sel ultrasonik sel bakteri E.coli cepat, sederhana, dapat diandalkan dan dapat direproduksi. Itu sebabnya ultrasonikator Hielscher digunakan di laboratorium biologi dan biokimia di seluruh dunia untuk persiapan sampel, pra-ananlytics, diagonstik in-vitro dan alat tes manifold.

Rekomendasi Umum

UP400St Ultrasonikator dengan reaktor aliranSonication adalah teknik yang paling populer untuk melisiskan jumlah yang sangat kecil, menengah dan besar suspensi sel – dari pico-liter sampai dengan 100L / jam (menggunakan sel aliran ultrasonik). Sel segaris oleh geser cair dan kavitasi. DNA juga dicukur selama sonikasi, sehingga tidak perlu menambahkan DNase ke suspensi sel.
Pengatur suhu:
Dengan pra-pendinginan sampel dan menjaga sampel selama sonikasi di atas es, sampel degradasi termal dari sampel dapat dengan mudah dicegah.
Idealnya, sampel harus disimpan es-dingin selama Lisis, tetapi untuk sebagian besar sampel itu cukup jika suhu tidak naik di atas suhu budaya atau sumber jaringan. Oleh karena itu dianjurkan, untuk menjaga suspensi pada es dan sonicate dengan beberapa pulsa ultrasonik pendek 5-10 SEC dan jeda dari 10-30 Sec. Selama jeda, panas dapat menghilang dalam rangka untuk membangun kembali suhu rendah. Untuk sampel sel yang lebih besar, berbagai aliran reaktor sel dengan jaket pendingin yang tersedia.

Protokol untuk Persiapan E. Coli Lysates

analisis ekspresi dan pemurnian protein rekombinan

E. coli pelet disonikasi dengan sistem ultrasonik UP100H (Hielscher). Untuk tujuan ini, pelet sel disuspensikan kembali ke dalam buffer lisis dingin (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dan didinginkan di atas es selama 10 menit. Kemudian suspensi sel disiram dengan 10 semburan pendek 10 s diikuti oleh interval 30 detik untuk pendinginan. Akhirnya, puing-puing sel dipindahkan dengan ultrasentrifugasi pada suhu 4 ° C selama 15 menit pada 14000 rpm. Untuk konfirmasi ekspresi rPR, supernatan dijalankan pada gel poliakrilamida 12% dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan Western blotting. Pemurnian rPR dilakukan dengan menggunakan Ni2 +-NTA resin (Invitrogen, USA) sesuai dengan panduan produsen. Dalam tahap ini, metode pemurnian asli digunakan. Kemurnian protein dimurnikan dinilai menggunakan elektroforesis pada gel poliakrilamid 12% dan selanjutnya Coomassie pewarnaan biru. konsentrasi protein dimurnikan diukur dengan Micro BCA uji protein kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrasonic disruptor sel UP100H (100W) untuk lisis, gangguan sel dan geser DNA.

ultrasonic homogenizer UP100H 100W

Pertumbuhan sel, Pengikatan Silang dan Penyusunan E. Ekstrak coli sel

Untuk SeqA dan RNA polimerase CHIP-Chip E. coli MG1655 atau MG1655 ΔseqA ditumbuhkan pada suhu 37 ° C ke OD600 sekitar 0,15 dalam LB 50 ml (+ 0,2% glukosa) sebelum 27 μl formaldehid (37%) per ml ditambahkan (konsentrasi akhir 1%). Crosslinking dilakukan pada pengocokan lambat (100 rpm) pada suhu kamar selama 20 menit diikuti oleh pendinginan dengan 10 ml glycine 2,5 M (konsentrasi akhir 0,5 M). Untuk percobaan sengatan panas, E. coli MG1655 ditanam pada media LB 65 ml pada suhu 30 ° C sampai OD600 sekitar 0,3. Selanjutnya 30 ml kultur dipindahkan ke labu yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 43 ° C dan sisanya disimpan pada suhu 30 ° C. Crosslinking dan quenching seperti yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa sel dijaga pada suhu 30 atau 43 ° C selama 5 menit sebelum terjadi pelan lebih lambat pada suhu kamar. Sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan TBS yang dingin (pH7.5). Setelah resuspensi dalam buffer lisis 1 ml (10 mM Tris (pH 8,0), sukrosa 20%, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 lysozyme 10 mg / ml) dan inkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit diikuti penambahan 4 ml IP penyangga, sel disonikasi di atas es dengan 12 kali 30 detik dan 30 detik istirahat pada a UP400St ultrasonik prosesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) dengan daya 100%. Setelah sentrifugasi selama 10 menit pada 9000 g, 800 aliquotes ml supernatan disimpan pada -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Kelebihan dan pemurnian enzim.

Untuk kelebihan decahistidine (His10) protein -tagged, E. coli BL21 (DE3) berubah dengan pET19b konstruksi. Sebuah prakultur semalam dipanen dengan sentrifugasi, dan 1% digunakan untuk menyuntik budaya ekspresi. Sel membawa pET19mgtB ditumbuhkan pada 22 ° C sampai densitas optik pada 600 nm (OD600) Dari 0,7. budaya dipindahkan ke 17 ° C dan diinduksi oleh 100 pM IPTG. Setelah 16 jam, budaya dipanen dengan sentrifugasi pada 7500 × g pada 4 ° C. Sel disuspensi kembali dalam 50 mM phosphate-buffered saline (PBS) dengan 0,3 M NaCl pada pH 7.4 dan terganggu oleh ultrasonication dengan S2 mikro-tip sonotrode di UP200St Ultrasonikator (Hielscher, Teltow, Jerman) pada siklus 0,5 dan amplitudo 75%.
Kelebihan produksi decahistidine-tag GtfC diinduksi pada suhu 37 ° C pada OD600 0,6 dengan 100 pM IPTG. Sel-sel kemudian diinkubasi selama 4 jam, dipanen, dan segaris seperti yang dinyatakan di atas untuk MgtB.
ekstrak sel mentah disentrifugasi pada 15.000 × g dan 4 ° C sedimen puing-puing sel. Ekstrak diklarifikasi dimuat pada 1-ml HisTrap FF kolom mentah menggunakan sistem ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzim dimurnikan sesuai dengan protokol produsen untuk elusi gradien protein Nya-tag. solusi protein dielusi yang didialisis dua kali terhadap 1.000 volume 50 mM PBS, pH 7,4, dengan 0,3 M NaCl pada suhu 4 ° C. Pemurnian dianalisis dengan 12% SDS-PAGE. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Jerman). (Rabausch et al. 2013)

Ekstraksi Protein dari E. coli Bakteri
Sebuah protein umpan yang menarik (dalam hal ini, MTV1 dari Arabidopsis thaliana) menyatu dengan tag GST dan dinyatakan dalam BL21 Escherichia coli (E. coli) sel.
1. Ambil satu pelet dari GST-MTV1 dan GST (sesuai dengan 50 ml kultur bakteri) dan resuspend masing-masing dalam 2,5 mL es ekstraksi dingin penyangga.
2. Gunakan Ultrasonikator UP100H (Dilengkapi dengan MS3 microtip-sonotrode untuk volume kecil (2-5mL)) untuk mengganggu sel-sel bakteri sampai mereka segaris, yang ditandai dengan dikurangi opacity dan peningkatan viskositas. Ini harus dilakukan di atas es, dan dianjurkan untuk sonicate dalam interval (misalnya 10 detik sonicating diikuti oleh 10 detik di atas es dan sebagainya). Perawatan harus diambil untuk tidak sonicate dengan intensitas terlalu tinggi. Jika berbusa atau pembentukan endapan putih terdeteksi, intensitas perlu diturunkan.
3. Transfer Solusi bakteri yang segaris 1,5 tabung microcentrifuge mL dan centrifuge pada 4 ° C, 16.000 x g selama 20 menit.

Protein allicin yang dimodifikasi dalam E. coli

VialTweeter adalah ultrasonicator nyaman untuk homogenisasi sampel kecilPenentuan Isi sulfhidril oleh 5,5'-Dithiobis (asam 2-nitrobenzoic) (DTNB) Assay
Budaya semalam E. coli MG1655 digunakan untuk menyuntik MOPS medium minimal (1: 100). Budaya itu tumbuh secara aerob sampai suatu A600 0,4 tercapai. budaya dibagi menjadi tiga budaya 15-ml untuk pengobatan stres. Budaya tidak diobati menjabat sebagai kontrol negatif. 0,79 mM allicin (128 mg ml-1) Atau 1 mM diamide ditambahkan ke salah satu dari dua budaya yang tersisa masing-masing. Kultur diinkubasi selama 15 menit. 5 ml masing-masing kultur dipanen dengan sentrifugasi (8525 × g, 4 ° C, 10 menit). Sel dicuci dua kali dengan 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, disimpan secara anaerob sebelum digunakan) dan disentrifugasi (13.000 x g, 4 ° C, 10 menit). Sel resuspended dalam buffer lisis (PBS dengan 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) sebelum gangguan pada suhu 4 ° C dengan ultrasonication (VialTweeter Ultrasonikator, Hielscher GmbH, Jerman) (3 × 1 menit). puing-puing sel pellet dengan sentrifugasi (13.000 × g, 4 ° C, 15 menit). supernatan dipindahkan ke 3,5-ml QS-makro kuvet (10 mm) dengan batang pengaduk magnet dan dicampur dengan 1 ml buffer lisis. Kepunahan sampel dipantau di 412 nm dengan spektrofotometer Jasco V-650 dilengkapi dengan suhu yang dikendalikan pemegang sel PSC-718 (Jasco) pada suhu kamar. 100μl larutan 3 mM dithiobis (asam 2-nitrobenzoic) ditambahkan. Kepunahan dipantau sampai mencapai saturasi. Perhitungan konsentrasi thiol dilakukan dengan menggunakan ε koefisien kepunahan412 = 13.700 M-1 Cm-1 untuk tio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Konsentrasi thiol seluler yang dihitung berdasarkan volume sel E. coli dari 6,7 × 10-15 liter dan kepadatan sel A600 = 0,5 (setara dengan 1 × 108. sel ml-1 budaya). (Müller et al. 2016)

Dalam Vivo Glutathione Penentuan

E.coli MG1655 ditumbuhkan di MOPS medium minimal dalam volume total 200ml sampai A600 dari 0,5 tercapai. Kultur dipecah menjadi kultur 50 ml untuk pengobatan stres. Setelah 15 menit inkubasi dengan 0,79 mM allicin, 1 mM diamide, atau dimetil sulfoksida (kontrol), sel dipanen pada 4.000 g pada suhu 4 ° C selama 10 menit. Sel dicuci dua kali dengan penyangga KPE sebelum resuspensi pelet pada 700μl penyangga KPE. Untuk deproteinasi, 300l dari 10% (b / v) asam sulfosalisiklik ditambahkan sebelum gangguan sel melalui ultrasonication (3 x 1 menit; VialTweeter Ultrasonikator). Supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi (30 menit, 13,000g, 4 ° C). konsentrasi asam Sulfosalicylic yang menurun menjadi 1% dengan penambahan 3 volume KPE penyangga. Pengukuran total glutathione dan GSSG dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Konsentrasi glutathione seluler yang dihitung berdasarkan volume E. coli sel dari 6,7×10-15 liter dan kepadatan sel A600 00,5 (setara dengan 1×108. sel ml-1 budaya). konsentrasi GSH dihitung dengan pengurangan 2 [GSSG] dari jumlah glutathione. (Müller et al. 2016)

disruptor ultrasonik untuk lisis sel dan ekstraksi bahan biologis (Klik untuk memperbesar!)

Probe-jenis ultrasonicator UP400St

Ekspresi Manusia mAspAT di E. coli

Ultrasonic disruptor sel UP400St (400W) untuk ekstraksi materi intraseluler (misalnya protein, organel, DNA, RNA dll)Single koloni E. coli BL21 (DE3) menyembunyikan vektor ekspresi dalam 30 mL Luria-Bertani (LB) medium yang mengandung 100μg / mL ampisilin, dan kemudian dibudidayakan di 37ºC sampai kepadatan optik (OD600) Mencapai 0,6. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 4000 × g selama 10 menit, dan diresuspensi dalam 3L media LB segar mengandung 100μg / mL ampisilin.
Selanjutnya, ekspresi protein diinduksi dengan 1 mM isopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) selama 20 jam pada 16ºC. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 8000 × g selama 15 menit dan dicuci dengan penyangga A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Didekati 45g (berat basah) sel diperoleh dari 3 budaya L. Setelah sentrifugasi, pelet sel diresuspensi dalam 40 mL (untuk 1 L budaya) dingin buffer ekstraksi A, dan segaris dengan ultrasonication pada suhu dingin menggunakan UP400St Instrumen (Dr. Hielscher GmbH, Jerman). The lisis sel disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan larut (supernatan) dan diendapkan (pelet) fraksi. (Jiang et al. 2015)

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami:

Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
0.5 untuk 1.5mL n.a. VialTweeter
1 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.1 hingga 20L 0.2 sampai 4L/min UIP2000hdT
10 sampai 100L 2-10L/min UIP4000
n.a. 10 sampai 100L/menit UIP16000
n.a. kristal yang lebbig cluster UIP16000

Hubungi Kami! / Tanya Kami!

Silakan gunakan formulir di bawah ini, jika Anda ingin meminta informasi tambahan tentang ultrasonik homogenisasi. Kami akan sangat senang untuk menawarkan Anda sebuah sistem ultrasonik yang memenuhi persyaratan.









Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


Literatur / Referensi



Fakta-fakta yang Patut Diketahui

E. Koli

Escherichia coli (E. coli) adalah gram-negatif, fakultatif anaerobik, berbentuk batang, bakteri coliform dari genus Escherichia yang umum ditemukan di usus bawah organisme berdarah panas (endoterm). Ada sejumlah besar strain E. coli (atau subtipe) dengan beragam karakteristik. Kebanyakan strain E. coli tidak berbahaya bagi manusia, misalnya strain B dan K-12 yang biasa digunakan untuk aplikasi penelitian di laboratorium. Namun, beberapa strain berbahaya dan bisa menyebabkan penyakit serius.
E. coli memainkan peran penting dalam rekayasa biologi modern dan mikrobiologi industri karena bakteri mudah untuk memanipulasi. aplikasi laboratorium umum yang melibatkan sering menggunakan E. coli, misalnya untuk membuat asam deoksiribonukleat rekombinan (DNA) atau untuk bertindak sebagai model organisme.
E. coli adalah tuan rumah yang sangat serbaguna untuk produksi protein heterolog, dan sistem ekspresi protein berjenis tersedia untuk memproduksi protein rekombinan dalam E. coli. Menggunakan plasmid yang memungkinkan ekspresi tingkat tinggi protein, gen dapat diperkenalkan ke dalam bakteri, yang memungkinkan untuk memproduksi protein tersebut dalam jumlah yang tinggi dalam proses fermentasi industri.
E.coli digunakan sebagai pabrik sel untuk memproduksi insulin. aplikasi lebih lanjut termasuk penggunaan dimodifikasi sel E. coli untuk mengembangkan dan memproduksi vaksin dan enzim amobil, untuk memproduksi biofuel, serta untuk bioremediasi.
Strain K-12 adalah bentuk mutan E. coli yang over-mengekspresikan enzim Alkaline Phosphatase (ALP). Mutasi ini terjadi karena cacat pada gen yang terus-menerus kode untuk enzim. Jika gen menghasilkan produk tanpa hambatan apa pun ini dikenal sebagai aktivitas konstitutif. mutan spesifik ini digunakan untuk isolasi dan pemurnian enzim ALP.

Ultrasonic DNA Shearing

gaya geser ultrasonik adalah metode yang umum digunakan untuk memisahkan dari sel dan istirahat untai DNA menjadi potongan-potongan. kavitasi akustik istirahat dinding sel dan membran untuk mengekstrak DNA dari sel-sel dan menghasilkan fragmen dari sekitar 600 – 800 bp panjang, yang sangat ideal untuk analisis.
Klik di sini untuk mempelajari lebih lanjut tentang homogenizers ultrasonik untuk fragmentasi DNA!