Hielscher Ultrasonics
Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda.
Hubungi kami: +49 3328 437-420
Kirimkan email kepada kami: info@hielscher.com

Ultrasonic Lisis E. Coli

  • Bakteri E. adalah bakteri yang paling umum digunakan dalam mikrobiologi dan bioteknologi.
  • Pengganggu sel ultrasonik memberikan hasil yang andal dan dapat direproduksi untuk lisis E..
  • Kavitasi dan gaya geser yang intens namun dapat dikontrol secara tepat menghasilkan gangguan total dan hasil ekstraksi yang tinggi (misalnya protein, DNA).

Mengapa Gangguan Sel Ultrasonik E. Metode yang Disukai?

Homogenizer ultrasonik atau ultrasonicator tipe probe menawarkan beberapa keuntungan untuk lisis E. karena ultrasound intens secara efisien mengganggu dinding dan membran sel. Ultrasonicators tipe probe banyak digunakan untuk lisis E. karena alasan berikut:

  • Gangguan dinding sel yang efisien: E. memiliki dinding sel semi-kaku yang terdiri dari peptidoglikan, yang sulit dipatahkan menggunakan metode lisis tradisional. Ultrasonicator tipe probe menghasilkan gelombang ultrasonik intens yang menciptakan gelembung kavitasi dalam cairan yang mengelilingi sel. Ketika gelembung ini runtuh, mereka menghasilkan jet cairan berkecepatan tinggi dan gelombang kejut yang mengakibatkan gangguan mekanis pada dinding sel, secara efektif melepaskan isi seluler seperti biomolekul.
  • Penetrasi yang ditingkatkan: Gelombang ultrasonik yang dihasilkan oleh probe / sonotrode dapat menembus jauh ke dalam sampel, mencapai jumlah sel E. yang lebih besar dan memperlakukannya secara merata. Ini membantu memastikan bahwa lisis lebih seragam di seluruh sampel, menghasilkan efisiensi gangguan sel yang lebih tinggi.
  • Mengurangi Waktu Pemrosesan: Energi yang dikirim oleh ultrasonicator tipe probe sangat terkonsentrasi dan terlokalisasi, yang mengarah pada lisis sel yang cepat dan efisien. Dibandingkan dengan metode lain seperti pemukulan manik-manik atau lisis enzimatik, sonikasi dapat mencapai lisis E. dalam hitungan menit atau bahkan detik. Sementara banyak teknik alternatif seperti pencairan beku memerlukan beberapa putaran perawatan, lisis ultrasonik membuka sel dalam satu langkah proses.
  • Kontrol Suhu: Ultrasonicators canggih dilengkapi dengan sensor suhu dan perangkat lunak pintar, yang memungkinkan untuk mengatur suhu proses maksimum. Ultrasonicator berhenti secara otomatis ketika batas suhu tercapai dan memulai proses sonikasi ketika titik suhu yang disetel tercapai. Mendinginkan sampel dalam penangas es adalah metode sederhana untuk menjaga suhu sampel tetap rendah dan mencegah degradasi sampel yang diinduksi panas.
  • Skalabilitas: Ultrasonicators tipe probe tersedia dalam berbagai ukuran, mulai dari perangkat genggam hingga model industri skala besar. Hal ini membuatnya cocok untuk memproses volume kecil di laboratorium atau meningkatkan skala untuk aplikasi biopemrosesan yang lebih besar, misalnya produksi vaksin atau bio-sintesis molekul.
  • Fleksibilitas: Ultrasonicators dapat digunakan untuk berbagai aplikasi di luar lisis sel, seperti geser DNA, ekstraksi protein, homogenisasi jaringan, dispersi nanopartikel, dan emulsifikasi. Oleh karena itu, berinvestasi dalam ultrasonicator tipe probe memberikan keserbagunaan dalam penelitian atau pengaturan industri.
  • Ultrasonicator tipe probe seperti UP200St adalah homogenizer jaringan dan penghancur sel yang andal, oleh karena itu banyak digunakan untuk persiapan sampel dalam genetika, misalnya, untuk lisis E.

    Ekstraksi protein dari sel E.dilakukan secara efisien dengan probe ultrasonik UP200St

    Ultrasonicator tipe probe menawarkan banyak keuntungan untuk lisis E.. Kontrol yang andal dan tepat atas parameter proses ultrasonik memungkinkan untuk mengoptimalkan parameter operasi seperti daya, durasi, dan penanganan sampel untuk mencapai hasil yang diinginkan.
     

    Permintaan Informasi




    Perhatikan Kebijakan Privasi.




     

    Tutorial ini menjelaskan jenis sonicator apa yang terbaik untuk tugas persiapan sampel Anda seperti lisis, gangguan sel, isolasi protein, fragmentasi DNA dan RNA di laboratorium, analisis, dan penelitian. Pilih jenis sonicator yang ideal untuk aplikasi Anda, volume sampel, jumlah sampel, dan throughput. Hielscher Ultrasonics memiliki homogenizer ultrasonik yang ideal untuk Anda!

    Cara Menemukan Sonicator yang Sempurna untuk Gangguan Sel dan Ekstraksi Protein dalam Sains dan Analisis

    Video Thumbnail

    Fragmentasi DNA ultrasonik sering digunakan sebagai langkah persiapan sampel dalam Next Generation Sequencing (NGS)

    Analisis elektroforesis DNA genom E. EDL933 mengalami ultrasonikasi 0 - 15 menit. L menunjukkan Tangga DNA.
    (studi dan gambar: ©Basselet et al. 2008)

    Gangguan Sel menggunakan Kavitasi Ultrasonik

    Homogenizer tipe probe ultrasonik beroperasi dengan sekitar 20.000 siklus per detik (pada 20kHz) dan menyebabkan kavitasi dalam cairan atau suspensi. Kavitasi akustik: area mikroskopis dari tekanan seperti vakum dan suhu tinggi yang merobek sel. Meskipun suhu dapat mencapai beberapa ribu derajat Celcius, volume kavitasi sangat kecil sehingga tidak memanaskan proses secara signifikan. Ultrasonografi menghasilkan kavitasi akustik dan gaya geser melubangi atau mematahkan membran sel sel bakteri seperti E.. Ultrasonicators Hielscher memungkinkan kontrol yang tepat atas parameter proses seperti intensitas ultrasonik, amplitudo, input energi, dan suhu. Dengan demikian, proses lisis ultrasonik dapat disesuaikan secara optimal dengan jenis sel, kultur sel, dan tujuan proses.
     

    Keuntungan dari Ultrasonic Lysis

    • Kontrol lisis yang tepat (intensitas, amplitudo, suhu)
    • Hasil yang andal dan dapat direproduksi
    • adaptasi optimal untuk sampel tertentu
    • kontrol suhu
    • untuk sampel yang sangat kecil hingga sangat besar (μL hingga liter)
    • Perawatan mekanis murni
    • pengoperasian yang ramah pengguna dan aman
    • Peningkatan linier dari laboratorium ke produksi
    Perangkat Ultrasonik VialTweeter memungkinkan untuk preparasi sample simultan hingga 10 botol di bawah kondisi proses yang sama. (Klik untuk memperbesar!)

    VialTweeter untuk lisis ultrasonik

    Permintaan Informasi




    Perhatikan Kebijakan Privasi.




    Homogenizer Ultrasonik vs Teknik Lisis Lainnya

    Sementara lisis kimia dan enzimatik bisa bermasalah – Karena lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan menimbulkan masalah pemurnian dan lisis enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi – Gangguan ultrasonik adalah metode gangguan sel yang canggih dan cepat.
    Lisis ultrasonik hanya didasarkan pada gaya mekanis. Tidak ada bahan kimia yang ditambahkan, sonikasi memecahkan dinding sel dengan gaya geser. Lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan menimbulkan masalah pemurnian. Gangguan enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi. Gangguan sel ultrasonik sel bakteri E.cepat, sederhana, andal, dan dapat direproduksi. Itulah sebabnya ultrasonicators Hielscher digunakan di laboratorium biologi dan biokimia di seluruh dunia untuk persiapan sampel, pra-ananlitik, diagonstik in-vitro dan uji manifold.

    Rekomendasi Umum untuk Lisis Ultrasonik

    Sonikasi adalah teknik paling populer untuk melisiskan suspensi sel dalam jumlah yang sangat kecil, sedang dan besar – dari pico-liter hingga 100L/jam (menggunakan sel aliran ultrasonik). Sel dilisis dengan geser cair dan kavitasi. DNA juga dicukur selama sonikasi, sehingga tidak perlu menambahkan DNase ke suspensi sel.
     

    Kontrol suhu selama lisis E.ultrasonik
    Pengganggu sel ultrasonik UP100H (100W) untuk gangguan sel dan ekstraksi senyawa tanaman.Dengan mendinginkan sampel terlebih dahulu dan menyimpan sampel selama sonikasi di atas es, degradasi termal sampel sampel dapat dengan mudah dicegah.
    Idealnya, sampel harus disimpan sedingin es selama lisis, tetapi untuk sebagian besar sampel sudah cukup jika suhu tidak naik di atas suhu kultur atau sumber jaringan. Oleh karena itu disarankan, untuk menjaga suspensi di atas es dan sonicate dengan beberapa pulsa ultrasonik pendek 5-10 detik dan jeda 10-30 detik. Selama jeda, panas dapat menghilang untuk membangun kembali suhu rendah. Untuk sampel sel yang lebih besar, tersedia berbagai reaktor sel aliran dengan jaket pendingin.
    Baca di sini tips dan rekomendasi terperinci untuk lisis ultrasonik yang sukses!

    Protokol untuk Persiapan Ultrasonik E. Lysates

    Para peneliti menggunakan homogenizer ultrasonik Hielscher untuk gangguan sel E.. Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol yang telah diuji dan terbukti untuk lisis E.menggunakan homogenizer ultrasonik Hielscher untuk berbagai aplikasi terkait E..
     

    Klip video ini menunjukkan homogenizer ultrasonik Hielscher UP100H, ultrasonicator yang banyak digunakan untuk persiapan sampel di laboratorium.

    Homogenizer Ultrasonik UP100H

    Video Thumbnail

    Pertumbuhan Sel, Crosslinking dan Persiapan Ekstrak Sel E. menggunakan Ultrasonik

    Untuk SeqA dan RNA polimerase ChIP-Chip E. MG1655 atau MG1655 ΔseqA ditanam pada suhu 37°C hingga OD600 sekitar 0,15 dalam 50 ml LB (+ 0,2% glukosa) sebelum 27 μl formaldehida (37%) per ml media ditambahkan (konsentrasi akhir 1%). Crosslinking dilakukan pada pengocok lambat (100 rpm) pada suhu kamar selama 20 menit diikuti dengan pendinginan dengan 10 ml glisin 2,5 M (konsentrasi akhir 0,5 M). Untuk percobaan kejutan panas, E. MG1655 ditanam dalam media LB 65 ml pada suhu 30°C hingga OD600 sekitar 0,3. Selanjutnya, 30 ml kultur dipindahkan ke labu yang telah dihangatkan sebelumnya pada suhu 43°C dan sisanya disimpan pada suhu 30°C. Crosslinking dan quenching adalah seperti yang dijelaskan di atas kecuali bahwa sel disimpan pada suhu 30 atau 43°C selama 5 menit sebelum mengocok lebih lambat pada suhu kamar. Sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan TBS dingin (pH7.5). Setelah resuspension dalam buffer lisis 1 ml (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sukrosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lisozim) dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit diikuti dengan penambahan buffer IP 4 ml, sel disonikasi di atas es dengan istirahat 12 kali 30 detik dan 30 detik menggunakan prosesor ultrasonik Hielscher UP400St pada pengaturan daya 100%. Setelah sentrifugasi selama 10 menit pada 9000 g, 800 μl aliquote supernatan disimpan pada suhu -20 °C. (Waldminghaus 2010)
     

    Kelebihan produksi dan Pemurnian Enzim dengan Probe Ultrasonik

    Ultrasonicator UP100H adalah homogeniser laboratorium yang sering digunakan untuk persiapan sampel pelat kultur sel.Untuk kelebihan produksi protein yang ditandai decahistidine (His10), E. BL21(DE3) diubah dengan konstruksi pET19b. Prakultur semalam dipanen dengan sentrifugasi, dan 1% digunakan untuk menginokulasi kultur ekspresi. Sel yang membawa pET19mgtB ditanam pada suhu 22°C hingga kerapatan optik pada 600 nm (OD600) sebesar 0,7. Kultur dipindahkan ke 17°C dan diinduksi oleh 100 μM IPTG. Setelah 16 jam, kultur dipanen dengan sentrifugasi pada 7.500 × g pada suhu 4°C. Sel-sel disuspensi kembali dalam garam buffer fosfat (PBS) 50 mM dengan 0,3 M NaCl pada pH 7,4 dan diganggu oleh ultrasonikasi dengan sonotrode ujung mikro S2 pada ultrasonicator Hielscher UP200St pada siklus 0,5 dan amplitudo 75%.
    Kelebihan produksi GtfC yang ditandai decahistidine diinduksi pada 37°C pada OD600 dari 0,6 dengan 100 μM IPTG. Sel kemudian diinkubasi selama 4 jam, dipanen, dan dilisis seperti yang dinyatakan di atas untuk MgtB.
    Ekstrak sel kasar disentrifugasi pada suhu 15.000 × g dan 4°C untuk mengendapkan puing-puing sel. Ekstrak yang diklarifikasi dimuat pada kolom HisTrap FF Crude 1 ml menggunakan sistem ÄKTAprime Plus. Enzim dimurnikan sesuai dengan protokol pabrikan untuk elusi gradien protein yang ditandai His. Larutan protein yang dielusi dialisis dua kali terhadap 1.000 volume PBS 50 mM, pH 7,4, dengan 0,3 M NaCl pada 4°C. Pemurnian dianalisis dengan 12% SDS-PAGE. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan Roti-Quant. (Rabausch dkk. 2013)
     

    Ekstraksi Ultrasonik Protein dari Bakteri E.
    Protein umpan yang menarik (dalam hal ini, MTV1 dari Arabidopsis thaliana) menyatu dengan tag GST dan diekspresikan dalam sel BL21 Escherichia (E.).

    1. Ambil satu pelet GST-MTV1 dan GST (sesuai dengan kultur bakteri 50 ml) dan menangguhkan kembali masing-masing dalam buffer ekstraksi es dingin 2,5 mL.
    2. Gunakan ultrasonicator UP100H (dilengkapi dengan microtip-sonotrode MS3 untuk volume kecil sekitar 2-5mL) untuk mengganggu sel-sel bakteri sampai mereka dilisis, yang ditunjukkan dengan berkurangnya opasitas dan peningkatan viskositas. Ini harus dilakukan di atas es, dan disarankan untuk melakukan sonikasi dalam interval (misalnya sonicasi 10 detik diikuti dengan jeda 10 detik di atas es dan seterusnya). Perawatan harus dilakukan untuk tidak sonication dengan intensitas yang terlalu tinggi. Jika berbusa atau pembentukan endapan putih terdeteksi, intensitasnya perlu diturunkan.
    3. Pindahkan larutan bakteri lisis ke tabung mikrosentrifugal 1,5 mL dan centrifuge pada suhu 4°C, 16.000 x g selama 20 menit.

     

    Probe ultrasonik menggunakan kekuatan kavitasi akustik untuk mengganggu sel dan untuk mengekstrak molekul dan DNA dari E..

    Ultrasonicator tipe probe seperti UP400St gunakan prinsip kerja kavitasi akustik untuk lisis E.yang efisien.

    Analisis Ekspresi dan Pemurnian Protein Rekombinan menggunakan Sonikasi

    Pelet E. disonikasi dengan ultrasonicator Hielscher UP100H. Untuk tujuan ini, pelet sel disuspensi kembali dalam buffer lisis dingin (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dan didinginkan di atas es selama 10 menit. Kemudian, suspensi sel disonikasi dengan 10 semburan pendek 10 detik diikuti dengan interval 30 detik untuk pendinginan. Akhirnya, puing-puing sel dihilangkan dengan ultrasentrifugasi pada suhu 4°C selama 15 menit pada 14000 rpm. Untuk konfirmasi ekspresi rPR, supernatan dijalankan pada gel poliakrilamida 12% dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan Western blotting. Pemurnian rPR dilakukan dengan menggunakan resin Ni2+-NTA (Invitrogen, AS) sesuai dengan panduan pabrikan. Pada tahap ini, metode pemurnian asli digunakan. Kemurnian protein yang dimurnikan dinilai menggunakan elektroforesis pada gel poliakrilamida 12% dan pewarnaan biru Coomassie berikutnya. Konsentrasi protein yang dimurnikan diukur dengan kit uji protein Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad dkk. 2016)
     

    Video ini menunjukkan cuphorn ultrasonik 200 watt untuk membubarkan, menghomogenisasi, mengekstraksi atau degassing sampel lab.

    Cuphorn Ultrasonik (200 Watt)

    Video Thumbnail

    Homogenizer Ultrasonik untuk E. Lysis

    Hielscher Ultrasonics merancang, memproduksi, dan memasok homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk lisis bakteri E. yang andal dan efisien dan jenis sel lainnya, jaringan, dan kultur sel.
    Portofolio luas probe ultrasonik serta sistem sonikasi tidak langsung memungkinkan kami untuk menawarkan homogenizer jaringan ultrasonik yang ideal untuk aplikasi gangguan dan ekstraksi sel Anda.

    Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

    Ultrasonicator Hielscher dapat dikendalikan dari jarak jauh melalui kontrol browser. Parameter sonikasi dapat dipantau dan disesuaikan dengan persyaratan proses.Ultrasonicators Hielscher terkenal dengan kualitas dan standar desainnya yang tertinggi. Perangkat lunak pintar, menu intuitif, pengaturan yang dapat diprogram, dan protokol data otomatis hanyalah beberapa fitur ultrasonicator Hielscher. Ketahanan dan pengoperasian yang mudah memungkinkan integrasi ultrasonicator kami yang lancar ke dalam fasilitas penelitian dan biotek. Bahkan kondisi kasar dan lingkungan yang menuntut mudah ditangani oleh ultrasonicator Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikat ISO dan memberikan penekanan khusus pada ultrasonicators berkinerja tinggi yang menampilkan teknologi canggih dan keramahan pengguna. Tentu saja, ultrasonicators Hielscher sesuai dengan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA dan RoHs.

    Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami:

    Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
    Pelat multi-sumur / mikrotiter n.a. UIP400MTP
    CupHorn untuk botol atau gelas kimia n.a. Ultrasonik CupHorn
    reaktor aliran mikro ultrasonik n.a. GDmini2
    hingga 10 botol dengan 0,5 hingga 1,5mL n.a. VialTweeter
    0.5 untuk 1.5mL n.a. VialTweeter
    1 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
    10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St
    0.1 hingga 20L 0.2 sampai 4L/min UIP2000hdT
    10 sampai 100L 2-10L/min UIP4000
    n.a. 10 sampai 100L/menit UIP16000
    n.a. kristal yang lebbig cluster UIP16000

    Hubungi Kami! / Tanya Kami!

    Minta informasi lebih lanjut

    Silakan gunakan formulir di bawah ini untuk meminta informasi tambahan tentang homogenizer jaringan ultrasonik dan penghancur sel, aplikasi lisis dan harga. Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda dengan Anda dan menawarkan homogenizer ultrasonik yang memenuhi kebutuhan Anda!









    Harap perhatikan kami Kebijakan Privasi.




    Video menunjukkan sistem persiapan sampel ultrasonik UIP400MTP, yang memungkinkan persiapan sampel yang andal dari pelat multi-sumur standar menggunakan ultrasound intensitas tinggi. Aplikasi umum dari UIP400MTP ini meliputi lisis sel, DNA, RNA, dan pemotongan kromatin serta ekstraksi protein.

    Ultrasonicator UIP400MTP untuk sonikasi pelat multi-sumur

    Video Thumbnail

    Protokol Tambahan untuk Lisis E. Ultrasonik

    Protein yang dimodifikasi allicin dalam E. menggunakan Ultrasonic VialTweeter

    VialTweeter di prosesor ultrasonik UP200STPenentuan Kandungan Sulfhidril dengan Uji 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
    Kultur semalam E. MG1655 digunakan untuk menginokulasi media minimal MOPS (1:100). Budaya ditanam secara aerobik sampai A600 0,4 tercapai. Kultur dibagi menjadi tiga kultur 15 ml untuk pengobatan stres. Budaya yang tidak diobati berfungsi sebagai kontrol negatif. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) atau 1 mM diamide ditambahkan ke salah satu dari dua kultur yang tersisa masing-masing. Kultur diinkubasi selama 15 menit. 5 ml setiap kultur dipanen dengan sentrifugasi (8.525 × g, 4°C, 10 menit). Sel dicuci dua kali dengan 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, disimpan secara anaerobik sebelum digunakan) dan disentrifugasi (13.000 × g, 4°C, 10 menit). Sel-sel disuspensi kembali dalam buffer lisis (PBS dengan 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) sebelum gangguan pada 4 °C oleh ultrasonikasi (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Jerman) (3 × 1 menit). Puing-puing sel dipelet dengan sentrifugasi (13.000 × g, 4 °C, 15 menit). Supernatan dipindahkan ke kuvet QS-makro 3,5 ml (10 mm) dengan batang pengaduk magnetik dan dicampur dengan 1 ml buffer lisis. Kepunahan sampel dipantau pada 412 nm dengan spektrofotometer Jasco V-650 yang dilengkapi dengan dudukan sel yang dikontrol suhu PSC-718 pada suhu kamar. 100μl larutan dithiobis (2-nitrobenzoic acid) 3 mM ditambahkan. Kepunahan dipantau hingga mencapai kejenuhan. Perhitungan konsentrasi tiol dilakukan dengan menggunakan koefisien kepunahan ε412 = 13.700 M-1 sentimeter-1 untuk asam tio-2-nitrobenzoat (TNB). Konsentrasi tiol seluler dihitung berdasarkan volume sel E. sebesar 6,7 × 10-15 liter dan kerapatan sel A600 = 0,5 (setara dengan 1 × 108. sel ml-1 budaya). (Müller dkk. 2016)
     

    Penentuan Glutathione In Vivo menggunakan Penghancur Sel Ultrasonik

    E.MG1655 ditanam dalam media minimal MOPS dengan volume total 200ml hingga A600 0,5 tercapai. Kultur dibagi menjadi kultur 50 ml untuk pengobatan stres. Setelah 15 menit inkubasi dengan 0,79 mM allicin, 1 mM diamide, atau dimetil sulfoksida (kontrol), sel dipanen pada 4.000g pada 4°C selama 10 menit. Sel dicuci dua kali dengan buffer KPE sebelum resuspension pelet dalam 700μl buffer KPE. Untuk deproteinasi, 300l asam sulfosalicylic 10% (w / v) ditambahkan sebelum gangguan sel dengan ultrasonikasi (3 x 1 menit; VialTweeter ultrasonikator). Supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi (30 menit, 13.000g, 4°C). Konsentrasi asam sulfosalicylic diturunkan menjadi 1% dengan penambahan 3 volume buffer KPE. Pengukuran total glutathione dan GSSG dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Konsentrasi glutathione seluler dihitung berdasarkan volume sel E. sebesar 6,7×10-15 liter dan kerapatan sel A600 0,5 (setara dengan 1×108. sel ml-1 budaya). Konsentrasi GSH dihitung dengan pengurangan 2 [GSSG] dari total glutathione. (Müller dkk. 2016)

    Ekspresi mAspAT Manusia pada E. menggunakan Homogenizer Ultrasonik

    Pengganggu sel ultrasonik UP400St (400W) untuk ekstraksi materi intraseluler (misalnya protein, organel, DNA, RNA, dll.)Koloni tunggal E. BL21 (DE3) yang menyimpan vektor ekspresi dalam 30 mL media Luria-Bertani (LB) yang mengandung 100μg/mL ampisilin, dan kemudian dibudidayakan pada suhu 37ºC hingga kerapatan optik (OD600) mencapai 0,6. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 4.000 × g selama 10 menit, dan disuspensi kembali dalam media LB segar 3L yang mengandung 100μg/mL ampisilin.
    Selanjutnya, ekspresi protein diinduksi dengan 1 mM isopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) selama 20 jam pada suhu 16ºC. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 8.000 × g selama 15 menit dan dicuci dengan buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Perkiraan 45g sel (berat basah) diperoleh dari kultur 3 L. Setelah sentrifugasi, pelet sel disuspensi kembali dalam buffer ekstraksi es dingin 40 mL (untuk kultur 1 L), dan dilisis dengan ultrasonikasi pada suhu sedingin es menggunakan penghancur sel ultrasonik Hielscher UP400St. Lisis sel disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan fraksi larut (supernatant) dan diendapkan (pelet). (Jiang dkk. 2015)
     



    Fakta-fakta yang Patut Diketahui

    E.

    Escherichia (E.) adalah bakteri gram negatif, anaerobik fakultatif, berbentuk batang, coliform dari genus Escherichia yang umumnya ditemukan di usus bawah organisme berdarah panas (endoterm). Ada sejumlah besar strain E. (atau subtipe) dengan karakteristik yang beragam. Sebagian besar strain E. tidak berbahaya bagi manusia, misalnya strain B dan K-12 yang biasa digunakan untuk aplikasi penelitian di laboratorium. Namun, beberapa strain berbahaya dan dapat menyebabkan penyakit serius.
    E. memainkan peran penting dalam teknik biologi modern dan mikrobiologi industri karena bakteri mudah dimanipulasi. Aplikasi laboratorium umum yang sering melibatkan penggunaan E., misalnya untuk membuat asam deoksiribonukleat (DNA) rekombinan atau untuk bertindak sebagai organisme model.
    E. adalah inang yang sangat serbaguna untuk produksi protein heterolog, dan sistem ekspresi protein bermacam-macam tersedia untuk menghasilkan protein rekombinan dalam E.. Dengan menggunakan plasmid yang memungkinkan ekspresi protein tingkat tinggi, gen dapat dimasukkan ke dalam bakteri, yang memungkinkan untuk menghasilkan protein tersebut dalam jumlah besar dalam proses fermentasi industri.
    E.digunakan sebagai pabrik sel untuk memproduksi insulin. Aplikasi lebih lanjut termasuk penggunaan sel E. yang dimodifikasi untuk mengembangkan dan memproduksi vaksin dan enzim yang tidak bergerak, untuk menghasilkan biofuel, serta untuk bioremediasi.
    Strain K-12 adalah bentuk mutan E. yang mengekspresikan enzim Alkaline Phosphatase (ALP) secara berlebihan. Mutasi ini terjadi karena cacat pada gen yang terus-menerus mengkode enzim. Jika suatu gen menghasilkan produk tanpa hambatan apa pun, ini dikenal sebagai aktivitas konstitutif. Bentuk mutan spesifik ini digunakan untuk isolasi dan pemurnian enzim ALP.
    Bakteri E. juga banyak digunakan sebagai pabrik sel. Mikroba rekayasa (misalnya, bakteri) dan sel tumbuhan dapat digunakan sebagai apa yang disebut pabrik sel. Sel-sel yang dimodifikasi secara genetik ini menghasilkan molekul, bahan kimia, polimer, protein, dan zat lainnya, yang digunakan misalnya dalam industri farmasi, makanan, dan kimia. Untuk melepaskan molekul yang diproduksi di bagian dalam sel rekayasa hayati tersebut, lisis ultrasonik adalah metode umum untuk mengganggu dinding sel dan untuk mentransfer zat target ke dalam cairan di sekitarnya. Baca lebih lanjut tentang lisis sel rekayasa hayati!

    Ultrasonic DNA Shearing

    Gaya geser ultrasonik adalah metode yang umum digunakan untuk melepaskan molekul, organel dan protein dari bagian dalam sel serta untuk memecah untaian DNA menjadi beberapa bagian. Kavitasi akustik memecah dinding dan membran sel untuk mengekstrak DNA dari sel dan menghasilkan fragmen sekitar 600 – Panjang 800 bp, yang ideal untuk analisis.
    Klik di sini untuk mempelajari lebih lanjut tentang homogenizer ultrasonik untuk fragmentasi DNA!

    Literatur / Referensi


    Ultrasonik kinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup spektrum penuh dari ultrasonicator lab kompak di atas unit bench-top hingga sistem ultrasonik industri penuh.

    Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.

    Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda.

    Let's get in contact.