Lisis Ultrasonik E. Coli

Bakteri E. coli merupakan bakteri yang paling umum digunakan dalam mikrobiologi dan bioteknologi.
Perangkat disrupsi sel ultrasonik memberikan hasil yang andal dan dapat direproduksi untuk lisis E. coli.
Kavitasi dan gaya geser yang intens namun dapat dikendalikan secara presisi menghasilkan disrupsi menyeluruh dan rendemen ekstraksi yang tinggi (misalnya protein, DNA).

Mengapa Disrupsi Sel Ultrasonik E. coli Menjadi Metode Pilihan?

Homogenizer ultrasonik atau sonikator tipe probe menawarkan beberapa keunggulan untuk lisis E. coli karena ultrasonik berintensitas tinggi secara efisien mendisrupsi dinding dan membran sel. Sonikator tipe probe banyak digunakan untuk lisis E. coli karena alasan berikut:

Disrupsi dinding sel yang efisien: E. coli memiliki dinding sel semikaku yang tersusun atas peptidoglikan, yang dapat sulit dipecah menggunakan metode lisis tradisional. Sonikator tipe probe menghasilkan gelombang ultrasonik intens yang membentuk gelembung kavitasi dalam cairan di sekitar sel. Ketika gelembung ini runtuh, gelembung tersebut menghasilkan semburan cairan berkecepatan tinggi dan gelombang kejut yang menyebabkan disrupsi mekanis dinding sel, sehingga secara efektif melepaskan isi sel seperti biomolekul.

Peningkatan penetrasi: Gelombang ultrasonik yang dihasilkan oleh probe / sonotrode dapat menembus jauh ke dalam sampel, menjangkau lebih banyak sel E. coli dan memberikan perlakuan secara merata. Hal ini membantu memastikan lisis yang lebih seragam di seluruh sampel, sehingga meningkatkan efisiensi disrupsi sel.

Pengurangan waktu pemrosesan: Energi yang disalurkan oleh sonikator tipe probe sangat terkonsentrasi dan terlokalisasi, sehingga menghasilkan lisis sel yang cepat dan efisien. Dibandingkan dengan metode lain seperti pengocokan dengan manik atau lisis enzimatis, sonikasi dapat melisis E. coli dalam hitungan menit atau bahkan detik. Sementara banyak teknik alternatif seperti pembekuan–pencairan memerlukan beberapa siklus perlakuan, lisis ultrasonik membuka sel dalam satu langkah proses.

Pengendalian Suhu: Sonikator mutakhir dilengkapi dengan sensor suhu dan perangkat lunak cerdas yang memungkinkan pengaturan suhu proses maksimum. Sonikator berhenti sementara secara otomatis ketika batas suhu tercapai dan memulai proses sonikasi ketika titik suhu yang ditetapkan tercapai. Mendinginkan sampel dalam penangas es merupakan metode sederhana untuk menjaga suhu sampel tetap rendah dan mencegah degradasi sampel akibat panas.

Skalabilitas: Sonikator tipe probe tersedia dalam berbagai ukuran, dari perangkat genggam hingga model industri berskala besar. Hal ini menjadikannya sesuai untuk memproses volume kecil di laboratorium atau meningkatkan skala untuk aplikasi biopemrosesan yang lebih besar, misalnya produksi vaksin atau biosintesis molekul.

Keserbagunaan: Sonikator dapat digunakan untuk berbagai aplikasi selain lisis sel, seperti pemotongan DNA dengan gaya geser, ekstraksi protein, homogenisasi jaringan, dispersi nanopartikel, dan emulsifikasi. Oleh karena itu, investasi pada sonikator tipe probe memberikan keserbagunaan dalam lingkungan penelitian atau industri.

Sonikator tipe probe seperti UP200St merupakan homogenizer jaringan dan penghancur sel yang andal, sehingga banyak digunakan untuk preparasi sampel dalam genetika, misalnya untuk lisis E.coli

Ekstraksi protein dari sel E.coli dilakukan secara efisien dengan probe ultrasonik UP200St

Sonikator tipe probe menawarkan banyak keunggulan untuk lisis E. coli. Pengendalian parameter proses ultrasonik yang andal dan presisi memungkinkan optimalisasi parameter operasi seperti daya, durasi, dan penanganan sampel untuk mencapai hasil yang diinginkan.

Tutorial ini menjelaskan jenis sonikator yang paling sesuai untuk tugas preparasi sampel Anda, seperti lisis, disrupsi sel, isolasi protein, serta fragmentasi DNA dan RNA di laboratorium, dalam analisis, dan dalam penelitian. Pilih jenis sonikator yang ideal untuk aplikasi, volume sampel, jumlah sampel, dan kapasitas pemrosesan sampel Anda. Hielscher Ultrasonics memiliki homogenizer ultrasonik yang ideal untuk Anda!

Fragmentasi DNA ultrasonik sering digunakan sebagai langkah preparasi sampel dalam Sekuensing Generasi Berikutnya (NGS)

Analisis elektroforesis DNA genom E. coli EDL933 yang menjalani sonikasi selama 0 – 15 min. L menunjukkan penanda ukuran DNA.
(penelitian dan gambar: ©Basselet et al. 2008)

Disrupsi Sel menggunakan Kavitasi Ultrasonik

Homogenizer ultrasonik tipe probe beroperasi dengan sekitar 20.000 siklus per detik (pada 20kHz) dan menyebabkan kavitasi dalam cairan atau suspensi. Kavitasi akustik membentuk area mikroskopis bertekanan menyerupai vakum dan bersuhu tinggi yang merobek sel. Meskipun suhu dapat mencapai beberapa ribu derajat Celsius, volume kavitasi sangat kecil sehingga tidak memanaskan proses secara signifikan. Kavitasi akustik dan gaya geser yang dihasilkan oleh ultrasonik melubangi atau memecahkan membran sel bakteri seperti E.coli. Sonikator Hielscher memungkinkan pengendalian yang presisi atas parameter proses seperti intensitas ultrasonik, amplitudo, masukan energi, dan suhu. Dengan demikian, proses lisis ultrasonik dapat disesuaikan secara optimal dengan jenis sel, kultur sel, dan tujuan proses.

Keunggulan Lisis Ultrasonik

pengendalian lisis yang presisi (intensitas, amplitudo, suhu)
hasil yang andal dan dapat direproduksi
penyesuaian optimal untuk sampel tertentu
pengendalian suhu
untuk sampel yang sangat kecil hingga sangat besar (µL hingga liter)
perlakuan yang sepenuhnya mekanis
pengoperasian yang mudah dan aman
peningkatan skala secara linear dari laboratorium ke produksi

Perangkat ultrasonik VialTweeter memungkinkan preparasi sampel secara simultan hingga 10 vial dalam kondisi proses yang sama. (Klik untuk memperbesar!)

VialTweeter untuk lisis ultrasonik

Homogenizer Ultrasonik dibandingkan Teknik Lisis Lainnya

Meskipun lisis kimia dan enzimatis dapat menimbulkan masalah – karena lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan menimbulkan masalah pemurnian, sedangkan lisis enzimatis memerlukan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi – disrupsi ultrasonik merupakan metode disrupsi sel yang canggih dan cepat.
Lisis ultrasonik hanya mengandalkan gaya mekanis. Tidak ada bahan kimia yang ditambahkan; sonikasi memecahkan dinding sel melalui gaya geser. Lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan menimbulkan masalah pemurnian. Disrupsi enzimatis memerlukan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi. Disrupsi ultrasonik pada sel bakteri E.coli berlangsung cepat, sederhana, andal, dan dapat direproduksi. Itulah sebabnya sonikator Hielscher digunakan di laboratorium biologi dan biokimia di seluruh dunia untuk preparasi sampel, pra-analisis, diagnostik in vitro, dan berbagai pengujian.

Rekomendasi Umum untuk Lisis Ultrasonik

Sonikasi merupakan teknik paling populer untuk melisis suspensi sel dalam jumlah sangat kecil, sedang, dan besar – dari pikoliter hingga 100L/hr (menggunakan sel alir ultrasonik). Sel dilisis oleh gaya geser cairan dan kavitasi. DNA juga terpotong oleh gaya geser selama sonikasi, sehingga tidak perlu menambahkan DNase ke dalam suspensi sel.

Pengendalian suhu selama lisis ultrasonik E.coli
Dengan mendinginkan sampel terlebih dahulu dan menjaga sampel di atas es selama sonikasi, degradasi termal sampel dapat dicegah dengan mudah.
Idealnya, sampel harus dijaga tetap sedingin es selama lisis, tetapi untuk sebagian besar sampel, cukup jika suhu tidak meningkat melebihi suhu kultur atau jaringan asal. Oleh karena itu, disarankan untuk menjaga suspensi di atas es dan melakukan sonikasi dengan beberapa pulsa ultrasonik singkat selama 5–10 sec serta jeda selama 10–30 sec. Selama jeda, panas dapat terdisipasi untuk mengembalikan suhu rendah. Untuk sampel sel yang lebih besar, tersedia berbagai reaktor sel alir dengan jaket pendingin.
Baca kiat dan rekomendasi terperinci di sini untuk lisis ultrasonik yang berhasil!

Protokol untuk Preparasi Ultrasonik Lisat E. Coli

Para peneliti menggunakan homogenizer ultrasonik Hielscher untuk disrupsi sel E.coli. Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol yang telah diuji dan terbukti untuk lisis E.coli menggunakan homogenizer ultrasonik Hielscher bagi berbagai aplikasi terkait E. coli.

Pertumbuhan Sel, Pengikatan Silang, dan Preparasi Ekstrak Sel E. coli menggunakan Ultrasonik

Untuk ChIP-Chip SeqA dan RNA polimerase, E. coli MG1655 atau MG1655 ΔseqA ditumbuhkan pada 37°C hingga OD₆₀₀ sekitar 0,15 dalam 50 ml LB (+ 0,2% glukosa) sebelum penambahan 27 μl formaldehida (37%) per ml medium (konsentrasi akhir 1%). Pengikatan silang dilakukan dengan pengocokan lambat (100 rpm) pada suhu ruang selama 20 min, diikuti penghentian reaksi dengan 10 ml glisin 2,5 M (konsentrasi akhir 0,5 M). Untuk percobaan kejut panas, E. coli MG1655 ditumbuhkan dalam 65 ml medium LB pada 30°C hingga OD₆₀₀ sekitar 0,3. Selanjutnya, 30 ml kultur dipindahkan ke labu yang telah dipanaskan sebelumnya pada 43°C dan sisanya dipertahankan pada 30°C. Pengikatan silang dan penghentian reaksi dilakukan seperti dijelaskan di atas, kecuali bahwa sel dipertahankan pada 30 atau 43°C selama 5 min sebelum pengocokan lambat lebih lanjut pada suhu ruang. Sel dikumpulkan melalui sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan TBS dingin (pH7.5). Setelah resuspensi dalam 1 ml bufer lisis (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sukrosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lisozim) dan inkubasi pada 37°C selama 30 min, diikuti penambahan 4 ml bufer IP, sel disonikasi di atas es sebanyak 12 kali selama 30 sec dengan jeda 30 sec menggunakan prosesor ultrasonik Hielscher UP400St pada pengaturan daya 100%. Setelah sentrifugasi selama 10 min pada 9000 g, alikuot supernatan sebanyak 800 μl disimpan pada -20°C. (Waldminghaus 2010)

Produksi Berlebih dan Pemurnian Enzim dengan Probe Ultrasonik

Untuk produksi berlebih protein bertag dekahistidin (His10), E. coli BL21(DE3) ditransformasi dengan konstruk pET19b. Prakultur semalaman dipanen melalui sentrifugasi, dan 1% digunakan untuk menginokulasi kultur ekspresi. Sel yang membawa pET19mgtB ditumbuhkan pada 22°C hingga mencapai densitas optik pada 600 nm (OD600) sebesar 0,7. Kultur dipindahkan ke suhu 17°C dan diinduksi dengan 100 μM IPTG. Setelah 16 h, kultur dipanen melalui sentrifugasi pada 7.500 × g pada 4°C. Sel diresuspensikan dalam larutan garam berbufer fosfat (PBS) 50 mM dengan 0,3 M NaCl pada pH 7,4 dan didisrupsi melalui sonikasi dengan sonotrode berujung mikro S2 pada sonikator Hielscher UP200St dengan siklus 0,5 dan amplitudo 75%.
Produksi berlebih GtfC bertag dekahistidin diinduksi pada 37°C pada OD₆₀₀ sebesar 0,6 dengan 100 μM IPTG. Sel kemudian diinkubasi selama 4 h, dipanen, dan dilisis seperti dijelaskan di atas untuk MgtB.
Ekstrak sel kasar disentrifugasi pada 15.000 × g dan 4°C untuk mengendapkan debris sel. Ekstrak yang telah dijernihkan dimuat ke kolom HisTrap FF Crude 1-ml menggunakan sistem ÄKTAprime Plus. Enzim dimurnikan sesuai dengan protokol produsen untuk elusi gradien protein bertag His. Larutan protein hasil elusi didialisis dua kali terhadap 1.000 volume PBS 50 mM, pH 7,4, dengan 0,3 M NaCl pada 4°C. Pemurnian dianalisis dengan SDS-PAGE 12%. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ekstraksi Ultrasonik Protein dari Bakteri E. coli
Protein umpan yang diteliti (dalam hal ini, MTV1 dari Arabidopsis thaliana) difusikan dengan tag GST dan diekspresikan dalam sel Escherichia coli (E. coli) BL21.

Ambil masing-masing satu pelet GST-MTV1 dan GST (setara dengan 50 ml kultur bakteri) dan resuspensikan masing-masing dalam 2,5 mL bufer ekstraksi sedingin es.
Gunakan sonikator UP100H (dilengkapi sonotrode berujung mikro MS3 untuk volume kecil sekitar 2–5mL) untuk mendisrupsi sel bakteri hingga terlisis, yang ditandai dengan berkurangnya kekeruhan dan meningkatnya viskositas. Proses ini harus dilakukan di atas es, dan disarankan untuk melakukan sonikasi secara berkala (misalnya sonikasi selama 10 sec diikuti jeda 10 sec di atas es, dan seterusnya). Perlu kehati-hatian agar sonikasi tidak dilakukan dengan intensitas terlalu tinggi. Jika terdeteksi pembusaan atau pembentukan endapan putih, intensitas perlu diturunkan.
Pindahkan larutan bakteri yang telah dilisis ke tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL dan sentrifugasi pada 4°C, 16.000 x g selama 20 min.

Probe ultrasonik menggunakan gaya kavitasi akustik untuk mendisrupsi sel serta mengekstraksi molekul dan DNA dari E.coli.

Sonikator tipe probe seperti UP400St menggunakan prinsip kerja kavitasi akustik untuk lisis E.coli yang efisien.

Analisis Ekspresi dan Pemurnian Protein Rekombinan menggunakan Sonikasi

Pelet E. coli disonikasi dengan sonikator Hielscher UP100H. Untuk tujuan ini, pelet sel diresuspensikan dalam bufer lisis dingin (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dan didinginkan di atas es selama 10 min. Kemudian, suspensi sel disonikasi dengan 10 pulsa singkat selama 10 s, masing-masing diikuti jeda 30 s untuk pendinginan. Terakhir, debris sel disingkirkan melalui ultrasentrifugasi pada 4°C selama 15 min pada 14.000 rpm. Untuk mengonfirmasi ekspresi rPR, supernatan dielektroforesis pada gel poliakrilamida 12% dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan Western blotting. Pemurnian rPR dilakukan menggunakan resin Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) sesuai panduan produsen. Pada tahap ini, digunakan metode pemurnian dalam kondisi natif. Kemurnian protein hasil pemurnian dinilai menggunakan elektroforesis pada gel poliakrilamida 12% dan dilanjutkan dengan pewarnaan Coomassie blue. Konsentrasi protein hasil pemurnian diukur dengan kit uji protein Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Video ini menunjukkan CupHorn ultrasonik berdaya 200 watt untuk mendispersikan, menghomogenkan, mengekstraksi, atau menghilangkan gas dari sampel laboratorium.

Homogenizer Ultrasonik untuk Lisis E. coli

Hielscher Ultrasonics merancang, memproduksi, dan memasok homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk lisis bakteri E. coli serta jenis sel, jaringan, dan kultur sel lainnya secara andal dan efisien.
Portofolio luas probe ultrasonik serta sistem sonikasi tidak langsung memungkinkan kami menawarkan homogenizer jaringan ultrasonik yang ideal untuk aplikasi disrupsi sel dan ekstraksi Anda.

Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

Sonikator Hielscher terkenal akan standar kualitas dan desain tertinggi. Perangkat lunak cerdas, menu intuitif, pengaturan yang dapat diprogram, dan pencatatan data otomatis hanyalah beberapa fitur sonikator Hielscher. Ketangguhan dan kemudahan pengoperasian memungkinkan integrasi sonikator kami secara lancar ke fasilitas penelitian dan bioteknologi. Bahkan kondisi berat dan lingkungan yang menuntut pun dapat ditangani dengan mudah oleh sonikator Hielscher.

Hielscher Ultrasonics merupakan perusahaan bersertifikasi ISO dan memberikan perhatian khusus pada sonikator berkinerja tinggi yang dilengkapi teknologi mutakhir dan mudah digunakan. Tentu saja, sonikator Hielscher sesuai dengan standar CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA, dan RoHs.

Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sonikator kami:

Volume Batch	Laju Alir	Perangkat yang Direkomendasikan
pelat multi-sumur / mikrotiter	tidak berlaku	UIP400MTP
CupHorn untuk vial atau gelas beker	tidak berlaku	CupHorn Ultrasonik
reaktor aliran mikro ultrasonik	tidak berlaku	GDmini2
hingga 10 vial dengan volume 0,5 hingga 1,5mL	tidak berlaku	VialTweeter
0,5 hingga 1,5mL	tidak berlaku	VialTweeter
1 hingga 500mL	10 hingga 200mL/min	UP100H
10 hingga 2000mL	20 hingga 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 hingga 20L	0,2 hingga 4L/min	UIP2000hdT
10 hingga 100L	2 hingga 10L/min	UIP4000
tidak berlaku	10 hingga 100L/min	UIP16000
tidak berlaku	lebih besar	gabungan unit UIP16000

Hubungi Kami! / Tanyakan kepada Kami!

Video ini menunjukkan sistem preparasi sampel ultrasonik UIP400MTP, yang memungkinkan preparasi sampel secara andal pada pelat multisumur standar apa pun menggunakan ultrasonik berintensitas tinggi. Aplikasi umum UIP400MTP meliputi lisis sel, pemotongan DNA, RNA, dan kromatin melalui gaya geser, serta ekstraksi protein.

Protokol Tambahan untuk Lisis Ultrasonik E. coli

Protein yang Dimodifikasi Alisin dalam E. coli menggunakan VialTweeter Ultrasonik

Penentuan Kandungan Sulfhidril dengan Uji 5,5′-Ditiobis(asam 2-nitrobenzoat) (DTNB)
Kultur E. coli MG1655 semalaman digunakan untuk menginokulasi medium minimal MOPS (1:100). Kultur ditumbuhkan secara aerobik hingga mencapai A600 sebesar 0,4. Kultur dibagi menjadi tiga kultur 15-ml untuk perlakuan stres. Kultur tanpa perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif. Alisin 0,79 mM (128 μg ml-1) atau diamida 1 mM ditambahkan masing-masing ke salah satu dari dua kultur yang tersisa. Kultur diinkubasi selama 15 min. Sebanyak 5 ml dari setiap kultur dipanen melalui sentrifugasi (8.525 × g, 4°C, 10 min). Sel dicuci dua kali dengan 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, disimpan secara anaerobik sebelum digunakan) dan disentrifugasi (13.000 × g, 4°C, 10 min). Sel diresuspensikan dalam bufer lisis (PBS dengan 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) sebelum disrupsi pada 4°C melalui sonikasi (sonikator VialTweeter , Hielscher GmbH, Jerman) (3 × 1 min). Debris sel diendapkan menjadi pelet melalui sentrifugasi (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatan dipindahkan ke kuvet QS-macro 3,5-ml (10 mm) dengan batang pengaduk magnetik dan dicampur dengan 1 ml bufer lisis. Ekstingsi sampel dipantau pada 412 nm dengan spektrofotometer Jasco V-650 yang dilengkapi dudukan sel bersuhu terkendali PSC-718 pada suhu ruang. Sebanyak 100μl larutan ditiobis(asam 2-nitrobenzoat) 3 mM ditambahkan. Ekstingsi dipantau hingga mencapai kejenuhan. Perhitungan konsentrasi tiol dilakukan menggunakan koefisien ekstingsi ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 untuk asam tio-2-nitrobenzoat (TNB). Konsentrasi tiol seluler dihitung berdasarkan volume sel E. coli sebesar 6,7 × 10^-15 liter dan kepadatan sel A600 = 0,5 (setara dengan 1 × 10⁸ sel ml^-1 kultur). (Müller et al. 2016)

Penentuan Glutation In Vivo menggunakan Penghancur Sel Ultrasonik

E.coli MG1655 ditumbuhkan dalam medium minimal MOPS dengan volume total 200ml hingga mencapai A600 sebesar 0,5. Kultur dibagi menjadi kultur-kultur 50-ml untuk perlakuan stres. Setelah inkubasi selama 15 min dengan 0,79 mM alisin, 1 mM diamida, atau dimetil sulfoksida (kontrol), sel dipanen pada 4.000g pada 4°C selama 10 min. Sel dicuci dua kali dengan bufer KPE sebelum pelet diresuspensikan dalam 700µl bufer KPE. Untuk deproteinasi, 300l asam sulfosalisilat 10% (w/v) ditambahkan sebelum disrupsi sel melalui sonikasi (3 x 1 min; sonikator VialTweeter ). Supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi (30 min, 13.000g, 4°C). Konsentrasi asam sulfosalisilat diturunkan menjadi 1% dengan penambahan 3 volume bufer KPE. Pengukuran glutation total dan GSSG dilakukan seperti dijelaskan di atas. Konsentrasi glutation seluler dihitung berdasarkan volume sel E. coli sebesar 6,7×10^-15 liter dan kepadatan sel A600 0,5 (setara dengan 1×10⁸ sel ml^-1 kultur). Konsentrasi GSH dihitung dengan mengurangkan 2[GSSG] dari glutation total. (Müller et al. 2016)

Ekspresi mAspAT Manusia dalam E. coli menggunakan Homogenizer Ultrasonik

Koloni tunggal E. coli BL21 (DE3) yang membawa vektor ekspresi ditempatkan dalam 30 mL medium Luria-Bertani (LB) yang mengandung 100μg/mL ampisilin, lalu dikultur pada 37ºC hingga densitas optik (OD₆₀₀) mencapai 0,6. Sel dipanen melalui sentrifugasi pada 4.000 × g selama 10 min, dan diresuspensikan dalam 3L medium LB segar yang mengandung 100μg/mL ampisilin.
Selanjutnya, ekspresi protein diinduksi dengan 1 mM isopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranosida (IPTG) selama 20 h pada 16ºC. Sel dipanen melalui sentrifugasi pada 8.000 × g selama 15 min dan dicuci dengan bufer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Sekitar 45g (bobot basah) sel diperoleh dari 3 L kultur. Setelah sentrifugasi, pelet sel diresuspensikan dalam 40 mL (untuk 1 L kultur) bufer ekstraksi A sedingin es, dan dilisis melalui sonikasi pada suhu sedingin es menggunakan penghancur sel ultrasonik Hielscher UP400St. Lisat sel disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 min untuk memisahkan fraksi terlarut (supernatan) dan fraksi yang mengendap (pelet). (Jiang et al. 2015)

Topik Terkait

Fakta yang Perlu Diketahui

E.coli

Escherichia coli (E. coli) merupakan bakteri koliform Gram-negatif, anaerob fakultatif, berbentuk batang dari genus Escherichia yang umum ditemukan di usus bagian bawah organisme berdarah panas (endoterm). Terdapat banyak galur (atau subtipe) E. coli dengan karakteristik yang beragam. Sebagian besar galur E. coli tidak berbahaya bagi manusia, misalnya galur B dan K-12 yang umum digunakan untuk aplikasi penelitian di laboratorium. Namun, beberapa galur berbahaya dan dapat menyebabkan penyakit serius.
E. coli berperan penting dalam rekayasa biologi modern dan mikrobiologi industri karena bakteri ini mudah dimanipulasi. Aplikasi laboratorium yang umum sering melibatkan penggunaan E. coli, misalnya untuk membuat asam deoksiribonukleat (DNA) rekombinan atau sebagai organisme model.
E. coli merupakan inang yang sangat serbaguna untuk produksi protein heterolog, dan berbagai sistem ekspresi protein tersedia untuk menghasilkan protein rekombinan dalam E. coli. Dengan menggunakan plasmid yang memungkinkan ekspresi protein tingkat tinggi, gen dapat dimasukkan ke dalam bakteri sehingga protein tersebut dapat diproduksi dalam jumlah besar melalui proses fermentasi industri.
E.coli digunakan sebagai pabrik sel untuk memproduksi insulin. Aplikasi lainnya meliputi penggunaan sel E. coli yang dimodifikasi untuk mengembangkan dan memproduksi vaksin serta enzim terimobilisasi, memproduksi bahan bakar hayati, serta untuk bioremediasi.
Galur K-12 merupakan bentuk mutan E. coli yang mengekspresikan enzim fosfatase alkali (ALP) secara berlebih. Mutasi ini terjadi akibat cacat pada gen yang terus-menerus mengode enzim tersebut. Jika suatu gen menghasilkan produk tanpa penghambatan apa pun, hal ini dikenal sebagai aktivitas konstitutif. Bentuk mutan spesifik ini digunakan untuk isolasi dan pemurnian enzim ALP.
Bakteri E. coli juga banyak digunakan sebagai pabrik sel. Mikroba hasil rekayasa (misalnya bakteri) dan sel tumbuhan dapat digunakan sebagai apa yang disebut pabrik sel. Sel yang dimodifikasi secara genetik ini menghasilkan molekul, bahan kimia, polimer, protein, dan zat lainnya, yang digunakan misalnya dalam industri farmasi, pangan, dan kimia. Untuk melepaskan molekul yang diproduksi di dalam sel hasil rekayasa hayati tersebut, lisis ultrasonik merupakan metode umum untuk mendisrupsi dinding sel dan memindahkan zat target ke cairan di sekitarnya. Baca lebih lanjut tentang lisis sel hasil rekayasa hayati!

Pemotongan DNA dengan Gaya Geser Ultrasonik

Gaya geser ultrasonik merupakan metode yang umum digunakan untuk melepaskan molekul, organel, dan protein dari bagian dalam sel serta untuk memotong untai DNA menjadi fragmen. Kavitasi akustik memecahkan dinding dan membran sel untuk mengekstraksi DNA dari sel dan menghasilkan fragmen dengan panjang sekitar 600 – 800 bp, yang ideal untuk analisis.
Klik di sini untuk mempelajari lebih lanjut tentang homogenizer ultrasonik untuk fragmentasi DNA!

Literatur / Referensi

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrasonik berkinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup seluruh spektrum, mulai dari sonikator laboratorium ringkas, unit meja, hingga sistem ultrasonik berskala industri penuh.

Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi dari skala laboratorium hingga industri.