Ultrasonic Lisis E. Coli

  • E. bakteri coli adalah bakteri yang paling umum digunakan dalam mikrobiologi dan bioteknologi.
  • pengganggu sel ultrasonik memberikan hasil yang handal dan direproduksi untuk lisis E. coli.
  • kavitasi dan geser pasukan intens namun justru dikontrol mengakibatkan gangguan lengkap dan hasil ekstraksi yang tinggi (misalnya protein, DNA).

Mengapa Gangguan Sel Ultrasonik E. Metode yang Disukai?

Homogenizers ultrasonik atau ultrasonicators tipe probe menawarkan beberapa keuntungan untuk lisis E. karena ultrasound yang intens secara efisien mengganggu dinding sel dan membran. Ultrasonikator tipe probe banyak digunakan untuk lisis E. karena alasan berikut:

  • Gangguan dinding sel yang efisien: E. memiliki dinding sel semi-kaku yang terdiri dari peptidoglikan, yang bisa sulit dipecahkan menggunakan metode lisis tradisional. Ultrasonikator tipe probe menghasilkan gelombang ultrasonik intens yang menciptakan gelembung kavitasi dalam cairan yang mengelilingi sel. Ketika gelembung-gelembung ini runtuh, mereka menghasilkan jet cair berkecepatan tinggi dan gelombang kejut yang mengakibatkan gangguan mekanis pada dinding sel, secara efektif melepaskan konten seluler seperti biomolekul.
  • Peningkatan penetrasi: Gelombang ultrasonik yang dihasilkan oleh probe / sonotrode dapat menembus jauh ke dalam sampel, mencapai jumlah sel E. yang lebih besar dan memperlakukannya secara merata. Ini membantu memastikan bahwa lisis lebih seragam di seluruh sampel, menghasilkan efisiensi gangguan sel yang lebih tinggi.
  • Mengurangi Waktu Pemrosesan: Energi yang disampaikan oleh ultrasonikator tipe probe sangat terkonsentrasi dan terlokalisasi, yang mengarah ke lisis sel yang cepat dan efisien. Dibandingkan dengan metode lain seperti pemukulan manik-manik atau lisis enzimatik, sonikasi dapat mencapai lisis E. dalam beberapa menit atau bahkan detik. Sementara banyak teknik alternatif seperti pembekuan-pencairan memerlukan beberapa putaran pengobatan, lisis ultrasonik membuka sel dalam satu langkah proses.
  • Pengatur suhu: Ultrasonikator canggih dilengkapi dengan sensor suhu dan perangkat lunak pintar, yang memungkinkan untuk mengatur suhu proses maksimum. Ultrasonikator berhenti secara otomatis ketika batas suhu tercapai dan memulai proses sonikasi ketika titik suhu yang ditetapkan tercapai. Mendinginkan sampel dalam penangas es adalah metode sederhana untuk menjaga suhu sampel tetap rendah dan mencegah degradasi sampel yang disebabkan oleh panas.
  • Skalabilitas: Ultrasonikator tipe probe tersedia dalam berbagai ukuran, dari perangkat genggam hingga model industri skala besar. Ini membuatnya cocok untuk memproses volume kecil di laboratorium atau ditingkatkan untuk aplikasi bioproses yang lebih besar, misalnya produksi vaksin atau biosintesis molekul.
  • Fleksibilitas: Ultrasonikator dapat digunakan untuk berbagai aplikasi di luar lisis sel, seperti geser DNA, ekstraksi protein, homogenisasi jaringan, dispersi nanopartikel, dan emulsifikasi. Oleh karena itu, berinvestasi dalam ultrasonikator tipe probe memberikan fleksibilitas dalam penelitian atau pengaturan industri.
  • Ultrasonikator tipe probe seperti UP200St adalah homogenizers jaringan dan penghancur sel yang andal, oleh karena itu banyak digunakan untuk persiapan sampel dalam genetika, misalnya, untuk lisis E.

    Ekstraksi protein dari sel E.dilakukan secara efisien dengan probe ultrasonik UP200St

    Ultrasonikator tipe probe menawarkan banyak keuntungan untuk lisis E.. Kontrol yang andal dan tepat atas parameter proses ultrasonik memungkinkan untuk mengoptimalkan parameter operasi seperti daya, durasi, dan penanganan sampel untuk mencapai hasil yang diinginkan.
     

    Permintaan Informasi




    Perhatikan Kebijakan pribadi.


     

    Tutorial ini menjelaskan jenis sonikator apa yang terbaik untuk tugas persiapan sampel Anda seperti lisis, gangguan sel, isolasi protein, fragmentasi DNA dan RNA di laboratorium, analisis, dan penelitian. Pilih jenis sonikator yang ideal untuk aplikasi Anda, volume sampel, jumlah sampel, dan throughput. Hielscher Ultrasonics memiliki homogenizer ultrasonik yang ideal untuk Anda!

    Cara Menemukan Sonicator Sempurna untuk Gangguan Sel dan Ekstraksi Protein dalam Sains dan Analisis

    Gambar Mini Video

    Fragmentasi DNA ultrasonik sering digunakan sebagai langkah persiapan sampel dalam Next Generation Sequencing (NGS).

    Analisis elektroforesis DNA genom E. EDL933 dikenakan ultrasonikasi 0 – 15 menit. L menunjukkan Tangga DNA.
    (studi dan gambar: ©Basselet et al. 2008)

    Gangguan Sel menggunakan Kavitasi Ultrasonik

    Homogenizers tipe probe ultrasonik beroperasi dengan sekitar 20.000 siklus per detik (pada 20kHz) dan menyebabkan kavitasi dalam cairan atau suspensi. Kavitasi akustik, area mikroskopis dengan tekanan seperti vakum dan suhu tinggi yang memisahkan sel. Meskipun suhu bisa mencapai beberapa ribu derajat Celcius, volume kavitasi sangat kecil sehingga tidak memanaskan proses secara signifikan. Ultrasonografi menghasilkan kavitasi akustik dan gaya geser melubangi atau menghancurkan membran sel sel bakteri seperti E.. Ultrasonikator Hielscher memungkinkan kontrol yang tepat atas parameter proses seperti intensitas ultrasonik, amplitudo, input energi, dan suhu. Dengan demikian, proses lisis ultrasonik dapat disesuaikan secara optimal dengan jenis sel, kultur sel, dan tujuan proses.
     

    Keuntungan dari Ultrasonic Lisis

    • kontrol yang tepat dari lisis (intensitas, amplitudo, suhu)
    • Hasil yang andal dan dapat direproduksi
    • adaptasi yang optimal untuk sampel tertentu
    • pengatur suhu
    • untuk sampel yang sangat besar sangat kecil (uL ke liter)
    • Murni perawatan mekanis
    • Pengoperasian yang ramah pengguna dan aman
    • linear skala-up dari laboratorium ke produksi
    Perangkat Ultrasonik VialTweeter memungkinkan untuk preparasi sample simultan hingga 10 botol di bawah kondisi proses yang sama. (Klik untuk memperbesar!)

    VialTweeter untuk lisis ultrasonik

    Permintaan Informasi




    Perhatikan Kebijakan pribadi.


    Ultrasonic Homogenizer vs Teknik Lisis Lainnya

    Sementara lisis kimia dan enzimatik bisa menjadi masalah – karena lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan memperkenalkan masalah pemurnian dan lisis enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang panjang dan tidak direproduksi – gangguan ultrasonik adalah, sel cepat metode gangguan canggih.
    Lisis ultrasonik didasarkan pada kekuatan mekanik saja. Tidak ada bahan kimia yang ditambahkan, sonikasi memecah dinding sel dengan gaya geser. Lisis kimia dapat mengubah struktur protein dan memperkenalkan masalah pemurnian. Gangguan enzimatik membutuhkan waktu inkubasi yang lama dan tidak dapat direproduksi. Gangguan sel ultrasonik sel bakteri E.cepat, sederhana, andal dan dapat direproduksi. Itulah sebabnya ultrasonikator Hielscher digunakan di laboratorium biologi dan biokimia di seluruh dunia untuk persiapan sampel, pra-ananlitik, diagonstik in-vitro dan tes manifold.

    Rekomendasi Umum untuk Ultrasonic Lysis

    Sonication adalah teknik yang paling populer untuk melisiskan jumlah yang sangat kecil, menengah dan besar suspensi sel – dari pico-liter sampai dengan 100L / jam (menggunakan sel aliran ultrasonik). Sel segaris oleh geser cair dan kavitasi. DNA juga dicukur selama sonikasi, sehingga tidak perlu menambahkan DNase ke suspensi sel.
     

    Kontrol suhu selama lisis E.ultrasonik
    Pengganggu sel ultrasonik UP100H (100W) untuk gangguan sel dan ekstraksi senyawa tanaman.Dengan pra-pendinginan sampel dan menjaga sampel selama sonikasi di atas es, sampel degradasi termal dari sampel dapat dengan mudah dicegah.
    Idealnya, sampel harus disimpan sedingin es selama lisis, tetapi untuk sebagian besar sampel itu cukup jika suhu tidak naik di atas suhu kultur atau sumber jaringan. Oleh karena itu dianjurkan, untuk menjaga suspensi di atas es dan sonikasi dengan beberapa pulsa ultrasonik pendek 5-10 detik dan jeda 10-30 detik. Selama jeda, panas dapat menghilang untuk membangun kembali suhu rendah. Untuk sampel sel yang lebih besar, berbagai reaktor sel aliran dengan jaket pendingin tersedia.
    Baca di sini tips dan rekomendasi terperinci untuk lisis ultrasonik yang sukses!

    Protokol untuk persiapan ultrasonik E. lisat

    Para peneliti menggunakan homogenizers ultrasonik Hielscher untuk gangguan sel E.. Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol yang diuji dan terbukti untuk lisis E.menggunakan homogenizers ultrasonik Hielscher untuk berbagai aplikasi terkait E..
     

    Klip video ini menunjukkan hielscher ultrasonik homogenizer UP100H, ultrasonikator yang banyak digunakan untuk persiapan sampel di laboratorium.

    Homogenizer Ultrasonik UP100H

    Gambar Mini Video

    Pertumbuhan Sel, Crosslinking dan Persiapan Ekstrak Sel E. menggunakan Ultrasonics

    Untuk SeqA dan RNA polimerase CHIP-Chip E. coli MG1655 atau MG1655 ΔseqA ditumbuhkan pada suhu 37 ° C ke OD600 sekitar 0,15 dalam LB 50 ml (+ 0,2% glukosa) sebelum 27 μl formaldehid (37%) per ml ditambahkan (konsentrasi akhir 1%). Crosslinking dilakukan pada pengocokan lambat (100 rpm) pada suhu kamar selama 20 menit diikuti oleh pendinginan dengan 10 ml glycine 2,5 M (konsentrasi akhir 0,5 M). Untuk percobaan sengatan panas, E. coli MG1655 ditanam pada media LB 65 ml pada suhu 30 ° C sampai OD600 sekitar 0,3. Selanjutnya 30 ml kultur dipindahkan ke labu yang sudah dihangatkan sebelumnya pada suhu 43 ° C dan sisanya disimpan pada suhu 30 ° C. Pengikatan silang dan pendinginan seperti dijelaskan di atas kecuali bahwa sel disimpan pada suhu 30 atau 43 ° C selama 5 menit sebelum guncangan lambat lebih lanjut pada suhu kamar. Sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan TBS dingin (pH7.5). Setelah resuspensi dalam buffer lisis 1 ml (10 mM Tris (pH 8,0), sukrosa 20%, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, lisozim 10 mg / ml) dan inkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit diikuti dengan penambahan buffer IP 4 ml, sel-sel disonikasi di atas es dengan istirahat 12 kali 30 detik dan 30 detik menggunakan prosesor ultrasonik Hielscher UP400St pada pengaturan daya 100%. Setelah sentrifugasi selama 10 menit pada 9000 g, 800 μl aliquote supernatan disimpan pada suhu -20 ° C. (Waldminghaus 2010)
     

    Overproduksi dan Pemurnian Enzim dengan Probe Ultrasonik

    Ultrasonicator UP100H adalah homogeniser lab yang sering digunakan untuk persiapan sampel pelat kultur sel.Untuk kelebihan produksi protein yang ditandai decahistidine (His10), E. BL21 (DE3) diubah dengan konstruksi pET19b. Prakultur semalam dipanen dengan sentrifugasi, dan 1% digunakan untuk menginokulasi budaya ekspresi. Sel yang membawa pET19mgtB tumbuh pada 22 ° C sampai kepadatan optik pada 600 nm (OD600) dari 0,7. Kultur dipindahkan ke 17 ° C dan diinduksi oleh 100 μM IPTG. Setelah 16 jam, kultur dipanen dengan sentrifugasi pada 7.500 × g pada suhu 4 ° C. Sel ditangguhkan kembali dalam 50 mM fosfat-buffered saline (PBS) dengan 0,3 M NaCl pada pH 7,4 dan terganggu oleh ultrasonikasi dengan sonotrode mikro-tip S2 di ultrasonikator Hielscher UP200St pada siklus 0,5 dan amplitudo 75%.
    Kelebihan produksi decahistidine-tag GtfC diinduksi pada suhu 37 ° C pada OD600 0,6 dengan 100 pM IPTG. Sel-sel kemudian diinkubasi selama 4 jam, dipanen, dan segaris seperti yang dinyatakan di atas untuk MgtB.
    Ekstrak sel kasar disentrifugasi pada 15.000 × g dan 4 ° C untuk mengendimen puing-puing sel. Ekstrak yang diklarifikasi dimuat pada kolom HisTrap FF Crude 1 ml menggunakan sistem ÄKTAprime Plus. Enzim dimurnikan sesuai dengan protokol produsen untuk elusi gradien protein yang ditandainya. Larutan protein elusi didialisis dua kali terhadap 1.000 volume PBS 50 mM, pH 7,4, dengan NaCl 0,3 M pada 4 ° C. Pemurnian dianalisis oleh 12% SDS-PAGE. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultrasonic ekstraksi protein dari E. bakteri
    Sebuah protein umpan yang menarik (dalam hal ini, MTV1 dari Arabidopsis thaliana) menyatu dengan tag GST dan dinyatakan dalam BL21 Escherichia coli (E. coli) sel.

    1. Ambil satu pelet GST-MTV1 dan GST (sesuai dengan kultur bakteri 50 ml) dan tangguhkan kembali masing-masing dalam buffer ekstraksi es dingin 2,5 mL.
    2. Gunakan ultrasonikator UP100H (dilengkapi dengan MS3 microtip-sonotrode untuk volume kecil sekitar 2-5mL) untuk mengganggu sel-sel bakteri sampai mereka lisis, yang ditunjukkan dengan berkurangnya opacity dan peningkatan viskositas. Ini harus dilakukan di atas es, dan dianjurkan untuk sonikasi dalam interval (misalnya sonikasi 10 detik diikuti oleh jeda 10 detik di atas es dan seterusnya). Perawatan harus diambil untuk tidak sonikasi dengan intensitas terlalu tinggi. Jika berbusa atau pembentukan endapan putih terdeteksi, intensitasnya perlu diturunkan.
    3. Pindahkan larutan bakteri lisis ke tabung mikrosentrifugal 1,5 mL dan centrifuge pada suhu 4 ° C, 16.000 x g selama 20 menit.

     

    Probe ultrasonik menggunakan kekuatan kavitasi akustik untuk mengganggu sel dan mengekstrak molekul dan DNA dari E..

    Probe-jenis ultrasonicators seperti UP400St menggunakan prinsip kerja kavitasi akustik untuk lisis E.yang efisien.

    Analisis Ekspresi dan Pemurnian Protein Rekombinan menggunakan Sonikasi

    Pelet E. disonikasi dengan ultrasonikator Hielscher UP100H. Untuk tujuan ini, pelet sel ditangguhkan kembali dalam buffer lisis dingin (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dan didinginkan di atas es selama 10 menit. Kemudian, suspensi sel disonikasi dengan 10 semburan pendek 10 detik diikuti oleh interval 30 detik untuk pendinginan. Akhirnya, puing-puing sel dihilangkan dengan ultrasentrifugasi pada 4 ° C selama 15 menit pada 14000 rpm. Untuk konfirmasi ekspresi rPR, supernatan dijalankan pada gel poliakrilamida 12% dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan Western blotting. Pemurnian rPR dilakukan dengan menggunakan resin Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) sesuai dengan panduan produsen. Pada tahap ini, metode pemurnian asli digunakan. Kemurnian protein yang dimurnikan dinilai menggunakan elektroforesis pada gel poliakrilamida 12% dan pewarnaan biru Coomassie berikutnya. Konsentrasi protein murni diukur dengan kit uji protein Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Video ini menunjukkan cuphorn ultrasonik 200 watt untuk menyebarkan, homogenisasi, mengekstraksi atau degassing sampel laboratorium.

    Ultrasonik Cuphorn (200 Watt)

    Gambar Mini Video

    Ultrasonik homogenizers untuk E. lisis

    Hielscher Ultrasonics merancang, memproduksi dan memasok homogenizers ultrasonik kinerja tinggi untuk lisis bakteri E. yang andal dan efisien dan jenis sel lainnya, jaringan dan kultur sel.
    Portofolio luas probe ultrasonik serta sistem sonikasi tidak langsung memungkinkan kami untuk menawarkan homogenizer jaringan ultrasonik yang ideal untuk gangguan sel Anda dan aplikasi ekstraksi.

    Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

    Hielscher ultrasonicators dapat dikendalikan dari jarak jauh melalui kontrol browser. Parameter sonikasi dapat dipantau dan disesuaikan secara tepat dengan persyaratan proses.Ultrasonikator Hielscher terkenal dengan standar kualitas dan desain tertinggi. Perangkat lunak cerdas, menu intuitif, pengaturan yang dapat diprogram dan protokol data otomatis hanyalah beberapa fitur ultrasonikator Hielscher. Kekokohan dan pengoperasian yang mudah memungkinkan integrasi ultrasonikator kami yang lancar ke dalam fasilitas penelitian dan bioteknologi. Bahkan kondisi kasar dan lingkungan yang menuntut mudah ditangani oleh ultrasonikator Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikat ISO dan menempatkan penekanan khusus pada ultrasonicators berkinerja tinggi yang menampilkan teknologi canggih dan keramahan pengguna. Tentu saja, ultrasonicators Hielscher sesuai dengan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA dan RoHs.

    Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami:

    Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
    pelat multi-sumur / mikrotiter n.a. UIP400MTP
    CupHorn untuk botol atau gelas kimia n.a. Ultrasonik CupHorn
    reaktor aliran mikro ultrasonik n.a. GDmini2
    hingga 10 botol dengan 0,5 hingga 1,5 mL n.a. VialTweeter
    0.5 untuk 1.5mL n.a. VialTweeter
    1 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
    10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St
    0.1 hingga 20L 0.2 sampai 4L/min UIP2000hdT
    10 sampai 100L 2-10L/min UIP4000
    n.a. 10 sampai 100L/menit UIP16000
    n.a. kristal yang lebbig cluster UIP16000

    Hubungi Kami! / Tanya Kami!

    Meminta informasi lebih lanjut

    Silakan gunakan formulir di bawah ini untuk meminta informasi tambahan tentang homogenizers jaringan ultrasonik dan penghancur sel, aplikasi lisis dan harga. Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda dengan Anda dan menawarkan homogenizer ultrasonik yang memenuhi kebutuhan Anda!









    Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


    Video menunjukkan sistem persiapan sampel ultrasonik UIP400MTP, yang memungkinkan persiapan sampel yang andal dari setiap pelat multi-sumur standar menggunakan ultrasound intensitas tinggi. Aplikasi khas UIP400MTP termasuk lisis sel, DNA, RNA, dan geser kromatin serta ekstraksi protein.

    Ultrasonicator UIP400MTP untuk sonikasi pelat multi-sumur

    Gambar Mini Video

    Protokol Tambahan untuk Ultrasonic E. Lysis

    Allicin-dimodifikasi protein dalam E. menggunakan ultrasonik VialTweeter

    VialTweeter di prosesor ultrasonik UP200STPenentuan Isi sulfhidril oleh 5,5'-Dithiobis (asam 2-nitrobenzoic) (DTNB) Assay
    Kultur semalam E. MG1655 digunakan untuk menginokulasi medium minimal MOPS (1:100). Kultur tumbuh secara aerobik sampai A600 0,4 tercapai. Kultur dibagi menjadi tiga kultur 15 ml untuk pengobatan stres. Budaya yang tidak diobati berfungsi sebagai kontrol negatif. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) atau 1 mM diamida ditambahkan ke salah satu dari dua kultur yang tersisa masing-masing. Kultur diinkubasi selama 15 menit. 5 ml setiap kultur dipanen dengan sentrifugasi (8.525 × g, 4 ° C, 10 menit). Sel dicuci dua kali dengan 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, disimpan secara anaerobik sebelum digunakan) dan disentrifugasi (13.000 × g, 4 ° C, 10 menit). Sel ditangguhkan kembali dalam buffer lisis (PBS dengan 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) sebelum gangguan pada 4 ° C oleh ultrasonikasi (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Jerman) (3 × 1 menit). Puing-puing sel dipellet dengan sentrifugasi (13.000 × g, 4 ° C, 15 menit). Supernatan dipindahkan ke kuvet QS-makro 3,5 ml (10 mm) dengan batang pengaduk magnetik dan dicampur dengan 1 ml buffer lisis. Kepunahan sampel dipantau pada 412 nm dengan spektrofotometer Jasco V-650 yang dilengkapi dengan dudukan sel yang dikontrol suhu PSC-718 pada suhu kamar. 100μl larutan dithiobis 3 mM (asam 2-nitrobenzoat) ditambahkan. Kepunahan dipantau hingga mencapai kejenuhan. Perhitungan konsentrasi tiol dilakukan dengan menggunakan koefisien kepunahan ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 untuk tio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Konsentrasi thiol seluler yang dihitung berdasarkan volume sel E. coli dari 6,7 × 10-15 liter dan kepadatan sel A600 = 0,5 (setara dengan 1 × 108. sel ml-1 budaya). (Müller et al. 2016)
     

    Penentuan In Vivo Glutathione menggunakan Ultrasonic Cell Crusher

    E.MG1655 ditanam dalam medium minimal MOPS dengan volume total 200ml hingga A600 0,5 tercapai. Kultur dibagi menjadi kultur 50 ml untuk pengobatan stres. Setelah 15 menit inkubasi dengan 0,79 mM allicin, 1 mM diamide, atau dimetil sulfoksida (kontrol), sel dipanen pada 4.000g pada suhu 4 ° C selama 10 menit. Sel dicuci dua kali dengan buffer KPE sebelum resuspensi pelet dalam 700μl buffer KPE. Untuk deproteinasi, 300l asam sulfosalisilat 10% (b / v) ditambahkan sebelum gangguan sel dengan ultrasonikasi (3 x 1 menit; VialTweeter Ultrasonikator). Supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi (30 menit, 13,000g, 4 ° C). konsentrasi asam Sulfosalicylic yang menurun menjadi 1% dengan penambahan 3 volume KPE penyangga. Pengukuran total glutathione dan GSSG dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Konsentrasi glutathione seluler yang dihitung berdasarkan volume E. coli sel dari 6,7×10-15 liter dan kepadatan sel A600 0,5 (setara dengan 1×108. sel ml-1 budaya). konsentrasi GSH dihitung dengan pengurangan 2 [GSSG] dari jumlah glutathione. (Müller et al. 2016)

    Ekspresi mAspAT Manusia di E. menggunakan Ultrasonic Homogenizer

    Ultrasonic disruptor sel UP400St (400W) untuk ekstraksi materi intraseluler (misalnya protein, organel, DNA, RNA dll)Single koloni E. coli BL21 (DE3) menyembunyikan vektor ekspresi dalam 30 mL Luria-Bertani (LB) medium yang mengandung 100μg / mL ampisilin, dan kemudian dibudidayakan di 37ºC sampai kepadatan optik (OD600) Mencapai 0,6. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 4000 × g selama 10 menit, dan diresuspensi dalam 3L media LB segar mengandung 100μg / mL ampisilin.
    Selanjutnya, ekspresi protein diinduksi dengan 1 mM isopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) selama 20 jam pada 16ºC. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada 8.000 × g selama 15 menit dan dicuci dengan buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Perkiraan sel 45g (berat basah) diperoleh dari kultur 3 L. Setelah sentrifugasi, pelet sel ditangguhkan kembali dalam 40 mL (untuk kultur 1 L) buffer ekstraksi es dingin A, dan dilisis dengan ultrasonikasi pada suhu dingin es menggunakan penghancur sel ultrasonik Hielscher UP400St. Lisis sel disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan fraksi larut (supernatan) dan endapan (pelet). (Jiang et al. 2015)
     



    Fakta-fakta yang Patut Diketahui

    E. Koli

    Escherichia coli (E. coli) adalah gram-negatif, fakultatif anaerobik, berbentuk batang, bakteri coliform dari genus Escherichia yang umum ditemukan di usus bawah organisme berdarah panas (endoterm). Ada sejumlah besar strain E. coli (atau subtipe) dengan beragam karakteristik. Kebanyakan strain E. coli tidak berbahaya bagi manusia, misalnya strain B dan K-12 yang biasa digunakan untuk aplikasi penelitian di laboratorium. Namun, beberapa strain berbahaya dan bisa menyebabkan penyakit serius.
    E. coli memainkan peran penting dalam rekayasa biologi modern dan mikrobiologi industri karena bakteri mudah untuk memanipulasi. aplikasi laboratorium umum yang melibatkan sering menggunakan E. coli, misalnya untuk membuat asam deoksiribonukleat rekombinan (DNA) atau untuk bertindak sebagai model organisme.
    E. coli adalah tuan rumah yang sangat serbaguna untuk produksi protein heterolog, dan sistem ekspresi protein berjenis tersedia untuk memproduksi protein rekombinan dalam E. coli. Menggunakan plasmid yang memungkinkan ekspresi tingkat tinggi protein, gen dapat diperkenalkan ke dalam bakteri, yang memungkinkan untuk memproduksi protein tersebut dalam jumlah yang tinggi dalam proses fermentasi industri.
    E.digunakan sebagai pabrik sel untuk memproduksi insulin. Aplikasi lebih lanjut termasuk penggunaan sel E. yang dimodifikasi untuk mengembangkan dan memproduksi vaksin dan enzim amobil, untuk menghasilkan biofuel, serta untuk bioremediasi.
    Strain K-12 adalah bentuk mutan E. coli yang over-mengekspresikan enzim Alkaline Phosphatase (ALP). Mutasi ini terjadi karena cacat pada gen yang terus-menerus kode untuk enzim. Jika gen menghasilkan produk tanpa hambatan apa pun ini dikenal sebagai aktivitas konstitutif. mutan spesifik ini digunakan untuk isolasi dan pemurnian enzim ALP.
    Bakteri E. juga banyak digunakan sebagai pabrik sel. Mikroba rekayasa (misalnya, bakteri) dan sel tumbuhan dapat digunakan sebagai apa yang disebut pabrik sel. Sel-sel yang dimodifikasi secara genetik ini menghasilkan molekul, bahan kimia, polimer, protein, dan zat lainnya, yang digunakan misalnya dalam industri farmasi, makanan, dan kimia. Untuk melepaskan molekul yang diproduksi di bagian dalam sel bioengineered tersebut, lisis ultrasonik adalah metode umum untuk mengganggu dinding sel dan untuk mentransfer zat target ke dalam cairan di sekitarnya. Baca lebih lanjut tentang lisis sel bioengineered!

    Ultrasonic DNA Shearing

    Gaya geser ultrasonik adalah metode yang umum digunakan untuk melepaskan molekul, organel dan protein dari interior sel serta untuk memecah untaian DNA menjadi beberapa bagian. Kavitasi akustik memecah dinding sel dan membran untuk mengekstrak DNA dari sel dan menghasilkan fragmen sekitar 600 – 800 bp panjang, yang sangat ideal untuk analisis.
    Klik di sini untuk mempelajari lebih lanjut tentang homogenizers ultrasonik untuk fragmentasi DNA!

    Literatur/referensi


    Ultrasonik kinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup spektrum penuh dari ultrasonicator laboratorium kompak di atas unit bench-top hingga sistem ultrasonik industri penuh.

    Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizers ultrasonik kinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.


    Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda.

    Mari kita hubungi.