Lisis Ultrasonik Sel Biorekayasa dalam Produksi Industri

Spesies bakteri rekayasa hayati seperti E. serta jenis sel mamalia dan tumbuhan yang dimodifikasi secara genetik digunakan secara luas dalam bioteknologi untuk mengekspresikan molekul. Untuk melepaskan bio-molekul yang disintesis ini, diperlukan teknik gangguan sel yang andal. Ultrasonikasi kinerja tinggi adalah metode yang terbukti untuk lisis sel yang efisien dan andal – Mudah diskalakan ke throughput besar. Hielscher Ultrasonics menawarkan peralatan ultrasonik berkinerja tinggi untuk lisis sel yang efektif untuk menghasilkan bio-molekul berkualitas tinggi dalam jumlah besar.

Ekstraksi Molekul dari Pabrik Sel

Untuk produksi berbagai biomolekul, berbagai mikroba rekayasa dan sel tumbuhan dapat digunakan sebagai pabrik sel mikroba, termasuk Escherichia, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana dan ganggang, di antara banyak lainnya. Pabrik sel ini dapat menghasilkan protein, lipid, biokimia, polimer, biofuel, dan oleokimia, yang digunakan sebagai makanan atau bahan baku untuk aplikasi industri. Sel yang digunakan sebagai pabrik sel dibiakkan dalam bioreaktor tertutup, di mana mereka dapat mencapai efisiensi tinggi, spesifisitas, dan kebutuhan energi yang rendah.
Untuk mengisolasi molekul target dari kultur sel yang direkayasa secara biologis, sel-sel harus diganggu sehingga bahan intraseluler dilepaskan. Pengganggu sel ultrasonik sudah mapan sebagai teknik yang sangat andal dan efisien untuk disintegrasi sel dan pelepasan senyawa.

Pabrik sel mikroba adalah sel yang direkayasa secara metabolik yang digunakan untuk sintesis berbagai senyawa berharga. Gangguan sel ultrasonik adalah metode yang efisien dan andal untuk melepaskan senyawa berharga dari bagian dalam sel.
studi dan grafik: ©Villaverde, 2010.

Keuntungan dari Pengganggu Sel Ultrasonik

Sebagai teknologi non-termal, ringan, namun sangat efisien, pengganggu ultrasonik digunakan di laboratorium dan industri untuk melisiskan sel dan untuk menghasilkan ekstrak berkualitas tinggi, misalnya digunakan untuk isolasi molekul dari pabrik sel.

Power-Ultrasound untuk Gangguan Pabrik Sel Mikroba yang Efisien

Mekanisme dan Efek Pengganggu Sel Ultrasonik:
Gangguan sel ultrasonik menggunakan kekuatan gelombang ultrasound. Homogenizer ultrasonik / pengganggu sel dilengkapi dengan probe (alias sonotrode) yang terbuat dari paduan titanium yang berosilasi pada frekuensi tinggi sekitar 20 kHz. Ini berarti probe ultrasonik memasangkan 20.000 getaran per detik ke dalam cairan sonikasi. Gelombang ultrasound yang digabungkan ke dalam cairan ditandai dengan siklus tekanan tinggi / tekanan rendah yang bergantian. Selama siklus tekanan rendah, cairan mengembang dan gelembung vakum kecil muncul. Gelembung-gelembung yang sangat kecil ini tumbuh melalui beberapa siklus tekanan bergantian sampai mereka tidak dapat menyerap energi lebih lanjut. Pada titik ini, gelembung kavitasi meledak dengan keras dan menciptakan lingkungan padat energi yang luar biasa secara lokal. Fenomena ini dikenal sebagai kavitasi akustik dan ditandai dengan suhu lokal yang sangat tinggi, tekanan yang sangat tinggi, dan gaya geser. Tegangan geser ini memecahkan dinding sel secara efisien dan meningkatkan perpindahan massa antara interior sel dan pelarut di sekitarnya. Sebagai teknik mekanis murni, gaya geser yang dihasilkan secara ultrasonik banyak digunakan dan prosedur yang direkomendasikan untuk gangguan sel bakteri, serta untuk isolasi protein. Sebagai metode gangguan sel yang sederhana dan cepat, sonikasi sangat ideal untuk isolasi volume berukuran kecil, sedang dan besar. Ultrasonicator digital Hielscher dilengkapi dengan menu pengaturan yang jelas untuk kontrol sonikasi yang tepat. Semua data sonikasi secara otomatis disimpan pada kartu SD bawaan dan mudah diakses. Pilihan canggih pembuangan panas seperti pendinginan eksternal, sonikasi dalam mode pulsa dll. selama proses disintegrasi ultrasonik memastikan pemeliharaan suhu proses yang ideal dan dengan demikian keutuhan senyawa sensitif panas yang diekstraksi.

Penelitian Menggarisbawahi Kekuatan Gangguan dan Ekstraksi Sel Ultrasonik

Prof. Chemat et al. (2017) melanjutkan dalam studi mereka bahwa "ekstraksi dengan bantuan ultrasound adalah alternatif yang ramah lingkungan dan layak secara ekonomis untuk teknik konvensional untuk makanan dan produk alami. Manfaat utamanya adalah pengurangan waktu ekstraksi dan pemrosesan, jumlah energi dan pelarut yang digunakan, operasi unit, dan CO₂ emisi."
Gabig-Ciminska et al. (2014) menggunakan homogenizer bertekanan tinggi dan dsintegrator sel ultrasonik dalam studi mereka untuk lisis spora untuk melepaskan DNA. Membandingkan kedua metode gangguan sel, tim peneliti menyimpulkan bahwa mengenai lisis sel untuk DNA spora, "analisis telah dilakukan dengan menggunakan lisat sel dari homogenisasi tekanan tinggi. Setelah itu, kami menyadari bahwa gangguan sel ultrasonik memiliki keuntungan luar biasa untuk tujuan ini. Ini agak cepat dan dapat diproses untuk volume sampel kecil." (Gabig-Ciminska dkk., 2014)

Biomolekul dari Pabrik Sel untuk Produksi Makanan

Pabrik sel mikroba adalah metodologi produksi yang layak dan efisien menggunakan organisme mikroba untuk menghasilkan hasil tinggi metabolit asli dan non-asli dengan rekayasa bio metabolik mikroorganisme mikroba seperti bakteri, ragi, jamur, dll. Enzim curah misalnya diproduksi menggunakan mikroorganisme seperti Aspergillus oryzae, jamur, dan bakteri. Enzim curah tersebut digunakan untuk produksi makanan dan minuman, serta dalam pertanian, bioenergi dan perawatan rumah tangga.
Bakteri tertentu seperti Acetobacter xylinum dan Gluconacetobacter xylinus menghasilkan selulosa selama proses fermentasi, di mana serat nano disintesis dalam proses bottom-up. Selulosa bakteri (juga dikenal sebagai selulosa mikroba) secara kimiawi setara dengan selulosa tanaman, tetapi memiliki tingkat kristalinitas yang tinggi dan kemurnian tinggi (bebas dari lignin, hemiselulosa, pektin, dan komponen biogenik lainnya) serta struktur unik jaringan retikulasi tiga dimensi (3D) yang ditenun serat nano selulosa. (lih. Zhong, 2020) Dibandingkan dengan selulosa yang berasal dari tumbuhan, selulosa bakteri lebih berkelanjutan dan selulosa yang dihasilkan murni tidak memerlukan langkah pemurnian yang rumit. Ultrasonikasi dan ekstraksi pelarut menggunakan NaOH atau SDS (sodium dodecyl sulfate) sangat efektif untuk isolasi selulosa bakteri dari sel bakteri.

Biomolekul dari Pabrik Sel untuk Produksi Farmasi dan Vaksin

Salah satu produk farmasi paling menonjol yang berasal dari pabrik sel adalah insulin manusia. Untuk produksi insulin rekayasa hayati, sebagian besar E. dan Saccharomyces cerevisiae digunakan. Karena molekul berukuran nano yang disintesis secara bio menawarkan biokompatibilitas yang tinggi, nanopartikel biologis seperti feritin menguntungkan untuk berbagai aplikasi biomanufaktur. Selain itu, produksi mikroba yang direkayasa secara metabolik seringkali secara signifikan lebih berkhasiat dalam hasil yang diperoleh. Misalnya, produksi asam artemisiin, resveratrol dan likopen telah meningkat sepuluh kali lipat menjadi beberapa ratus kali lipat, dan sudah mapan atau sedang dalam pengembangan untuk produksi skala industri. (lih. Liu et al.; Mikrob. Fakta Sel. 2017)
Misalnya, biomolekul berukuran nano berbasis protein dengan sifat perakitan sendiri seperti feritin dan partikel mirip virus sangat menarik untuk pengembangan vaksin karena meniru ukuran dan struktur patogen dan dapat menerima konjugasi permukaan antigen untuk meningkatkan interaksi dengan sel kekebalan tubuh. Molekul tersebut diekspresikan dalam apa yang disebut pabrik sel (misalnya, strain E. yang direkayasa), yang menghasilkan molekul target tertentu.

Protokol untuk Lisis Ultrasonik dan E. BL21 untuk Pelepasan Ferritin

Ferritin adalah protein, yang fungsi utamanya adalah penyimpanan zat besi. Ferritin menunjukkan kemampuan yang menjanjikan sebagai nanopartikel rakitan sendiri dalam vaksin, di mana ia digunakan sebagai kendaraan pengiriman vaksin (misalnya protein lonjakan SARS-Cov-2). Penelitian ilmiah Sun et. al. (2016) menunjukkan bahwa feritin rekombinan dapat dilepaskan sebagai bentuk larut dari Escherichia pada konsentrasi NaCl rendah (≤50 mmol/L). Untuk mengekspresikan feritin dalam E. BL21 dan melepaskan ferrtin, protokol berikut berhasil diterapkan. Plasmid rekombinan pET-28a/ferritin diubah menjadi strain E BL21 (DE3). Sel ferritin E BL21 (DE3) dikultur dalam media pertumbuhan LB dengan kanamisin 0,5% pada suhu 37°C dan diinduksi pada OD600 0,6 dengan isopropil-β-D-thiogalactopyranoside 0,4% selama 3 jam pada suhu 37°C. Kultur akhir kemudian dipanen dengan sentrifugasi pada 8000g selama 10 menit pada suhu 4°C, dan pelet dikumpulkan. Kemudian, pelet disuspensi kembali dalam media LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrak ragi)/buffer lisis (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) dan konsentrasi larutan NaCl yang berbeda (0, 50, 100, 170, dan 300 mmol/L), masing-masing. Untuk lisis sel bakteri, sonikasi diterapkan dalam mode pulsa: misalnya, menggunakan Ultrasonicator UP400St pada amplitudo 100% dengan siklus kerja 5 detik ON, 10 detik OFF, selama 40 siklus) dan kemudian disentrifugasi pada 10 000g selama 15 menit pada 4°C. Supernatan dan endapan dianalisis dengan elektroforesis gel natrium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Semua gel bernoda natrium dodecyl sulfat dipindai dengan pemindai resolusi tinggi. Gambar gel dianalisis menggunakan perangkat lunak Magic Chemi 1D. Untuk kejelasan yang optimal, pita protein dideteksi dengan menyesuaikan parameter. Data untuk pita dihasilkan dari tiga kali lipat teknis. (lih. Sun et al., 2016)

Pengganggu Sel Ultrasonik untuk Lisis Industri Pabrik Sel

Lisis dan ekstraksi ultrasonik adalah metode yang andal dan nyaman untuk melepaskan metabolit dari pabrik sel sehingga membantu produksi molekul target yang berkhasiat. Pengganggu sel ultrasonik tersedia dari laboratorium hingga ukuran industri dan proses dapat diskalakan sepenuhnya linier.
Hielscher Ultrasonics adalah mitra Anda yang kompeten untuk pengganggu ultrasonik berkinerja tinggi dan memiliki pengalaman lama di bidang menanamkan sistem ultrasonik di pengaturan bench-top dan industri.
Dalam hal perangkat keras dan perangkat lunak yang canggih, sistem gangguan sel Hielscher Ultrasonics memenuhi semua persyaratan untuk kontrol proses yang optimal, pengoperasian yang mudah, dan keramahan pengguna. Pelanggan dan pengguna ultrasonicators Hielscher menghargai manfaat bahwa pengganggu dan ekstraktor sel ultrasonik Hielscher memungkinkan pemantauan dan kontrol proses yang tepat – melalui layar sentuh digital dan remote control browser. Semua data sonikasi penting (misalnya energi bersih, energi total, amplitudo, durasi, suhu, tekanan) secara otomatis disimpan sebagai file CSV pada kartu SD terintegrasi. Ini membantu untuk mendapatkan hasil yang dapat direproduksi dan berulang dan memfasilitasi standarisasi proses serta pemenuhan Good Manufacturing Practices (cGMP).
Tentu saja, prosesor ultrasonik Hielscher dibuat untuk operasi 24/7 di bawah beban penuh dan oleh karena itu dapat dioperasikan dengan andal dalam pengaturan produksi industri. Karena kekokohan yang tinggi dan perawatan yang rendah, waktu henti peralatan ultrasonik sangat rendah. Fitur CIP (clean-in-place) dan SIP (sterilize-in-place) meminimalkan pembersihan yang melelahkan, terutama karena semua bagian basah adalah permukaan logam yang halus (tidak ada lubang atau nozel tersembunyi).

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami: