Pemotongan DNA dengan Gaya Geser Ultrasonik

Selama pemotongan DNA dan RNA dengan gaya geser, molekul DNA panjang difragmentasi menjadi potongan yang lebih kecil, suatu langkah penting dalam penyiapan sampel untuk pembuatan pustaka sekuensing generasi berikutnya (NGS). Pemotongan DNA dengan gaya geser ultrasonik memanfaatkan gaya kavitasi akustik untuk memecah DNA atau RNA menjadi fragmen berukuran 100 bp hingga 5 kb. Metode ini memungkinkan pengendalian ukuran fragmen secara presisi, sehingga panjang DNA dapat disesuaikan dengan kebutuhan untuk memperoleh hasil sekuensing yang optimal.

Pemotongan DNA dengan Gaya Geser Menggunakan Ultrasonikasi

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi berbasis ultrasonik untuk pemotongan DNA, RNA, dan kromatin dengan gaya geser. Pilih ultrasonikator tipe probe (misalnya UP100H) untuk sonikasi langsung menggunakan ujung mikro, atau gunakan VialTweeeter atau cuphorn ultrasonik untuk penyiapan DNA secara tidak langsung dari berbagai sampel secara bersamaan. Hielscher menawarkan perangkat yang ideal dengan mempertimbangkan kebutuhan Anda: baik Anda memiliki 1 maupun hingga 10 sampel, dengan volume mulai dari mikroliter hingga liter – sonikator Hielscher akan memenuhi kebutuhan Anda untuk menyiapkan fragmen DNA, RNA, dan kromatin dengan panjang yang tepat. Reprodusibilitas, pengoperasian yang mudah, dan pengendalian yang presisi memungkinkan pembuatan pustaka yang andal untuk sekuensing generasi berikutnya.
Berbeda dengan fragmentasi DNA secara enzimatis, pemotongan dengan gaya geser ultrasonik menerapkan gaya geser mekanis murni tanpa penambahan bahan kimia apa pun. Dengan pengaturan parameter proses yang presisi, pemotongan dengan gaya geser ultrasonik menghasilkan fragmen DNA berbobot molekul tinggi (DNA plasmid dan genomik).
Asam nukleat yang telah dimurnikan dapat diamplifikasi sebelum atau sesudah tahap fragmentasi.
Parameter sonikasi (daya, siklus pulsa / rentetan pulsa, waktu, dan suhu) dapat dikendalikan dengan aman melalui pengaturan perangkat lunak.

Protokol Pemotongan DNA dengan Gaya Geser Ultrasonik

Untuk Uji Imunopresipitasi Kromatin

Secara singkat, sel ditanam dalam cawan berdiameter 60mm (400.000 per cawan) dan ditransfeksi dengan siRNA RhoA (seperti yang dijelaskan); setelah 72 h, sel diinkubasi dengan formaldehida (konsentrasi akhir, 1%) selama 10 min pada 37°C untuk membentuk ikatan silang antara protein dan DNA. Reaksi pengikatan silang dihentikan dengan penambahan glisin 1,25 mol/L sebanyak sepersepuluh volume, sehingga menghasilkan konsentrasi akhir 125 mmol/L. Sel dicuci dua kali dengan PBS sedingin es, disuspensikan kembali dalam bufer uji radioimunopresipitasi [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] yang mengandung 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/mL aprotinin, dan 1 Ag/mL pepstatin A, lalu disimpan di atas es selama 30 min. Selanjutnya, lisat sel disonikasi di atas es menggunakan sonikator ultrasonik Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitudo 40%, siklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hingga kromatin berikatan silang terpotong oleh gaya geser dan menghasilkan fragmen DNA berukuran antara 200 dan 1.000 bp. Sepersepuluh dari keseluruhan lisat digunakan untuk menguantifikasi jumlah DNA yang terdapat dalam berbagai sampel dan dianggap sebagai “DNA masukan total”. Supernatan diinkubasi dengan suspensi 50% DNA sperma salmon/protein agarosa untuk mengurangi latar belakang nonspesifik. Imunopresipitasi kemudian dilakukan semalaman pada 4°C dengan 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) atau tanpa antibodi (kontrol negatif). Supernatan ini ditambah dengan NaCl 5 mol/L dan dipanaskan semalaman pada 65°C untuk membalikkan pembentukan ikatan silang protein-DNA. Imunokompleks selanjutnya diberi perlakuan dengan proteinase K bebas DNase dan RNase, dan DNA dimurnikan melalui ekstraksi fenol/kloroform serta presipitasi etanol. PCR dilakukan dengan primer spesifik yang sesuai dengan sekuens dalam wilayah promotor gen iNOS manusia (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi ekspresi EGFP

Untuk studi ekspresi, galur rekombinan L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Jerman) dengan gen EGFP (protein fluoresen hijau yang ditingkatkan), yang terintegrasi pada ssu kromosomal, dikultur dalam berbagai media seperti yang dijelaskan sebelumnya dan diberi tambahan 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Jerman). Selama kultivasi, sampel sebanyak 1 ml diambil, disentrifugasi (2000 × g, 20°C, 10 min), dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9%. Pelet disuspensikan kembali dalam bufer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dan didisintegrasi melalui sonikasi dengan prosesor ultrasonik UP400S (pemberian energi ∼ 400 Ws). Debris sel disingkirkan melalui sentrifugasi (6000 × g, 4°C, 5 min) dan dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamida–natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE) dalam kondisi reduksi menurut metode Laemmli (1970) menggunakan gel poliakrilamida 12,5%. Ekspresi EGFP diperiksa dalam kultur yang diagitasi. (Fritsche et al. 2007)

Imunopresipitasi kromatin

Uji imunopresipitasi kromatin dilakukan menggunakan ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, AS) sesuai petunjuk produsen dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, podosit manusia yang telah berdiferensiasi diberi perlakuan pengikatan silang dengan formaldehida 1% selama 10 min pada suhu ruang. Sel dicuci dengan PBS sedingin es dan reaksi fiksasi dihentikan dengan menambahkan glisin 0,125 M selama 5 min pada suhu ruang. Sel dicuci kembali dengan PBS sedingin es dan dikerok dari cawan. Sel diendapkan menjadi pelet melalui sentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam bufer lisis. Setelah sentrifugasi, inti sel yang mengendap disuspensikan kembali dalam bufer pemotongan dengan gaya geser, diinkubasi di atas es selama 30 min, dan kromatin dipotong dengan gaya geser melalui sonikasi, misalnya menggunakan UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Jerman) pada daya 25% dengan 5 pulsa masing-masing selama 20 sec di atas es menjadi fragmen berukuran sekitar 200–600 bp. Kromatin yang telah dipotong dengan gaya geser kemudian disentrifugasi dan supernatannya dikumpulkan. Untuk imunopresipitasi, 60 μl kromatin diinkubasi dengan 1 μg antibodi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AS), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Britania Raya) atau NF-κB p50 (Abcam), atau dengan IgG kelinci (Zymed Laboratories) sebagai kontrol negatif, semalaman pada 4°C dengan rotasi perlahan. Imunokompleks yang terikat pada manik magnetik dikumpulkan menggunakan dudukan magnetik, dicuci secara menyeluruh, lalu pembentukan ikatan silang protein/DNA dibalikkan dan DNA dielusi untuk analisis PCR waktu nyata. (Ristola et al. 2009)

Penyiapan DNA EHEC untuk analisis larik cip

Penyiapan lisat sel dan DNA hasil ekstraksi
Pelet bakteri yang disuspensikan dalam PBS hingga konsentrasi akhir yang diinginkan diberi perlakuan dengan disruptor ultrasonik UP100H (Hielscher GmbH, Jerman) yang dilengkapi ujung mikro MS1 (berdiameter 1mm). Frekuensi pengoperasian adalah 30 kHz dan daya keluaran efektif adalah 100 W. Selama pengoperasian, sampel didinginkan dalam penangas air es, dicampur, dan disentrifugasi. Sampel digunakan untuk studi sitometri alir, sedangkan untuk penanganan selanjutnya, sampel diberi perlakuan panas (95°C, 5 min). Lisat sel kasar diproses dengan campuran fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1). Campuran ini ditambahkan ke sampel lisat dengan volume yang sama, larutan divorteks kuat selama 15 s dan disentrifugasi pada 15.000 x g selama 2 min pada suhu ruang (RT) sekitar 22°C. Fase air bagian atas yang mengandung DNA genomik dipisahkan dengan hati-hati dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf steril yang baru.
Selanjutnya, sampel disonikasi untuk memfragmentasi DNA. Tahap sonikasi dilakukan dalam kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas. Untuk mengevaluasi efek fragmentasi pada DNA genomik, sampel dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa.
(…) Sampel yang sebelumnya disonikasi selama 2,5 min menjalani tahap ekstraksi setelah perlakuan panas dan sentrifugasi. DNA yang dilepaskan diekstraksi dua kali dengan campuran fenol:kloroform:isoamil alkohol, kemudian menjalani sonikasi kedua selama 0 – 15 min. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menentukan distribusi ukuran DNA yang mengalami fragmentasi ultrasonik setelah ekstraksi (Gbr. di sisi kanan atas). DNA yang sangat terfragmentasi terlihat jelas dari adanya sapuan DNA alih-alih pita berbobot molekul tinggi yang hilang dari sampel yang disonikasi selama 2,5 min atau lebih. Sonikasi yang lebih lama secara bertahap mengurangi panjang fragmen menjadi sekitar 150 – 600 bp, dan sonikasi selama 15 min mendegradasi fragmen ini lebih lanjut, sebagaimana terutama terlihat pada bagian atas sapuan. Dengan demikian, ukuran rata-rata fragmen DNA secara bertahap menurun seiring waktu ultrasonikasi, dan perlakuan selama 5 min memungkinkan diperolehnya ukuran fragmen DNA yang paling sesuai untuk uji larik cip. Akhirnya, ditetapkan prosedur penyiapan analit DNA yang mencakup perlakuan ultrasonik awal selama 2 min, ekstraksi DNA (2×), dan sonikasi lanjutan selama 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunopresipitasi Kromatin (ChIP)

Sel HEK293 dikultur seperti yang dijelaskan di atas dan difiksasi dengan disuksinimidil glutarat 2 mM selama 45 min pada suhu ruang. Selanjutnya, sel dicuci dua kali dengan PBS. Kromatin diberi perlakuan pengikatan silang selama 10 min pada suhu ruang menggunakan formaldehida 1% (v/v) dan dicuci dua kali dengan PBS sedingin es. Reaksi pengikatan silang dihentikan melalui inkubasi dengan glisin pada konsentrasi akhir 0,125 M selama 5 min pada suhu ruang. Setelah inkubasi dengan tripsin, sel dikerok dari cawan kultur sel dan dicuci dua kali dengan PBS. Pelet sel disuspensikan kembali dalam bufer lisis (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl, dan 0,5% (v/v) Nonidet P-40), diinkubasi di atas es selama 10 min, dan dihomogenisasi dengan homogenizer Dounce. Selanjutnya, inti sel diendapkan melalui sentrifugasi (3500 x g, 5 min, 4 °C) dan disuspensikan kembali dalam bufer inti sel (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, dan 1% (w/v) SDS). Inti sel didisrupsi melalui sonikasi dengan tiga pulsa berdurasi 20-s dalam sonikator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pada pengaturan siklus 0,5 dan amplitudo 30%, sehingga menghasilkan fragmen DNA genomik dengan sebagian besar berukuran 200 – 1000 bp. Untuk ChIP, 50g DNA diencerkan 4 kali dalam bufer imunopresipitasi (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, dan 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analisis modifikasi histon melalui imunopresipitasi kromatin (ChIP)

Secara singkat, 6 x 10⁶ sel dicuci dua kali dengan PBS dan diberi perlakuan pengikatan silang pada pelat kultur selama 15 min pada suhu ruang dengan adanya formaldehida 0,5%. Reaksi pengikatan silang dihentikan dengan menambahkan glisin 0,125 M. Semua tahap selanjutnya dilakukan pada 48°C. Semua bufer didinginkan terlebih dahulu dan mengandung inhibitor protease (Complete Mini, Roche). Sel dicuci dua kali dengan PBS lalu dikerok. Pelet yang terkumpul dilarutkan dalam 1 ml bufer lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dan disonikasi dalam penangas etanol dingin selama 10 siklus pada amplitudo 100% menggunakan sonikator UP50H (Hielscher, Teltow, Jerman). Fragmentasi kromatin divisualisasikan dalam gel agarosa 1%. Fragmen yang diperoleh berada dalam rentang 200–500pb. Kromatin terlarut diperoleh dengan menyentrifugasi sampel yang telah disonikasi pada 14.000g selama 10 min pada 48°C. Fraksi terlarut diencerkan 1/10 dalam bufer pengenceran (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), lalu dibagi menjadi alikuot dan disimpan pada 80°C hingga digunakan. (Rodriguez et al. 2008)