Teknologi ultrasound Hielscher

Ultrasonic DNA Shearing

  • Selama DNA dan RNA geser, molekul DNA yang rusak menjadi potongan kecil. DNA fragmentasi / RNA adalah salah satu contoh langkah-langkah persiapan penting yang dibutuhkan membuat perpustakaan untuk generasi berikutnya sequencing (NGS).
  • Ultrasonic DNA geser menggunakan kekuatan kavitasi akustik untuk memecahkan DNA atau RNA menjadi potongan-potongan dari 100 – 5kb BP.
  • geser ultrasonik memungkinkan untuk fragmentasi DNA yang tepat dan penyesuaian panjang DNA yang diinginkan.

Ultrasonic DNA Shearing

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi berbasis USG untuk DNA, RNA dan kromatin geser. Pilih antara probe tipe ultrasonicators (misalnya UP100H) untuk sonication langsung menggunakan microtip, atau gunakan VialTweeeter atau cuphorn ultrasonik untuk persiapan DNA tidak langsung dari berbagai sampel secara bersamaan. Hielscher menawarkan perangkat yang ideal mengingat kebutuhan Anda: apakah anda memiliki 1 atau sampai dengan 10 sampel, volume dari mikroliter volume liter – Prosesor ultrasonik Hielscher tersedia untuk memenuhi kebutuhan Anda untuk mempersiapkan DNA, RNA dan kromatin fragmen di panjang yang tepat. Reproduktifitas, pengoperasian yang mudah dan kontrol yang tepat memungkinkan untuk perpustakaan dapat diandalkan untuk generasi sekuensing.
Berbeda dengan fragmentasi DNA enzimatik, geser ultrasonik berlaku gaya geser mekanik murni tanpa menambahkan bahan kimia apapun. Dengan pengaturan yang tepat dari parameter proses, geser ultrasonik menghasilkan molekul fragmen DNA berat badan tinggi (plasmid dan DNA genom).
asam nukleat dimurnikan dapat diperkuat sebelum atau setelah langkah fragmentasi.
parameter sonikasi (listrik, siklus pulsa / semburan, waktu dan suhu) dapat dikontrol dengan aman melalui pengaturan perangkat lunak.

Keuntungan:

  • prngontrolan yang tepat
  • siklus sonikasi dan waktu tepat disesuaikan dengan ukuran DNA yang diinginkan
  • molekul fragmen DNA berat badan tinggi
  • pengatur suhu
  • Cepat
  • Hasil yang dapat digandakan
  • AUTOCLAVABLE
  • berbagai solusi: Probe-jenis, VialTweeter dan CupHorn

Protokol untuk Ultrasonic DNA Shearing

Untuk kromatin Immunoprecipitation Assay

Secara singkat, sel dilapisi dengan piring berdiameter 60mm (400.000 per piring) dan transfected dengan RhoA siRNA (seperti yang dijelaskan); setelah 72 jam, mereka diinkubasi dengan formaldehida (konsentrasi akhir, 1%) selama 10 menit pada suhu 37 ° C hingga protein cross-link ke DNA. Reaksi penghubung silang dipadamkan dengan penambahan volume sepersepuluh 1,25 mol / L glisin, memberikan konsentrasi akhir 125 mmol / L. Sel dicuci dua kali dengan PBS es dingin, disuspensikan kembali dalam buffer uji radioimunopresipitasi [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] yang mengandung 1 mmol / L fenilmetilulfonil fluorida, 1 apopinin Ag / mL, dan 1 Ag / mL pepstatin A, dan disimpan di es selama 30 menit. Kemudian, lysate sel disiram dengan es dengan a Hielscher UP200S USG sonikator (3 x 40 s, amplitudo 40%, siklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) sampai chromatins silang yang dicukur untuk menghasilkan fragmen DNA antara 200 dan 1.000 bp. Sepersepuluh dari seluruh lisat digunakan untuk quantitate jumlah yang hadir DNA dalam sampel yang berbeda dan dianggap sebagai “Total DNA masukan”. Supernatan diinkubasi dengan salmon sperma DNA / protein agarose-50% bubur untuk mengurangi latar belakang spesifik. Immunoprecipitation kemudian dilakukan semalam pada suhu 4 ° C dengan 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) atau tanpa antibodi (kontrol negatif). supernatan tersebut dilengkapi dengan 5 mol / L NaCl dan dipanaskan semalam pada 65 ° C untuk kembali protein-DNA cross-link. The immunocomplexes yang lebih diobati dengan DNase- dan RNase bebas proteinase K, dan DNA dimurnikan dengan fenol / ekstraksi kloroform dan curah hujan etanol. PCR dilakukan dengan primer spesifik sesuai dengan urutan dalam wilayah promotor gen iNOS manusia (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi EGFP-ekspresi

Untuk studi ekspresi, rekombinan galur L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Jerman) dengan gen untuk EGFP (Enhanced Hijau Fluorescent Protein), kromosom SSU terintegrasi, yang dibudidayakan di berbagai media seperti yang dijelaskan sebelumnya dan juga dilengkapi dengan 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Jerman). Selama budidaya, 1 ml sampel diambil, disentrifugasi (2000 × g, 20 ° C, 10 menit) dan dicuci dengan 0,9% larutan NaCl. Pelet disuspensikan dalam buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dan hancur oleh selanjutnya disonikasi dengan prosesor ultrasonik UP400S (Aplikasi energi ~ 400 Ws). puing-puing sel dihilangkan dengan sentrifugasi (6000 × g, 4 ° C, 5 menit) dan dianalisis dengan sodium dodesil sulfat - poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) di bawah kondisi mengurangi sesuai dengan metode Laemmli (1970) dengan 12,5% gel polyacralamide . EGFP ekspresi diperiksa dalam budaya gelisah. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Elektroforesis analisis DNA genom E. coli EDL933 mengalami 0-15 menit ultrasonication. L menunjukkan Tangga DNA. (Basselet et al. 2008)

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


kromatin immunoprecipitation

Ultrasonic disruptor sel UP100H (100W) untuk lisis, gangguan sel dan geser DNA.Uji kromatin immunoprecipitation dilakukan dengan menggunakan CHIP-ITTm Mengekspresikan (Motif Aktif, Carlsbad, CA, USA) sesuai dengan instruksi produsen dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, podocytes manusia dibedakan adalah cross-linked dengan 1% formaldehida selama 10 menit pada suhu kamar. Sel dicuci dengan PBS dingin dan reaksi fiksasi dihentikan dengan menambahkan 0,125 M glisin selama 5 menit pada suhu kamar. Sel dicuci lagi dengan PBS dingin dan tergores dari piring. Sel pellet dengan sentrifugasi dan resuspended dalam buffer lisis. Setelah sentrifugasi, inti pellet yang disuspensikan dalam buffer geser, diinkubasi pada es selama 30 menit dan kromatin itu dicukur dengan sonikasi, misalnya UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Jerman) dengan kekuatan 25% 5 pulsa masing-masing 20 detik pada es menjadi fragmen sekitar 200-600 bp. Kromatin yang dicukur kemudian disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan. Untuk imunopresipitasi, 60 μl kromatin diinkubasi dengan 1 μg antibodi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) atau NF-κB p50 (Abcam) atau dengan kelinci IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, AS), sebagai kontrol negatif, bermalam pada suhu 4 ° C dengan rotasi lembut. Immunocomplexes yang terikat pada manik-manik magnetik dikumpulkan menggunakan magnetis, dicuci secara ekstensif, dan ikatan silang protein / DNA dibalik dan DNA dielusi untuk analisis PCR real-time. (Ristola et al., 2009)

persiapan DNA EHEC untuk analisis Chip array yang

Penataan lisat sel dan DNA diekstraksi
pelet bakteri tersuspensi dalam PBS untuk konsentrasi akhir yang diinginkan diobati dengan USG pengganggu UP100H (Hielscher GmbH, Jerman) dilengkapi dengan microtip MS1 (diameter 1mm). Frekuensi operasi adalah 30 kHz dan daya keluaran efektif adalah 100 W. Selama operasi, sampel didinginkan dalam bak air es, dicampur dan disentrifugasi. Sampel digunakan untuk penelitian flow cytometry, sedangkan untuk penanganan selanjutnya, sampel dikenai perlakuan panas (95 ° C, 5 menit). Lysate sel kasar diolah dengan campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25: 24: 1). Volume yang sama dari campuran ini ditambahkan ke sampel lisat, larutannya diortir dengan cepat selama 15 detik dan disentrifugasi pada 15.000 xg selama 2 menit pada suhu kamar (RT) sekitar 22 ° C. Fasa berair atas yang mengandung DNA genom dipisahkan dengan hati-hati dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf steril yang baru.
Selanjutnya, sampel disonikasi untuk memecah DNA. Langkah sonication diwujudkan dalam kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas. Untuk mengevaluasi efek fragmentasi pada DNA genomik, sampel dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarose.
(…) Sampel yang disiram sebelumnya selama 2,5 menit dikenai tahap ekstraksi setelah perlakuan panas dan sentrifugasi. DNA yang dilepaskan diekstraksi dua kali dengan campuran fenol: kloroform: isoamyl alkohol, dan kemudian mengalami sonikasi kedua selama 0 - 15 menit. Agarose gel elektroforesis digunakan untuk menentukan distribusi ukuran DNA yang mengalami fragmentasi ultrasonografi pasca-ekstraksi (Gambar di sisi kanan atas). DNA yang sangat terfragmentasi terbukti dari adanya bekas luka DNA dan bukan pita berat molekul tinggi yang dieliminasi dari sampel yang disuntikkan selama 2,5 menit atau lebih. Sonication yang lebih lama secara bertahap mengurangi fragmen panjang menjadi sekitar 150 - 600 bp, dan sonication selama 15 menit menurunkan fragmen ini, seperti yang dapat dilihat sebagian besar oleh bagian atas dari smear. Dengan demikian, ukuran fragmen DNA rata-rata berangsur-angsur menurun dengan waktu ultrasonication dan perlakuan 5 menit diperbolehkan untuk mendapatkan ukuran fragmen DNA yang paling sesuai untuk pengujian chip array. Akhirnya, prosedur preparasi analit DNA yang terdiri dari 2 jam pertama perawatan ultrasonik, ekstraksi DNA (2 ×), dan sonication 5 menit berikutnya, telah ditetapkan. (Basselet et al 2008)

Kromatin Immunoprecipitation (CHIP)

Ultrasonik prosesor UP100H untuk DNA, RNA dan shearing Kromatin. (Klik untuk memperbesar!)Sel HEK293 dikultur seperti yang dijelaskan di atas dan diperbaiki dengan 2 mM disuccinimidil-glutarat selama 45 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, sel dicuci dua kali dengan PBS. Chromatin dihubungkan silang selama 10 menit pada suhu kamar menggunakan formaldehid 1% (v / v) dan dicuci dua kali dengan PBS yang dingin. Reaksi penghubung silang dihentikan dengan inkubasi dengan glisin pada konsentrasi akhir 0,125 M selama 5 menit pada suhu kamar. Setelah diinkubasi dengan tripsin, sel-sel itu tergores dari kultur sel dan dicuci dua kali dengan PBS. Pelet sel disuspensikan kembali ke buffer lisis (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl, dan 0,5% (v / v) Nonidet P-40), diinkubasi pada es selama 10 menit, dan dihomogenisasi dengan homogenizer Dounce. Selanjutnya, nukleus dilumasi dengan sentrifugasi (3500 xg, 5 menit, 4 ° C) dan disuspensikan kembali ke buffer nukleus (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, dan 1% (w / v) SDS). Nukleus terganggu oleh sonikasi dengan tiga pulsa 20-an di a UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) pada pengaturan siklus 0,5 dan amplitudo 30%, menghasilkan fragmen DNA genomik dengan ukuran sebagian besar 200-1000 bp. Untuk CHIP, 50g DNA diencerkan 4 kali lipat immunoprecipitation penyangga (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100, dan 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

analisis modifikasi histon oleh kromatin immunoprecipitation (CHIP)

Secara singkat, 6 x 106 sel dicuci dua kali dengan PBS dan dihubungkan silang pada pelat kultur selama 15 menit pada suhu kamar dengan adanya formaldehida 0,5%. Reaksi cross-linking dihentikan dengan menambahkan 0,1225 M glisin. Semua langkah selanjutnya dilakukan pada suhu 48 ° C. Semua buffer sudah terisi sebelumnya dan mengandung protease inhibitor (Complete Mini, Roche). Sel dicuci dua kali dengan PBS dan kemudian dikerok. Pelet yang terkumpul dilarutkan dalam buffer lisis 1 ml (SDS 1%, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dan disonikasi dalam bak mandi etanol dingin selama 10 siklus pada amplitudo 100% menggunakan UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Jerman). fragmentasi kromatin divisualisasikan dalam 1% gel agarosa. fragmen yang diperoleh berada di kisaran 200-500pb. kromatin larut diperoleh dengan sentrifugasi sampel sonicated di 14,000g selama 10 menit pada 48 ° C. Fraksi larut diencerkan 1/10 di pengenceran penyangga (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) maka aliquoted dan disimpan pada suhu 80 ° C sampai digunakan. (Rodriguez et al. 2008)

Perangkat Kekuatan [W] Jenis Volume [mL]
VialTweeter 200 berdiri sendiri 0.5 1.5
UP50H 50 genggam atau standmounted 0.01 250
UP100H 100 genggam atau standmounted 0.01 500
UP200Ht 200 genggam atau standmounted 01. 1000
UP200St 200 standmounted 01. 1000
UP400St 400 standmounted 5.0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 aliran bebas kontaminasi sel

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter untuk persiapan sampel ultrasonik

Hubungi Kami! / Tanya Kami!

Meminta informasi lebih lanjut

Silakan gunakan formulir di bawah ini, jika Anda ingin meminta informasi tambahan tentang ultrasonik homogenisasi. Kami akan sangat senang untuk menawarkan Anda sebuah sistem ultrasonik yang memenuhi persyaratan.









Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


Literatur / Referensi

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): pengolahan sampel untuk analisis array berbasis Chip DNA enterohemorrhagi Escherichia coli (EHEC). Mikroba Sel Pabrik 07:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Peredam Mengembalikan Perlawanan untuk Doksorubisin di Sel Kanker Usus Manusia. Molekul Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid RSA, Simonsson M. (2008): Evaluasi Metode ekstraksi Fusarium DNA dari miselia dan gandum untuk hilir real-time PCR kuantifikasi dan korelasi untuk tingkat mikotoksin . Jurnal mikrobiologi Metode 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Karakterisasi perilaku pertumbuhan Leishmania tarentolae - sistem ekspresi baru untuk protein rekombinan. Jurnal Dasar Mikrobiologi 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Peraturan Neph3 gen di podocytes - peran kunci transkripsi faktor NF-kB dan Sp1. BMC Molecular Biology 10:83 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): pelacakan Genome-macam unmethylated DNA Alu mengulangi sel normal dan kanker. Asam Nukleat Penelitian Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): The Histidin Triad Protein Hint1 Pemicu Apoptosis Independen Its Kegiatan enzimatik. The Journal of Biological kimia. Vol. 281, No. 37, 2006. 27.356-27.366.


Fakta-fakta yang Patut Diketahui

Ultrasonik / akustik kavitasi menciptakan kekuatan yang sangat kuat yang mempromosikan proses kristalisasi dan presipitasi (Klik untuk memperbesar!)

Ultrasonic DNA geser didasarkan pada kavitasi akustik dan gaya geser hidrodinamik nya