Ultrasonic DNA Shearing

Selama pemotongan DNA dan RNA, molekul DNA yang panjang terfragmentasi menjadi potongan-potongan yang lebih kecil, langkah penting dalam menyiapkan sampel untuk konstruksi perpustakaan pengurutan generasi berikutnya (NGS). Geser DNA ultrasonik menggunakan gaya kavitasi akustik untuk memecah DNA atau RNA menjadi fragmen mulai dari 100 bp hingga 5 kb. Metode ini memungkinkan kontrol yang tepat atas ukuran fragmen, memfasilitasi penyesuaian panjang DNA yang diinginkan untuk hasil pengurutan yang optimal.

Geser DNA menggunakan Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi berbasis ultrasound untuk pemotongan DNA, RNA, dan kromatin. Pilih antara ultrasonicators tipe probe (misalnya UP100H) untuk sonikasi langsung menggunakan microtip, atau gunakan VialTweeeter atau cuphorn ultrasonik untuk persiapan DNA tidak langsung dari berbagai sampel secara bersamaan. Hielscher menawarkan perangkat yang ideal dengan mempertimbangkan kebutuhan Anda: apakah Anda memiliki 1 atau hingga 10 sampel, volume dari mikroliter hingga volume liter – Sonikator Hielscher akan memenuhi kebutuhan Anda untuk menyiapkan fragmen DNA, RNA dan kromatin dengan panjang yang tepat. Reproduktifitas, pengoperasian yang mudah, dan kontrol yang tepat memungkinkan perpustakaan yang andal untuk pengurutan generasi berikutnya.
Berbeda dengan fragmentasi DNA enzimatik, geser ultrasonik menerapkan gaya geser mekanis murni tanpa menambahkan bahan kimia apa pun. Dengan pengaturan parameter proses yang tepat, geser ultrasonik menghasilkan fragmen DNA dengan berat molekul tinggi (plasmid dan DNA genomik).
Asam nukleat yang dimurnikan dapat diperkuat sebelum atau setelah langkah fragmentasi.
Parameter sonikasi (daya, siklus pulsa / semburan, waktu dan suhu) dapat dikontrol dengan aman melalui pengaturan perangkat lunak.

Protokol untuk Geser DNA Ultrasonik

Untuk Uji Imunopresipitasi Kromatin

Secara singkat, sel dilapisi dalam piring berdiameter 60mm (400.000 per piring) dan ditransfeksi dengan siRNA RhoA (seperti yang dijelaskan); setelah 72 jam, mereka diinkubasi dengan formaldehida (konsentrasi akhir, 1%) selama 10 menit pada suhu 37°C untuk menghubungkan silang protein ke DNA. Reaksi ikatan silang dipadamkan dengan penambahan sepersepuluh volume 1,25 mol/L glisin, memberikan konsentrasi akhir 125 mmol/L. Sel dicuci dua kali dengan PBS sedingin es, tersuspensi kembali dalam buffer uji radioimunopresipitasi [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] yang mengandung 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag/mL aprotinin, dan 1 Ag/mL pepstatin A, dan disimpan di atas es selama 30 menit. Kemudian, lisat sel disonikasi di atas es dengan a Hielscher UP200S sonicator ultrasound (3 x 40 detik, amplitudo 40%, siklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) sampai kromatin ikatan silang digeser untuk menghasilkan fragmen DNA antara 200 dan 1.000 bp. Sepersepuluh dari seluruh lisat digunakan untuk mengukur jumlah DNA yang ada dalam sampel yang berbeda dan dianggap sebagai “DNA input total”. Supernatan diinkubasi dengan DNA sperma salmon/protein agarose-50% bubur untuk mengurangi latar belakang nonspesifik. Imunopresipitasi kemudian dilakukan semalaman pada suhu 4°C dengan 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) atau tanpa antibodi (kontrol negatif). Supernatan ini dilengkapi dengan 5 mol/L NaCl dan dipanaskan semalaman pada suhu 65°C untuk mengembalikan ikatan silang protein-DNA. Imunokompleks selanjutnya diolah dengan proteinase K bebas DNase dan RNase, dan DNA dimurnikan dengan ekstraksi fenol/kloroform dan pengendapan etanol. PCR dilakukan dengan primer spesifik yang sesuai dengan urutan dalam wilayah promotor gen iNOS manusia (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi ekspresi EGFP

Untuk studi ekspresi, strain rekombinan L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Jerman) dengan gen untuk EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosom ssu terintegrasi, dibudidayakan di berbagai media seperti yang dijelaskan sebelumnya dan juga dilengkapi dengan 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Jerman). Selama budidaya, sampel 1 ml diambil, disentrifugasi (2000 × g, 20°C, 10 menit) dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9%. Pelet ditangguhkan kembali dalam buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dan dihancurkan oleh sonifikasi dengan prosesor ultrasonik UP400S (penerapan energi ∼ 400 Ws). Puing-puing sel dihilangkan dengan sentrifugasi (6000 × g, 4°C, 5 menit) dan dianalisis dengan elektroforesis gel natrium dodecyl sulfate – polyacrylamide (SDS-PAGE) dalam kondisi reduksi sesuai dengan metode Laemmli (1970) dengan gel poliakralida 12,5%. Ekspresi EGFP diperiksa dalam kultur yang diagitasi. (Fritsche dkk. 2007)

imunopresipitasi kromatin

Uji imunopresipitasi kromatin dilakukan dengan menggunakan ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, podosit manusia yang berdiferensiasi dihubungkan silang dengan formaldehida 1% selama 10 menit pada suhu kamar. Sel-sel dicuci dengan PBS sedingin es dan reaksi fiksasi dihentikan dengan menambahkan 0,125 M glisin selama 5 menit pada suhu kamar. Sel-sel dicuci lagi dengan PBS sedingin es dan dikikis dari piring. Sel-sel dipelet dengan sentrifugasi dan disuspensi kembali dalam buffer lisis. Setelah sentrifugasi, inti pelet disuspensi kembali dalam buffer geser, diinkubasi di atas es selama 30 menit dan kromatin digeser dengan sonikasi, misalnya UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Jerman) pada daya 25% 5 pulsa masing-masing 20 detik di atas es menjadi fragmen sekitar 200-600 bp. Kromatin yang digeser kemudian disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan. Untuk imunopresipitasi, 60 μl kromatin diinkubasi dengan 1 μg Antibodi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Inggris) atau NF-κB p50 (Abcam) atau dengan IgG kelinci (Zymed Laboratories), sebagai kontrol negatif, semalaman pada suhu 4°C dengan rotasi lembut. Imunokompleks yang terikat pada manik-manik magnetik dikumpulkan menggunakan dudukan magnetik, dicuci secara ekstensif, dan ikatan silang protein/DNA dibalik dan DNA dielusi untuk analisis PCR real-time. (Ristola et al. 2009)

Persiapan DNA EHEC untuk analisis susunan chip

Susunan lisat sel dan DNA yang diekstraksi
Pelet bakteri yang tersuspensi dalam PBS ke konsentrasi akhir yang diinginkan diolah dengan pengganggu ultrasound UP100H (Hielscher GmbH, Jerman) dilengkapi dengan microtip MS1 (diameter 1mm). Frekuensi operasi adalah 30 kHz dan daya keluaran efektif adalah 100 W. Selama operasi, sampel didinginkan dalam bak air es, dicampur dan disentrifugasi. Sampel digunakan untuk studi sitometri aliran, sedangkan untuk penanganan selanjutnya, sampel mengalami perlakuan panas (95°C, 5 menit). Lisat sel mentah diproses dengan campuran fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1). Volume yang sama dari campuran ini ditambahkan ke sampel lisat, larutan diputar dengan kuat selama 15 detik dan disentrifugasi pada 15.000 x g selama 2 menit pada suhu kamar (RT) sekitar 22°C. Fase air atas yang mengandung DNA genom dipisahkan dengan hati-hati dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf steril baru.
Selanjutnya, sampel disonikasi untuk memecah DNA. Langkah sonikasi direalisasikan dalam kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas. Untuk mengevaluasi efek fragmentasi pada DNA genomik, sampel dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
(…) Sampel yang disonikasi sebelumnya selama 2,5 menit mengalami langkah ekstraksi setelah perlakuan panas dan sentrifugasi. DNA yang dilepaskan diekstraksi dua kali dengan campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol, dan setelah itu mengalami sonikasi kedua selama 0 - 15 menit. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menentukan distribusi ukuran DNA yang mengalami fragmentasi ultrasonik pasca-ekstraksi (Gbr. di sisi kanan atas). DNA yang sangat terfragmentasi terbukti dari adanya apusan DNA daripada pita dengan berat molekul tinggi yang dihilangkan dari sampel yang disonikasi selama 2,5 menit atau lebih. Sonikasi yang lebih panjang secara bertahap mengurangi panjang fragmen menjadi sekitar 150 - 600 bp, dan sonikasi selama 15 menit semakin mendegradasi fragmen ini, seperti yang dapat dilihat sebagian besar oleh bagian atas apusan. Dengan demikian, ukuran fragmen DNA rata-rata secara bertahap menurun dengan waktu ultrasonikasi dan perawatan 5 menit memungkinkan untuk mendapatkan ukuran fragmen DNA yang paling cocok untuk uji susunan chip. Akhirnya, prosedur persiapan analit DNA yang terdiri dari 2 menit pertama pengobatan ultrasonik, ekstraksi DNA (2×), dan sonikasi 5 menit berikutnya, ditetapkan. (Basselet dkk. 2008)

Imunopresipitasi Kromatin (ChIP)

Sel HEK293 dikultur seperti dijelaskan di atas dan diperbaiki dengan 2 mM disuksinimidil-glutarat selama 45 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, sel-sel dicuci dua kali dengan PBS. Kromatin dihubungkan silang selama 10 menit pada suhu kamar menggunakan formaldehida 1% (v/v) dan dicuci dua kali dengan PBS sedingin es. Reaksi ikatan silang dihentikan dengan inkubasi dengan glisin pada konsentrasi akhir 0,125 M selama 5 menit pada suhu kamar. Setelah inkubasi dengan tripsin, sel-sel dikikis dari cawan kultur sel dan dicuci dua kali dengan PBS. Pelet sel ditangguhkan kembali dalam buffer lisis (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, dan 0,5% (v/v) Nonidet P-40), diinkubasi di atas es selama 10 menit, dan dihomogenisasi dengan homogenizer Dounce. Selanjutnya, inti dipelet dengan sentrifugasi (3500 x g, 5 menit, 4 °C) dan disuspensi kembali dalam buffer inti (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, dan 1% (w/v) SDS). Inti terganggu oleh sonikasi dengan tiga pulsa 20-s dalam a Sonikator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pada pengaturan siklus 0,5 dan amplitudo 30%, menghasilkan fragmen DNA genom dengan ukuran massal 200 – 1000 bp. Untuk ChIP, 50g DNA diencerkan 4 kali lipat dalam buffer imunopresipitasi (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, dan 0,01% (w/v) SDS). (Weiske dkk. 2006)

Analisis modifikasi histon dengan imunopresipitasi kromatin (ChIP)

Secara singkat, 6 x 10⁶ sel dicuci dua kali dengan PBS dan dihubungkan silang pada pelat kultur selama 15 menit pada suhu kamar dengan adanya 0,5% formaldehida. Reaksi ikatan silang dihentikan dengan menambahkan 0,125 M glisin. Semua langkah selanjutnya dilakukan pada suhu 48°C. Semua buffer telah didinginkan sebelumnya dan mengandung inhibitor protease (Complete Mini, Roche). Sel dicuci dua kali dengan PBS dan kemudian dikikis. Pelet yang terkumpul dilarutkan dalam buffer lisis 1 ml (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dan disonikasi dalam bak etanol dingin selama 10 siklus pada amplitudo 100% menggunakan a Sonikator UP50H (Hielscher, Teltow, Jerman). Fragmentasi kromatin divisualisasikan dalam gel agarosa 1%. Fragmen yang diperoleh berada dalam kisaran 200-500pb. Kromatin larut diperoleh dengan mensentrifugasi sampel yang disonikasi pada 14.000g selama 10 menit pada suhu 48°C. Fraksi larut diencerkan 1/10 dalam buffer pengenceran (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) kemudian dialisikan dan disimpan pada suhu 80°C sampai digunakan. (Rodriguez dkk. 2008)