Preparasi Plasmid menggunakan Ultrasonikasi

Ultrasonikasi merupakan teknik yang andal untuk memfragmentasi DNA plasmid. Amplitudo yang dapat dikontrol secara presisi, mode pulsasi, dan kontrol suhu merupakan fitur terpenting sonikator untuk fragmentasi plasmid tanpa kerusakan. Selain itu, penggunaan agen tertentu membantu melindungi plasmid dari degradasi. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk fragmentasi plasmid yang terkontrol, mulai dari vial tunggal hingga sonikasi banyak sampel secara bersamaan serta pelat multisumur. Pelajari lebih lanjut tentang keberhasilan fragmentasi plasmid secara ultrasonik!

Pemotongan Plasmid dengan Gaya Geser menggunakan Ultrasonikasi

Ketika sampel DNA dikenai gelombang ultrasonik, getaran yang dihasilkan secara ultrasonik menciptakan kavitasi akustik dalam cairan yang memotong atau memutus molekul DNA berbobot molekul tinggi melalui gaya mekanis. Sonikasi merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk eksperimen pemotongan DNA secara massal dengan gaya geser, termasuk aplikasi seperti imunopresipitasi kromatin (ChIP), yang memerlukan ukuran fragmen kecil untuk memperoleh resolusi tinggi. (bandingkan Tseng et al., 2012)
DNA plasmid (pDNA) merupakan bentuk khusus DNA yang dicirikan oleh bentuk cincinnya dan ditemukan pada bakteri serta beberapa eukariota.
pDNA superkoil merupakan bentuk DNA plasmid yang diinginkan karena menunjukkan hasil terbaik dalam proses hilir seperti sekuensing otomatis dan transfeksi. Ultrasonikasi cocok untuk memfragmentasi pDNA, termasuk pDNA superkoil, dengan berhasil.
Thompson et al. (2008) menunjukkan bahwa sonikasi plasmid, yang diketahui dapat memfragmentasi DNA superkoil, merupakan cara yang efektif untuk meningkatkan panjang bacaan sekuens phred20 hingga tidak berbeda secara signifikan dari templat kontrol Beckman Coulter atau plasmid yang dilinearisasi secara enzimatis.

Penggunaan Vektor Plasmid

Plasmid sering digunakan sebagai alat untuk mengkloning, mentransfer, dan memanipulasi gen. Ketika plasmid digunakan secara eksperimental untuk tujuan tersebut, plasmid disebut vektor. Fragmen DNA atau gen dapat disisipkan ke dalam vektor plasmid, sehingga menghasilkan apa yang disebut plasmid rekombinan. Vektor plasmid digunakan sebagai wahana untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel inang dan merupakan komponen utama kloning molekuler.
“Vektor nonvirus sedang diteliti secara luas karena potensinya untuk digunakan dalam terapi gen guna mengobati berbagai penyakit kompleks. Vektor nonvirus melindungi DNA plasmid dari degradasi fisik, kimiawi, dan enzimatis serta menghantarkan molekul DNA ke lokasi target. Sebagai contoh, liposom kationik, kitosan, dan nanopartikel bermuatan positif lainnya membentuk kompleks dengan DNA plasmid melalui interaksi elektrostatik. Namun, kompleks liposom kationik/DNA plasmid yang mudah terbentuk ini berukuran relatif besar (yaitu 300–400 nm) dan bersifat heterogen sehingga sulit digunakan dalam aplikasi farmasi. Kompleks DNA plasmid/liposom, DNA plasmid/aerosol, dan DNA plasmid/peptida yang besar dan heterogen dapat diperkecil menjadi partikel yang lebih kecil dan homogen menggunakan ultrasonikasi.” (Sarker et al., 2019)
Contoh penting penggunaan vektor plasmid adalah CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 biasanya dihantarkan ke sel sebagai satu plasmid besar atau beberapa plasmid lebih kecil yang mengodekan sekuens target, pemandu CRISPR, dan Cas9.

Preparasi Ultrasonik Nanopartikel PLGA Bermuatan DNA melalui Nanopresipitasi

Jo et al. (2020) menggunakan poli(asam laktat-ko-glikolat) (PLGA) untuk membentuk pembawa nanopartikel guna menghantarkan plasmid model CRISPR–Cas9 ke dalam makrofag primer yang berasal dari sumsum tulang. Untuk nanopresipitasi nanopartikel PLGA, digunakan PLGA dengan dua gugus ujung berbeda (gugus ester dan amina), dengan tujuan agar gugus ujung amina bermuatan positif meningkatkan efisiensi enkapsulasi dan pemuatan akibat interaksi muatan antara gugus tersebut dan kerangka utama DNA yang bermuatan negatif. Dalam tabung sentrifugasi kerucut polipropilena 50 mL, 100 mg Pluronic F127 dilarutkan dalam 20 mL air deionisasi yang telah diautoklaf melalui pencampuran vorteks, diikuti sonikasi ringan selama 30 min menggunakan bak ultrasonik (lihat CupHorn). Batang pengaduk magnetik yang telah diautoklaf ditambahkan dan larutan dicampur pada 600 RPM selama 30 min sambil menyiapkan larutan lainnya. Peralatan laboratorium plastik digunakan sebagai pengganti peralatan kaca sepanjang proses untuk meminimalkan adsorpsi DNA nonspesifik. Larutan PLGA dalam DMF (44,48 mg/ ml) dan TIPS pentacene dalam THF (0,667 mg/ml) dibuat secara terpisah. PLGA dibiarkan tanpa pengadukan agar terbasahi dalam DMF selama 30 min sebelum disonikasi selama 30 min. (untuk protokol lengkap, lihat Jo et al., 2020)

Perlindungan DNA Plasmid selama Sonikasi

DNA, termasuk plasmid dan plasmid superkoil, sangat rentan terhadap degradasi. Semua metode fragmentasi yang tersedia diketahui memiliki kekurangan tertentu. Fragmentasi DNA secara ultrasonik merupakan salah satu metode yang diutamakan karena sonikasi terkontrol yang dikombinasikan dengan tindakan perlindungan memungkinkan pengurangan kerusakan untai DNA akibat gaya geser dan panas.
Selain pengaturan amplitudo rendah, mode pulsasi, dan kontrol suhu selama pemotongan DNA dengan gaya geser ultrasonik, penggunaan agen tertentu menunjukkan efek perlindungan yang signifikan terhadap degradasi DNA. Sebagai contoh, berbagai polimer, peptida, dan lipid melindungi DNA plasmid selama ultrasonikasi.

Stabilitas DNA plasmid dan nanokompleks DNA plasmid/IL terhadap tegangan geser ultrasonik diteliti menggunakan uji elektroforesis gel agarosa. Baik DNA plasmid maupun nanokompleks DNA plasmid/IL dikenai tegangan geser ultrasonik selama durasi yang berbeda. DNA plasmid dipaparkan pada tegangan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, dan 40 menit. Sementara itu, nanokompleks DNA plasmid/IL dipaparkan pada tegangan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit.
(studi dan gambar: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) menunjukkan bahwa ketika nanostruktur DNA plasmid / cairan ionik (pDNA/IL) dikenai tegangan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 min serta dikomplekskan dengan lipofectamine, agen penghantaran gen kationik yang tersedia secara komersial, persentase sel positif fluoresensi masing-masing adalah 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, dan 50% (lihat grafik di bawah). Persentase sel positif fluoresensi meningkat ketika nanostruktur dikenai tegangan geser ultrasonik selama 10 dan 20 min, lalu menurun secara perlahan.

Pengaruh cairan ionik [Bmim][PF6] terhadap penghantaran DNA plasmid ke sel COS7. Nanokompleks DNA plasmid/IL (cairan ionik) dikenai tegangan geser ultrasonik hingga 120 menit dan dikomplekskan dengan LA sebelum dihantarkan ke dalam sel COS7. Data menunjukkan jumlah rata-rata (%) sel HeLa positif GFP yang dihitung dalam 10 bidang pandang mikroskopis berbeda, dan eksperimen dilakukan beberapa kali pada tiga hari yang berbeda. (Studi dan grafik: ©Sarker et al., 2019)

Preparasi Lisat secara Ultrasonik

Protokol Lisis Sel secara Ultrasonik
Mulailah dengan sampel sel yang telah diperkaya, yang disiapkan melalui metode pemisahan sel (misalnya pemisahan sel imunomagnetik, penyortiran sel teraktivasi fluoresensi (FACS), sentrifugasi gradien densitas, isolasi sel imunodensitas).
Sampel sel harus mengandung volume bufer lisis yang sesuai dengan tujuan eksperimen dan sonikator tipe probe.
Bufer hipotonik lebih diutamakan karena meningkatkan lisis sel secara ultrasonik. Aditif dan konsentrasi garam harus digunakan secara tepat.
Pilih perangkat lisis ultrasonik Anda: Untuk sonikasi vial secara tidak langsung, VialTweeter atau CupHorn direkomendasikan. Untuk pelat multisumur, UIP400MTP merupakan sonikator yang ideal. Untuk sonikasi konvensional tipe probe, homogenizer ultrasonik seperti UP100H atau UP200Ht dengan ujung mikro paling sesuai.
Protokol untuk sonikasi tipe probe: Masukkan probe sonikator ke dalam cairan sampel di tabung mikrosentrifugasi dan lakukan sonikasi selama sekitar 10 detik. Bergantung pada sampel DNA, sonikasi dapat diulang satu atau dua kali lagi. Masukan energi ultrasonik yang diperlukan (Ws/mL) bergantung pada viskositas sampel dan jenis DNA. Pendinginan menggunakan bak es dan mode pulsasi sonikator membantu mencegah degradasi termal sampel.
Setelah lisis ultrasonik, sampel disentrifugasi untuk memisahkan pelet debris (yang mengandung sel yang belum terlisis, nukleus, dan organel yang belum terlisis).
Jika sampel tidak segera diproses lebih lanjut, sampel dapat disimpan pada suhu yang sesuai untuk mempertahankan viabilitasnya.

Sonikator untuk Fragmentasi DNA

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai platform berbasis ultrasonik untuk fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin. Berbagai platform ini mencakup probe ultrasonik (sonotrode), solusi sonikasi tidak langsung untuk preparasi sampel secara bersamaan dalam beberapa tabung atau pelat multisumur (misalnya pelat 96 sumur, pelat mikrotiter), sonoreaktor, dan cuphorn ultrasonik. Semua platform untuk pemotongan DNA dengan gaya geser ditenagai oleh prosesor ultrasonik berkinerja tinggi dengan frekuensi yang disetel, yang dapat dikontrol secara presisi dan memberikan hasil yang dapat direproduksi.

Prosesor Ultrasonik untuk Segala Jumlah dan Ukuran Sampel

Dengan sonikator multisampel Hielscher VialTweeter (untuk hingga 10 tabung reaksi) dan UIP400MTP (untuk pelat mikro/ pelat multisumur), waktu pemrosesan sampel dapat dikurangi dengan mudah berkat ultrasonikasi intens yang dapat dikontrol secara presisi, sambil memperoleh distribusi ukuran fragmen DNA dan perolehan hasil yang diinginkan. Fragmentasi DNA secara ultrasonik menjadikan tahapan preparasi plasmid efisien, andal, dan dapat diskalakan. Protokol dapat diskalakan secara linier dari satu hingga banyak sampel dengan menerapkan parameter ultrasonik yang konstan.
Sonikator probe dengan satu hingga lima jari ideal untuk preparasi sampel dalam jumlah lebih sedikit. Sonikator laboratorium Hielscher tersedia dengan berbagai tingkat daya sehingga Anda dapat memilih perangkat disrupsi ultrasonik yang ideal untuk aplikasi terkait DNA Anda.