Hielscher Ultrasonics
Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda.
Hubungi kami: +49 3328 437-420
Kirimkan email kepada kami: info@hielscher.com

Persiapan Plasmid menggunakan Ultrasonikasi

Ultrasonikasi adalah teknik yang dapat diandalkan untuk memecah DNA plasmid. Amplitudo yang dapat dikontrol dengan tepat, mode denyut dan kontrol suhu adalah fitur terpenting dari ultrasonicator untuk fragmentasi plasmid yang tidak merusak. Selain itu, penggunaan agen tertentu membantu melindungi dari degradasi plasmid. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk fragmentasi plasmid terkontrol dari botol tunggal, secara bersamaan sonikasi banyak sampel serta pelat multi-sumur. Pelajari lebih lanjut tentang fragmentasi plasmid ultrasonik yang sukses!

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan Privasi.




Fragmentasi DNA ultrasonik adalah teknik yang andal dan efisien yang biasa digunakan dalam Next Generation Sequencing (NGS)

The UIP400MTP memungkinkan ultrasonikasi pelat multi-sumur yang dikontrol secara tepat. Salah satu aplikasi UIP400MTP adalah fragmentasi DNA plasmid untuk mendapatkan fragmen dengan panjang yang ditargetkan secara khusus.

Geser Plasmid menggunakan Ultrasonication

Ketika sampel DNA mengalami gelombang ultrasonik, getaran yang dihasilkan secara ultrasonik menciptakan kavitasi akustik dalam cairan yang memotong atau memecah molekul DNA dengan berat molekul tinggi melalui gaya mekanis. Sonikasi adalah metode yang paling banyak digunakan untuk eksperimen pemotongan DNA massal termasuk aplikasi, seperti Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), di mana ukuran fragmen kecil sangat penting untuk mendapatkan resolusi tinggi. (lih. Tseng et al., 2012)
DNA plasmid (pDNA) adalah bentuk spesifik DNA, ditandai dengan bentuk cincinnya dan ditemukan pada bakteri dan beberapa eukariota.
PDNA supercoiled adalah bentuk DNA plasmid yang diinginkan karena menunjukkan hasil terbaik dalam proses hilir seperti pengurutan otomatis dan transfeksi. Ultrasonication cocok untuk memecah pDNA, termasuk pDNA supercoiled, berhasil.
Thompson et al. (2008) menunjukkan bahwa sonication plasmid, yang diketahui memecah DNA supercoiled, adalah cara yang efektif untuk meningkatkan panjang baca urutan phred20 ke titik bahwa mereka tidak berbeda secara signifikan dari templat kontrol Beckman Coulter atau plasmid linier enzimatik.

Keuntungan dari Fragmentasi DNA Ultrasonik

  • Dapat dikontrol secara tepat
  • Hasil yang dapat direproduksi
  • Dapat disesuaikan dengan panjang fragmen DNA target
  • kontrol suhu
  • Dapat diskalakan ke semua ukuran sampel
Video menunjukkan sistem persiapan sampel ultrasonik UIP400MTP, yang memungkinkan persiapan sampel yang andal dari pelat multi-sumur standar menggunakan ultrasound intensitas tinggi. Aplikasi umum dari UIP400MTP ini meliputi lisis sel, DNA, RNA, dan pemotongan kromatin serta ekstraksi protein.

Ultrasonicator UIP400MTP untuk sonikasi pelat multi-sumur

Video Thumbnail

Penggunaan Vektor Plasmid

Plasmid sering digunakan sebagai alat untuk mengkloning, mentransfer, dan memanipulasi gen. Ketika plasmid digunakan secara eksperimental untuk tujuan ini, mereka disebut vektor. Fragmen atau gen DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor plasmid, menciptakan apa yang disebut plasmid rekombinan. Vektor plasmid digunakan sebagai kendaraan untuk menggerakkan DNA rekombinan ke dalam sel inang dan merupakan komponen kunci dari kloning molekuler.
“Vektor non-virus sedang dipelajari secara ekstensif untuk potensi penggunaannya dalam terapi gen untuk mengobati berbagai penyakit rumit. Vektor non-virus melindungi DNA plasmid dari degradasi fisik, kimia, dan enzimatik serta mengirimkan molekul DNA ke situs target. Misalnya, liposom kationik, kitosan dan nanopartikel bermuatan positif lainnya membentuk kompleks dengan DNA plasmid melalui interaksi elektrostatik. Namun, kompleks DNA liposom/plasmid kationik yang mudah dibentuk relatif besar (yaitu, 300–400 nm) dan heterogen di alam sehingga sulit digunakan dalam aplikasi farmasi. DNA? liposom plasmid yang besar dan heterogen, DNA? aerosol plasmid, dan kompleks DNA? peptida plasmid dapat direduksi menjadi partikel yang lebih kecil dan homogen menggunakan ultrasonikasi.” (Sarker dkk., 2019)
Contoh yang menonjol untuk penggunaan vektor plasmid adalah CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 biasanya dikirim ke sel sebagai plasmid besar tunggal atau beberapa plasmid kecil yang mengkodekan urutan target, panduan CRISPR, dan Cas9.

Persiapan Ultrasonik Nanopartikel PLGA yang dimuat DNA dengan Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) menggunakan poli(asam laktat-ko-glikolat) (PLGA) untuk membentuk pembawa nanopartikel untuk pengiriman plasmid model CRISPR–Cas9 ke dalam makrofag yang diturunkan dari sumsum tulang primer. Untuk presipitasi nanopartikel PLGA, PLGA dengan dua gugus ujung yang berbeda (gugus ester dan amina) digunakan dengan tujuan agar tutup ujung amina bermuatan positif meningkatkan efisiensi enkapsulasi dan pemuatan karena interaksi muatan antara itu dan tulang punggung DNA yang bermuatan negatif. Dalam tabung centrifuge kerucut polypropylene 50 mL, 100 mg Pluronic F127 dilarutkan dalam 20 mL air DI yang diautoklaf dengan pencampuran pusaran diikuti dengan 30 menit sonikasi lembut menggunakan bak ultrasonik (lihat CupHorn). Batang pengaduk magnetik yang diautoklaf ditambahkan dan larutan dicampur pada 600 RPM selama 30 menit sementara larutan lainnya dibuat. Peralatan laboratorium plastik digunakan sebagai pengganti gelas untuk meminimalkan adsorpsi DNA yang tidak spesifik. Larutan PLGA yang dilarutkan dalam DMF (44,48 mg/ml) dan TIPS pentasen yang dilarutkan dalam THF (0,667 mg/ml) dibuat secara terpisah. PLGA dibiarkan diam basah dalam DMF selama 30 menit sebelum disonikasi selama 30 menit (untuk protokol lengkap lihat Jo et al., 2020)

Aplikasi terkait:

  • Ekstraksi DNA
  • Enkapsulasi DNA
  • Dispersi DNA berlapis nanopartikel
  • Pengiriman DNA plasmid ke dalam sel
UP200St TD_CupHorn untuk sonikasi sampel tidak langsung

UP200St CupHorn untuk sonikasi sampel tidak langsung, misalnya untuk ekstraksi dan fragmentasi DNA.

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan Privasi.




Perlindungan DNA Plasmid selama Sonikasi

DNA termasuk plasmid dan plasmid supercoiled adalah degradasi yang sangat sensitif. Semua metode fragmentasi yang tersedia dikenal karena kelemahan tertentu. Fragmentasi DNA ultrasonik adalah salah satu metode yang disukai karena sonikasi terkontrol dalam kombinasi dengan langkah-langkah perlindungan memungkinkan untuk mengurangi kerusakan untaian DNA yang diinduksi geser dan panas.
Selain pengaturan amplitudo rendah, mode denyut dan kontrol suhu selama pemotongan DNA ultrasonik, penggunaan agen tertentu menunjukkan efek perlindungan yang signifikan terhadap degradasi DNA. Misalnya, berbagai polimer, peptida, dan lipid melindungi DNA plasmid selama ultrasonikasi.

Cairan ionik dapat melindungi DNA plasmid dari kerusakan selama sonikasi.

Stabilitas DNA plasmid, dan nanokompleks DNA/IL plasmid terhadap tegangan geser ultrasonik diselidiki menggunakan uji elektroforesis gel agarosa. Baik DNA plasmid dan nanokompleks DNA? IL plasmid mengalami tekanan geser ultrasonik untuk titik waktu yang berbeda. DNA plasmid dipaparkan pada tegangan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, dan 40 menit. Namun, nanokompleks plasmid DNA/IL terkena tegangan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit.(studi dan gambar: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) menunjukkan bahwa ketika struktur nano plasmid DNA? cairan ionik (pDNA/IL) mengalami tekanan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit dan dikomplekskan dengan agen pengiriman gen kationik lipofectamine yang tersedia secara komersial, persentase sel positif fluoresen adalah 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, masing-masing 65%, dan 50% (lihat grafik di bawah). Persentase sel positif fluoresen meningkat ketika struktur nano mengalami tekanan geser ultrasonik selama 10, dan 20 menit, dan setelah itu menurun perlahan.

Fragmentasi ultrasonik DNA plasmid

Pengaruh cairan ionik [Bmim][PF6] pada pengiriman DNA plasmid ke sel COS7. Nanokompleks plasmid DNA/IL (cairan ionik) mengalami tekanan geser ultrasonik hingga 120 menit dan dikomplekskan dengan LA sebelum dikirim ke sel COS7. Data menunjukkan jumlah rata-rata (%) sel HeLa positif GFP yang dihitung dalam 10 bidang mikroskopis yang berbeda dan percobaan dilakukan beberapa kali pada tiga hari yang berbeda. (Studi dan bagan: ©Sarker et al., 2019)

DNA plasmid dapat dilindungi dengan menambahkan agen sebelum fragmentasi ultrasonik.

DNA plasmid dapat dilindungi dengan menambahkan agen sebelum fragmentasi ultrasonik: Degradasi pDNA telanjang yang diinduksi sonikasi (A) dan pDNA yang diformulasikan dengan 1,5 mM CaCl2 dan 20% (v? v) t-butanol (B)Sampel disonikasi dengan probe 20W hingga 120 detik, seperti yang ditunjukkan di bagian atas setiap jalur. Jalur H sesuai dengan penanda Hyperladder I ™️. Pita plasmid OC dan SC ditunjukkan.(studi dan gambar: ©Wu et al., 2009)

Persiapan Lisat Ultrasonik

Protokol Lisis Sel Ultrasonik
Ultrasonicator UP200Ht dengan microtip S26d2 untuk lisis ultrasonik sampel biologisMulailah dengan sampel sel yang diperkaya yang disiapkan melalui metode pemisahan sel (misalnya, pemisahan sel imunomagnetik, penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS), sentrifugasi gradien densitas, isolasi sel imunodensitas).
Sampel sel harus menunjukkan volume buffer lisis yang sesuai untuk tujuan eksperimental dan ultrasonicator tipe probe.
Penyangga hipotonik lebih disukai karena meningkatkan lisis sel ultrasonik. Penting bahwa aditif dan konsentrasi garam digunakan dengan cara yang tepat.
Pilih perangkat lisis ultrasonik Anda: Untuk sonikasi botol tidak langsung, VialTweeter atau CupHorn direkomendasikan. Untuk pelat multiwell, UIP400MTP adalah ultrasonicator yang ideal. Dan sonikasi tipe probe klasik, homogenizer ultrasonik seperti UP100H atau UP200Ht dengan ujung mikro paling cocok.
Protokol untuk sonikasi tipe probe: Tempatkan probe ultrasonicator ke dalam volume sampel dalam tabung mikrosentrifugal dan sonikasi selama kurang lebih 10 detik. Tergantung pada sampel DNA, sonikasi mungkin diulang satu atau dua kali lagi. Input energi ultrasonik yang diperlukan (Ws/mL) tergantung pada viskositas sampel dan jenis DNA. Pendinginan melalui penangas es dan mode denyut ultrasonicator membantu mencegah sampel terdegradasi secara termal.
Setelah lisis ultrasonik, sampel disentrifugasi untuk memisahkan puing-puing pelet (berisi sel, inti, dan organel yang tidak dilisis)
Jika sampel tidak segera diproses lebih lanjut, sampel dapat disimpan pada suhu yang sesuai untuk menjaga kelangsungan hidupnya.

Ultrasonicators untuk Fragmentasi DNA

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai platform berbasis ultrasound untuk fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin. Platform yang berbeda ini termasuk probe ultrasonik (sonotrodes), solusi sonikasi tidak langsung untuk persiapan sampel simultan dari beberapa tabung atau pelat multi-sumur (misalnya, pelat 96 sumur, pelat mikrotiter), sonoreaktor, dan cuphorn ultrasonik. Semua platform untuk geser DNA didukung oleh prosesor ultrasonik berkinerja tinggi yang disetel frekuensi, yang dapat dikontrol secara tepat dan memberikan hasil yang dapat direproduksi.

Prosesor Ultrasonik untuk Jumlah dan Ukuran Sampel Apa Pun

Dengan ultrasonik multi-sampel Hielscher VialTweeter (hingga 10 tabung reaksi) dan UIP400MTP (untuk pelat mikro / pelat multiwell) menjadi mudah untuk mengurangi waktu pemrosesan sampel karena ultrasonikasi yang intens dan dapat dikontrol secara presisi sambil mendapatkan distribusi ukuran dan hasil fragmen DNA yang diinginkan. Fragmentasi DNA ultrasonik membuat langkah persiapan plasmid menjadi efisien, andal, dan terukur. Protokol dapat diskalakan secara linier dari satu ke banyak sampel dengan menerapkan parameter ultrasound konstan.
Ultrasonik probe dengan satu hingga lima jari sangat ideal untuk persiapan jumlah sampel yang lebih kecil. Ultrasonik lab Hielscher tersedia dengan tingkat daya yang berbeda sehingga Anda dapat memilih pengganggu ultrasonik yang ideal untuk aplikasi terkait DNA Anda.

VialTweeter adalah Ultrasonicator MultiSample yang memungkinkan persiapan sampel yang andal dalam kondisi suhu yang dikontrol secara tepat.

Unit persiapan multi-sampel ultrasonik VialTweeter memungkinkan sonikasi simultan hingga 10 botol. Dengan perangkat penjepit VialPress, hingga 4 tabung tambahan dapat ditekan ke depan untuk sonikasi yang intens.

Kontrol proses yang tepat

Ultrasonicator Hielscher dapat dikendalikan dari jarak jauh melalui kontrol browser. Parameter sonikasi dapat dipantau dan disesuaikan dengan persyaratan proses.Pengaturan sonikasi yang dapat dikontrol secara tepat sangat penting karena sonifikasi yang menyeluruh dapat menghancurkan DNA, RNA dan kromatin, tetapi geser ultrasonik yang tidak memadai menghasilkan fragmen DNA dan kromatin yang terlalu panjang. Ultrasonik digital Hielscher dapat dengan mudah diatur ke parameter sonikasi yang tepat. Pengaturan sonikasi tertentu juga dapat disimpan sebagai pengaturan terprogram untuk pengulangan cepat dari prosedur yang sama.
Semua sonikasi secara otomatis diprotokolisasi dan disimpan sebagai file CSV pada kartu SD bawaan. Hal ini memungkinkan dokumentasi yang akurat dari uji coba yang dilakukan dan memungkinkan untuk merevisi sonikasi dengan mudah.
Melalui remote control browser, semua ultrasonicator digital dapat dioperasikan dan dipantau melalui browser standar apa pun. Instalasi perangkat lunak tambahan tidak diperlukan, karena koneksi LAN adalah pengaturan plug-n-play yang sangat sederhana.

Keramahan Pengguna Tertinggi selama Persiapan DNA Ultrasonik

Semua ultrasonicators Hielscher dirancang untuk menghasilkan ultrasound berkinerja tinggi, sementara pada saat yang sama selalu sangat ramah pengguna dan mudah dioperasikan. Semua pengaturan terstruktur dengan baik dalam menu yang jelas, yang dapat dengan mudah diakses melalui layar sentuh berwarna atau remote control browser. Perangkat lunak pintar dengan pengaturan yang dapat diprogram dan perekaman data otomatis memastikan pengaturan sonikasi yang optimal untuk hasil yang andal dan dapat direproduksi. Antarmuka menu yang bersih dan mudah digunakan mengubah ultrasonicators Hielscher menjadi perangkat yang ramah pengguna dan efisien.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonicators laboratorium kami untuk lisis sel dan fragmentasi DNA:

Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
pelat multi-sumur N/a UIP400MTP
Vial, gelas kimia kecil N/a Ultrasonik CupHorn
hingga 10 botol N/a VialTweeter
1 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St

Hubungi Kami!? Tanya Kami!

Minta informasi lebih lanjut

Silakan gunakan formulir di bawah ini untuk meminta informasi tambahan tentang homogenizer ultrasonik untuk ekstraksi dan fragmentasi DNA, protokol aplikasi dan harga. Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda dengan Anda dan menawarkan sistem ultrasonik yang memenuhi kebutuhan Anda!









Harap perhatikan kami Kebijakan Privasi.






Literatur? Referensi

Fakta-fakta yang Patut Diketahui

Apa itu Plasmid?
Plasmid adalah molekul DNA melingkar kecil yang secara fisik terpisah dari DNA kromosom dan bereplikasi secara independen. Plasmid sering dikaitkan dengan gen yang berkontribusi pada kelangsungan hidup suatu organisme dan memberikan keuntungan khusus, misalnya resistensi antibiotik. Plasmid paling sering ditemukan sebagai molekul DNA beruntai ganda melingkar kecil pada bakteri; Namun, plasmid terkadang hadir pada organisme archaea dan eukariotik. Plasmid adalah alat penting dalam biologi molekuler, genetika, biokimia, dan ilmu kehidupan. Dikenal sebagai vektor dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan untuk mereplikasi atau mengekspresikan gen tertentu. Perubahan vektor yang ditargetkan disebut desain vektor.

Analisis GFP dalam Penelitian Sel
Protein Fluoresen Hijau (GFP) adalah penanda biologis serbaguna untuk memantau proses fisiologis, memvisualisasikan lokalisasi protein, dan mendeteksi ekspresi transgenik in vivo. GFP dapat dieksitasi oleh garis laser 488 nm dan terdeteksi secara optimal pada 510 nm.


Ultrasonik kinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup spektrum penuh dari ultrasonicator lab kompak di atas unit bench-top hingga sistem ultrasonik industri penuh.

Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.

Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda.

Let's get in contact.