Ultrasonication adalah teknik yang dapat diandalkan untuk memecah DNA plasmid. Amplitudo yang dapat dikontrol secara tepat, mode denyut dan kontrol suhu adalah fitur terpenting dari ultrasonicator untuk fragmentasi plasmid yang tidak merusak. Selain itu, penggunaan agen tertentu membantu melindungi dari degradasi plasmid. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk fragmentasi plasmid terkontrol dari botol tunggal, secara bersamaan sonikasi berbagai sampel serta pelat multi-sumur. Pelajari lebih lanjut tentang fragmentasi plasmid ultrasonik yang sukses!

Plasmid Shearing menggunakan Ultrasonication

Ketika sampel DNA mengalami gelombang ultrasonik, getaran yang dihasilkan secara ultrasonik menciptakan kavitasi akustik dalam cairan yang mencukur atau memecah molekul DNA dengan berat molekul tinggi melalui kekuatan mekanis. Sonikasi adalah metode yang paling banyak digunakan untuk eksperimen pencukuran DNA massal termasuk aplikasi, seperti Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), di mana ukuran fragmen kecil sangat penting untuk mendapatkan resolusi tinggi. (lihat Tseng dkk., 2012)
DNA Plasmid (pDNA) adalah bentuk spesifik dna, ditandai dengan bentuk cincinnya dan ditemukan pada bakteri dan beberapa eukariota.
PDNA supercoiled adalah bentuk DNA plasmid yang diinginkan karena menunjukkan hasil terbaik dalam proses down-stream seperti pengurutan otomatis dan transfeksi. Ultrasonication cocok untuk fragmen pDNA, termasuk pDNA supercoiled, berhasil.
Thompson et al. (2008) menunjukkan bahwa sonikasi plasmid, yang diketahui dapat memecah DNA supercoiled, adalah cara yang efektif untuk meningkatkan panjang baca urutan phred20 ke titik bahwa mereka tidak berbeda secara signifikan dari template kontrol Beckman Coulter atau plasmid linier secara enzimatik.

Penggunaan Vektor Plasmid

Plasmid sering digunakan sebagai alat untuk mengkloning, mentransfer, dan memanipulasi gen. Ketika plasmid digunakan secara eksperimental untuk tujuan ini, mereka disebut vektor. Fragmen atau gen DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor plasmid, menciptakan apa yang disebut plasmid rekombinan. Vektor plasmid digunakan sebagai kendaraan untuk mendorong DNA rekombinan ke dalam sel inang dan merupakan komponen kunci dari kloning molekuler.
“Vektor non-virus sedang dipelajari secara ekstensif untuk potensi penggunaannya dalam terapi gen untuk mengobati berbagai penyakit rumit. Vektor non-virus melindungi DNA plasmid terhadap degradasi fisik, kimia, dan enzimatik dan mengirimkan molekul DNA ke lokasi target. Misalnya, liposom kationik, kitosan, dan nanopartikel bermuatan positif lainnya membentuk kompleks dengan DNA plasmid melalui interaksi elektrostatik. Namun, liposom kationik yang mudah terbentuk / kompleks DNA plasmid relatif besar (yaitu, 300-400 nm) dan bersifat heterogen sehingga sulit digunakan dalam aplikasi farmasi. DNA/liposom plasmid plasmid yang besar dan heterogen, DNA/aerosol plasmid, dan kompleks DNA/peptida plasmid dapat direduksi menjadi partikel yang lebih kecil, dan homogen menggunakan ultrasonikasi.” (Sarker dkk., 2019)
Contoh yang menonjol untuk penggunaan vektor plasmid adalah CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 biasanya dikirim ke sel sebagai plasmid besar tunggal atau beberapa plasmid yang lebih kecil yang mengkodekan urutan target, panduan CRISPR, dan Cas9.

Persiapan Ultrasonik Nanopartikel PLGA yang dimuat DNA oleh Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) menggunakan poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) untuk membentuk pembawa nanopartikel untuk pengiriman model CRISPR–Cas9 plasmid ke dalam makrofag turunan sumsum tulang primer. Untuk nanopresipitasi nanopartikel PLGA, PLGA dengan dua kelompok ujung yang berbeda (gugus ester dan amina) digunakan dengan tujuan bahwa tutup ujung amina bermuatan positif meningkatkan efisiensi enkapsulasi dan pemuatan karena interaksi muatan antara itu dan tulang punggung DNA yang bermuatan negatif. Dalam tabung centrifuge kerucut polypropylene 50 mL, 100 mg Pluronic F127 dilarutkan dalam 20 mL autocllaved DI air dengan pencampuran vortex diikuti oleh 30 menit sonikasi lembut menggunakan mandi ultrasonik (lihat CupHorn). Batang pengaduk magnetik autoklaf ditambahkan dan larutan dicampur pada 600 RPM selama 30 menit sementara solusi lainnya dibuat. Peralatan laboratorium plastik digunakan sebagai pengganti barang pecah belah di seluruh untuk meminimalkan adsorpsi DNA yang tidak spesifik. Larutan PLGA yang dilarutkan dalam DMF (44,48 mg/ ml) dan TIPS pentacene yang dilarutkan dalam THF (0,667 mg/ml) dibuat secara terpisah. PLGA dibiarkan basah dalam DMF selama 30 menit sebelum disonikasi selama 30 menit (untuk protokol lengkap lihat Jo et al., 2020)

Perlindungan DNA Plasmid selama Sonikasi

DNA termasuk plasmid dan plasmid supercoiled adalah degradasi yang sangat sensitif. Semua metode fragmentasi yang tersedia diketahui karena kelemahan tertentu. Fragmentasi DNA ultrasonik adalah salah satu metode yang disukai karena sonikasi terkontrol dalam kombinasi dengan langkah-langkah perlindungan memungkinkan untuk mengurangi kerusakan untai DNA yang diinduksi geser dan panas.
Selain pengaturan amplitudo rendah, mode denyut dan kontrol suhu selama pencukuran DNA ultrasonik, penggunaan agen tertentu menunjukkan efek perlindungan yang signifikan terhadap degradasi DNA. Misalnya, berbagai polimer, peptida, dan lipid melindungi DNA plasmid selama ultrasonikasi.

Stabilitas DNA plasmid, dan nanokompleks DNA/IL plasmid terhadap stres geser ultrasonik diselidiki menggunakan uji elektroforesis gel agarosa. Baik DNA plasmid dan nanokompleks DNA / IL plasmid mengalami stres geser ultrasonik untuk titik waktu yang berbeda. DNA plasmid terkena stres geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, dan 40 menit. Namun, nanokompleks DNA / IL plasmid terkena tekanan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit.
(studi dan gambar: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) menunjukkan bahwa ketika struktur nano plasmid DNA / cairan ionik (pDNA / IL) mengalami tekanan geser ultrasonik untuk 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit dan dikompleks dengan agen pengiriman gen kationik yang tersedia secara komersial lipofectamine, persentase sel positif fluoresen adalah 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Masing-masing 65%, dan 50%, (lihat grafik di bawah). Persentase sel positif fluoresen meningkat ketika struktur nano mengalami tekanan geser ultrasonik selama 10, dan 20 menit, dan setelah itu menurun perlahan.

Pengaruh cairan ionik [Bmim][PF6] pada pengiriman DNA plasmid ke sel COS7. Nanokompleks DNA /IL (cairan ionik) Plasmid mengalami tekanan geser ultrasonik hingga 120 menit dan dikompleks dengan LA sebelum dikirim ke sel COS7. Data menunjukkan jumlah rata-rata (%) sel HeLa positif GFP dihitung dalam 10 bidang mikroskopis yang berbeda dan percobaan dilakukan beberapa kali pada tiga hari yang berbeda. (Studi dan bagan: ©Sarker et al., 2019)

Persiapan Lisat Ultrasonik

Protokol Lisis Sel Ultrasonik
Mulailah dengan sampel sel yang diperkaya yang disiapkan melalui metode pemisahan sel (misalnya, pemisahan sel imunomagnetik, penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS), sentrifugasi gradien kepadatan, isolasi sel imunodensitas).
Sampel sel harus menunjukkan volume buffer lisis yang sesuai untuk tujuan eksperimental dan ultrasonikator tipe probe.
Buffer hipotonik lebih disukai karena mereka meningkatkan lisis sel ultrasonik. Adalah penting bahwa aditif dan konsentrasi garam digunakan dengan cara yang tepat.
Pilih perangkat lisis ultrasonik Anda: Untuk sonikasi botol tidak langsung, VialTweeter atau CupHorn direkomendasikan. Untuk pelat multiwell, UIP400MTP adalah ultrasonicator yang ideal. Dan sonikasi tipe probe klasik, homogenizer ultrasonik sebagai UP100H atau UP200Ht dengan ujung mikro paling cocok.
Protokol untuk sonikasi tipe probe: Tempatkan probe ultrasonicator ke dalam volume sampel dalam tabung microcentrifuge dan sonikasi selama sekitar 10 detik. Tergantung pada sampel DNA, sonikasi mungkin diulang satu atau dua kali lagi. Input energi ultrasonik yang diperlukan (Ws / mL) tergantung pada viskositas sampel dan jenis DNA. Pendinginan melalui penangas es dan mode denyut ultrasonikator membantu mencegah bahwa sampel terdegradasi secara termal.
Setelah lisis ultrasonik, sampel disentrifugasi untuk memisahkan puing-puing pelet (mengandung sel-sel yang tidak dilised, inti, dan organel yang tidak dilised)
Jika sampel tidak segera diproses lebih lanjut, sampel dapat disimpan pada suhu yang sesuai untuk menjaga kelangsungan hidupnya.

Ultrasonicators untuk Fragmentasi DNA

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai platform berbasis ultrasound untuk fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin. Platform yang berbeda ini termasuk probe ultrasonik (sonotrodes), solusi sonikasi tidak langsung untuk persiapan sampel simultan dari beberapa tabung atau pelat multi-sumur (misalnya, pelat 96-well, pelat microtiter), sonoreactors, dan cuphorns ultrasonik. Semua platform untuk geser DNA didukung oleh frekuensi-tuned, prosesor ultrasonik berkinerja tinggi, yang tepat dikontrol dan memberikan hasil yang dapat direproduksi.

Prosesor Ultrasonik untuk Setiap Nomor Sampel dan Ukuran

Dengan ultrasonicators multi-sampel Hielscher VialTweeter (untuk hingga 10 tabung reaksi) dan UIP400MTP (untuk pelat mikroplat / multiwell) menjadi mudah untuk mengurangi waktu pemrosesan sampel karena ultrasonikasi yang intens dan dikontrol dengan tepat sambil memperoleh distribusi dan hasil ukuran fragmen DNA yang diinginkan. Fragmentasi DNA ultrasonik membuat langkah-langkah persiapan plasmid efisien, andal, dan terukur. Protokol dapat diskalakan secara linier dari satu hingga banyak sampel dengan menerapkan parameter ultrasound konstan.
Probe ultrasonicators dengan satu hingga lima jari sangat ideal untuk persiapan jumlah sampel yang lebih kecil. Ultrasonicators lab Hielscher tersedia dengan tingkat daya yang berbeda sehingga Anda dapat memilih pengganggu ultrasonik yang ideal untuk aplikasi terkait DNA Anda.