Persiapan Plasmid menggunakan Ultrasonication

Ultrasonication adalah teknik yang dapat diandalkan untuk memecah DNA plasmid. Amplitudo yang dapat dikontrol secara tepat, mode denyut dan kontrol suhu adalah fitur terpenting dari ultrasonicator untuk fragmentasi plasmid yang tidak merusak. Selain itu, penggunaan agen tertentu membantu melindungi dari degradasi plasmid. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk fragmentasi plasmid terkontrol dari botol tunggal, secara bersamaan sonikasi berbagai sampel serta pelat multi-sumur. Pelajari lebih lanjut tentang fragmentasi plasmid ultrasonik yang sukses!

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Fragmentasi DNA ultrasonik adalah teknik yang andal dan efisien yang biasa digunakan dalam Next Generation Sequencing (NGS).

The UIP400MTP memungkinkan ultrasonikasi pelat multi-sumur yang dikontrol dengan tepat. Salah satu aplikasi UIP400MTP adalah fragmentasi DNA plasmid untuk mendapatkan fragmen dengan panjang yang ditargetkan secara khusus.

Plasmid Shearing menggunakan Ultrasonication

Ketika sampel DNA mengalami gelombang ultrasonik, getaran yang dihasilkan secara ultrasonik menciptakan kavitasi akustik dalam cairan yang mencukur atau memecah molekul DNA dengan berat molekul tinggi melalui kekuatan mekanis. Sonikasi adalah metode yang paling banyak digunakan untuk eksperimen pencukuran DNA massal termasuk aplikasi, seperti Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), di mana ukuran fragmen kecil sangat penting untuk mendapatkan resolusi tinggi. (lihat Tseng dkk., 2012)
DNA Plasmid (pDNA) adalah bentuk spesifik dna, ditandai dengan bentuk cincinnya dan ditemukan pada bakteri dan beberapa eukariota.
PDNA supercoiled adalah bentuk DNA plasmid yang diinginkan karena menunjukkan hasil terbaik dalam proses down-stream seperti pengurutan otomatis dan transfeksi. Ultrasonication cocok untuk fragmen pDNA, termasuk pDNA supercoiled, berhasil.
Thompson et al. (2008) menunjukkan bahwa sonikasi plasmid, yang diketahui dapat memecah DNA supercoiled, adalah cara yang efektif untuk meningkatkan panjang baca urutan phred20 ke titik bahwa mereka tidak berbeda secara signifikan dari template kontrol Beckman Coulter atau plasmid linier secara enzimatik.

Keuntungan dari Fragmentasi DNA Ultrasonik

  • Justru terkendali
  • Hasil yang dapat direproduksi
  • Dapat disesuaikan dengan panjang fragmen DNA target
  • pengatur suhu
  • Dapat diskalakan ke ukuran sampel apa pun
Video menunjukkan sistem persiapan sampel ultrasonik UIP400MTP, yang memungkinkan persiapan sampel yang andal dari setiap pelat multi-sumur standar menggunakan ultrasound intensitas tinggi. Aplikasi khas UIP400MTP termasuk lisis sel, DNA, RNA, dan geser kromatin serta ekstraksi protein.

Ultrasonicator UIP400MTP untuk sonikasi pelat multi-sumur

Penggunaan Vektor Plasmid

Plasmid sering digunakan sebagai alat untuk mengkloning, mentransfer, dan memanipulasi gen. Ketika plasmid digunakan secara eksperimental untuk tujuan ini, mereka disebut vektor. Fragmen atau gen DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor plasmid, menciptakan apa yang disebut plasmid rekombinan. Vektor plasmid digunakan sebagai kendaraan untuk mendorong DNA rekombinan ke dalam sel inang dan merupakan komponen kunci dari kloning molekuler.
“Vektor non-virus sedang dipelajari secara ekstensif untuk potensi penggunaannya dalam terapi gen untuk mengobati berbagai penyakit rumit. Vektor non-virus melindungi DNA plasmid terhadap degradasi fisik, kimia, dan enzimatik dan mengirimkan molekul DNA ke lokasi target. Misalnya, liposom kationik, kitosan, dan nanopartikel bermuatan positif lainnya membentuk kompleks dengan DNA plasmid melalui interaksi elektrostatik. Namun, liposom kationik yang mudah terbentuk / kompleks DNA plasmid relatif besar (yaitu, 300-400 nm) dan bersifat heterogen sehingga sulit digunakan dalam aplikasi farmasi. DNA/liposom plasmid plasmid yang besar dan heterogen, DNA/aerosol plasmid, dan kompleks DNA/peptida plasmid dapat direduksi menjadi partikel yang lebih kecil, dan homogen menggunakan ultrasonikasi.” (Sarker dkk., 2019)
Contoh yang menonjol untuk penggunaan vektor plasmid adalah CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 biasanya dikirim ke sel sebagai plasmid besar tunggal atau beberapa plasmid yang lebih kecil yang mengkodekan urutan target, panduan CRISPR, dan Cas9.

Persiapan Ultrasonik Nanopartikel PLGA yang dimuat DNA oleh Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) menggunakan poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) untuk membentuk pembawa nanopartikel untuk pengiriman model CRISPR–Cas9 plasmid ke dalam makrofag turunan sumsum tulang primer. Untuk nanopresipitasi nanopartikel PLGA, PLGA dengan dua kelompok ujung yang berbeda (gugus ester dan amina) digunakan dengan tujuan bahwa tutup ujung amina bermuatan positif meningkatkan efisiensi enkapsulasi dan pemuatan karena interaksi muatan antara itu dan tulang punggung DNA yang bermuatan negatif. Dalam tabung centrifuge kerucut polypropylene 50 mL, 100 mg Pluronic F127 dilarutkan dalam 20 mL autocllaved DI air dengan pencampuran vortex diikuti oleh 30 menit sonikasi lembut menggunakan mandi ultrasonik (lihat CupHorn). Batang pengaduk magnetik autoklaf ditambahkan dan larutan dicampur pada 600 RPM selama 30 menit sementara solusi lainnya dibuat. Peralatan laboratorium plastik digunakan sebagai pengganti barang pecah belah di seluruh untuk meminimalkan adsorpsi DNA yang tidak spesifik. Larutan PLGA yang dilarutkan dalam DMF (44,48 mg/ ml) dan TIPS pentacene yang dilarutkan dalam THF (0,667 mg/ml) dibuat secara terpisah. PLGA dibiarkan basah dalam DMF selama 30 menit sebelum disonikasi selama 30 menit (untuk protokol lengkap lihat Jo et al., 2020)

Aplikasi terkait:

  • Ekstraksi DNA
  • Enkapsulasi DNA
  • Dispersi DNA berlapis nanopartikel
  • Pengiriman DNA plasmid ke dalam sel
UP200St TD_CupHorn untuk sonikasi sampel tidak langsung

UP200St CupHorn untuk sonikasi sampel tidak langsung, misalnya untuk ekstraksi dan fragmentasi DNA.

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Perlindungan DNA Plasmid selama Sonikasi

DNA termasuk plasmid dan plasmid supercoiled adalah degradasi yang sangat sensitif. Semua metode fragmentasi yang tersedia diketahui karena kelemahan tertentu. Fragmentasi DNA ultrasonik adalah salah satu metode yang disukai karena sonikasi terkontrol dalam kombinasi dengan langkah-langkah perlindungan memungkinkan untuk mengurangi kerusakan untai DNA yang diinduksi geser dan panas.
Selain pengaturan amplitudo rendah, mode denyut dan kontrol suhu selama pencukuran DNA ultrasonik, penggunaan agen tertentu menunjukkan efek perlindungan yang signifikan terhadap degradasi DNA. Misalnya, berbagai polimer, peptida, dan lipid melindungi DNA plasmid selama ultrasonikasi.

Cairan ionik dapat melindungi DNA plasmid terhadap kerusakan selama sonikasi.

Stabilitas DNA plasmid, dan nanokompleks DNA/IL plasmid terhadap stres geser ultrasonik diselidiki menggunakan uji elektroforesis gel agarosa. Baik DNA plasmid dan nanokompleks DNA / IL plasmid mengalami stres geser ultrasonik untuk titik waktu yang berbeda. DNA plasmid terkena stres geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, dan 40 menit. Namun, nanokompleks DNA / IL plasmid terkena tekanan geser ultrasonik selama 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit.
(studi dan gambar: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) menunjukkan bahwa ketika struktur nano plasmid DNA / cairan ionik (pDNA / IL) mengalami tekanan geser ultrasonik untuk 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, dan 120 menit dan dikompleks dengan agen pengiriman gen kationik yang tersedia secara komersial lipofectamine, persentase sel positif fluoresen adalah 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Masing-masing 65%, dan 50%, (lihat grafik di bawah). Persentase sel positif fluoresen meningkat ketika struktur nano mengalami tekanan geser ultrasonik selama 10, dan 20 menit, dan setelah itu menurun perlahan.

Fragmentasi ultrasonik DNA plasmid

Pengaruh cairan ionik [Bmim][PF6] pada pengiriman DNA plasmid ke sel COS7. Nanokompleks DNA /IL (cairan ionik) Plasmid mengalami tekanan geser ultrasonik hingga 120 menit dan dikompleks dengan LA sebelum dikirim ke sel COS7. Data menunjukkan jumlah rata-rata (%) sel HeLa positif GFP dihitung dalam 10 bidang mikroskopis yang berbeda dan percobaan dilakukan beberapa kali pada tiga hari yang berbeda. (Studi dan bagan: ©Sarker et al., 2019)

DNA Plasmid dapat dilindungi dengan menambahkan agen sebelum fragmentasi ultrasonik.

DNA Plasmid dapat dilindungi menambahkan agen sebelum fragmentasi ultrasonik: Degradasi yang diinduksi sonikasi pDNA telanjang (A) dan pDNA diformulasikan dengan 1,5 mM CaCl2 dan 20% (v / v) t-butanol (B)
Sampel disonikasi dengan probe 20W hingga 120-an, seperti yang ditunjukkan di bagian atas setiap jalur. Lane H sesuai dengan penanda Hyperladder I ™️. Pita plasmid OC dan SC ditunjukkan.
(studi dan gambar: ©Wu et al., 2009)

Persiapan Lisat Ultrasonik

Protokol Lisis Sel Ultrasonik
Ultrasonicator UP200Ht dengan microtip S26d2 untuk lisis ultrasonik sampel biologisMulailah dengan sampel sel yang diperkaya yang disiapkan melalui metode pemisahan sel (misalnya, pemisahan sel imunomagnetik, penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS), sentrifugasi gradien kepadatan, isolasi sel imunodensitas).
Sampel sel harus menunjukkan volume buffer lisis yang sesuai untuk tujuan eksperimental dan ultrasonikator tipe probe.
Buffer hipotonik lebih disukai karena mereka meningkatkan lisis sel ultrasonik. Adalah penting bahwa aditif dan konsentrasi garam digunakan dengan cara yang tepat.
Pilih perangkat lisis ultrasonik Anda: Untuk sonikasi botol tidak langsung, VialTweeter atau CupHorn direkomendasikan. Untuk pelat multiwell, UIP400MTP adalah ultrasonicator yang ideal. Dan sonikasi tipe probe klasik, homogenizer ultrasonik sebagai UP100H atau UP200Ht dengan ujung mikro paling cocok.
Protokol untuk sonikasi tipe probe: Tempatkan probe ultrasonicator ke dalam volume sampel dalam tabung microcentrifuge dan sonikasi selama sekitar 10 detik. Tergantung pada sampel DNA, sonikasi mungkin diulang satu atau dua kali lagi. Input energi ultrasonik yang diperlukan (Ws / mL) tergantung pada viskositas sampel dan jenis DNA. Pendinginan melalui penangas es dan mode denyut ultrasonikator membantu mencegah bahwa sampel terdegradasi secara termal.
Setelah lisis ultrasonik, sampel disentrifugasi untuk memisahkan puing-puing pelet (mengandung sel-sel yang tidak dilised, inti, dan organel yang tidak dilised)
Jika sampel tidak segera diproses lebih lanjut, sampel dapat disimpan pada suhu yang sesuai untuk menjaga kelangsungan hidupnya.

Ultrasonicators untuk Fragmentasi DNA

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai platform berbasis ultrasound untuk fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin. Platform yang berbeda ini termasuk probe ultrasonik (sonotrodes), solusi sonikasi tidak langsung untuk persiapan sampel simultan dari beberapa tabung atau pelat multi-sumur (misalnya, pelat 96-well, pelat microtiter), sonoreactors, dan cuphorns ultrasonik. Semua platform untuk geser DNA didukung oleh frekuensi-tuned, prosesor ultrasonik berkinerja tinggi, yang tepat dikontrol dan memberikan hasil yang dapat direproduksi.

Prosesor Ultrasonik untuk Setiap Nomor Sampel dan Ukuran

Dengan ultrasonicators multi-sampel Hielscher VialTweeter (untuk hingga 10 tabung reaksi) dan UIP400MTP (untuk pelat mikroplat / multiwell) menjadi mudah untuk mengurangi waktu pemrosesan sampel karena ultrasonikasi yang intens dan dikontrol dengan tepat sambil memperoleh distribusi dan hasil ukuran fragmen DNA yang diinginkan. Fragmentasi DNA ultrasonik membuat langkah-langkah persiapan plasmid efisien, andal, dan terukur. Protokol dapat diskalakan secara linier dari satu hingga banyak sampel dengan menerapkan parameter ultrasound konstan.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Unit persiapan multi-sampel ultrasonik VialTweeter memungkinkan sonikasi simultan hingga 10 botol. Dengan perangkat klem VialPress, hingga 4 tabung tambahan dapat ditekan ke depan untuk sonikasi intens.

pengendalian proses yang tepat

Hielscher ultrasonicators dapat dikendalikan dari jarak jauh melalui kontrol browser. Parameter sonikasi dapat dipantau dan disesuaikan secara tepat dengan persyaratan proses.Pengaturan sonikasi yang dapat dikontrol dengan tepat sangat penting karena sonifikasi lengkap dapat menghancurkan DNA, RNA dan kromatin, tetapi shearing ultrasonik yang tidak memadai menghasilkan fragmen DNA dan kromatin yang terlalu panjang. Ultrasonicator digital Hielscher dapat dengan mudah diatur ke parameter sonikasi yang tepat. Pengaturan sonikasi tertentu juga dapat disimpan sebagai pengaturan terprogram untuk pengulangan cepat prosedur yang sama.
Semua sonikasi secara otomatis di-protokol dan disimpan sebagai file CSV pada kartu SD bawaan. Hal ini memungkinkan untuk dokumentasi yang akurat dari uji coba yang dilakukan dan memungkinkan untuk merevisi sonikasi berjalan dengan mudah.
Melalui remote control browser, semua ultrasonicator digital dapat dioperasikan dan dipantau melalui browser standar apa pun. Instalasi perangkat lunak tambahan tidak diperlukan, karena koneksi LAN adalah pengaturan plug-n-play yang sangat sederhana.

Keramahan Pengguna Tertinggi selama Persiapan DNA Ultrasonik

Semua ultrasonicator Hielscher dirancang untuk memberikan ultrasound berkinerja tinggi, sementara pada saat yang sama selalu sangat user-friendly dan mudah dioperasikan. Semua pengaturan terstruktur dengan baik dalam menu yang jelas, yang dapat dengan mudah diakses melalui layar sentuh berwarna atau remote control browser. Perangkat lunak pintar dengan pengaturan yang dapat diprogram dan perekaman data otomatis memastikan pengaturan sonikasi yang optimal untuk hasil yang andal dan dapat direproduksi. Antarmuka menu yang bersih dan mudah digunakan mengubah ultrasonicator Hielscher menjadi perangkat yang mudah digunakan dan efisien.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonicators lab kami untuk lisis sel dan fragmentasi DNA:

Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
pelat multi-sumur N/a UIP400MTP
botol, gelas kimia kecil N/a Ultrasonik CupHorn
hingga 10 botol N/a VialTweeter
1 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St

Hubungi Kami! / Tanya Kami!

Meminta informasi lebih lanjut

Silakan gunakan formulir di bawah ini untuk meminta informasi tambahan tentang homogenizers ultrasonik untuk ekstraksi dan fragmentasi DNA, protokol aplikasi dan harga. Kami akan dengan senang hati mendiskusikan proses Anda dengan Anda dan menawarkan sistem ultrasonik yang memenuhi kebutuhan Anda!









Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.




Literatur/referensi

Fakta-fakta yang Patut Diketahui

Apa itu Plasmid?
Plasmid adalah molekul DNA melingkar kecil yang secara fisik terpisah dari DNA kromosom dan bereplikasi secara independen. Plasmid sering dikaitkan dengan gen yang berkontribusi pada kelangsungan hidup suatu organisme dan memberikan keuntungan spesifik, misalnya resistensi antibiotik. Plasmid paling sering ditemukan sebagai molekul DNA melingkar kecil beruntai ganda dalam bakteri; namun, plasmid kadang-kadang hadir dalam organisme archaea dan eukariotik. Plasmid adalah alat penting dalam biologi molekuler, genetika, biokimia, dan ilmu kehidupan. Dikenal sebagai vektor dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan untuk mereplikasi atau mengekspresikan gen tertentu. Perubahan vektor yang ditargetkan disebut desain vektor.

Analisis GFP dalam Penelitian Sel
Green Fluorescent Protein (GFP) adalah penanda biologis serbaguna untuk memantau proses fisiologis, memvisualisasikan lokalisasi protein, dan mendeteksi ekspresi transgenik secara in vivo. GFP dapat tereksitasi oleh garis laser 488 nm dan terdeteksi secara optimal pada 510 nm.


Ultrasonics kinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup spektrum penuh dari ultrasonicator laboratorium kompak di atas unit bench-top hingga sistem ultrasonik industri penuh.

Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizers ultrasonik kinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.