Persiapan Sampel Ultrasonik untuk Uji ELISA
Pengujian seperti ELISA banyak digunakan untuk diagnostik in-vitro, deteksi protein terkait penyakit, dan kontrol kualitas (misalnya memantau alergen makanan). Persiapan sampel ultrasonik adalah teknik yang cepat, andal, dan dapat direproduksi untuk melisiskan sel dan mengisolasi protein intraseluler, DNA, RNA, dan organel. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi ultrasonik untuk persiapan sampel tunggal yang mudah, beberapa botol serta untuk pelat mikrotiter dan pelat 96 sumur.
ELISA – Uji Imunosorben Terkait Enzim
ELISA adalah singkatan dari enzyme-linked immunosorbent assay dan merupakan teknik analisis biokimia yang banyak digunakan dari kategori uji pengikat ligan. Dalam ELISA, sampel cair ditambahkan ke fase padat stasioner dengan sifat pengikatan khusus. Biasanya, fase padat stasioner diterapkan sebagai pelapis pada pelat sumur atau pelat ELISA. Kemudian, berbagai reagen cair ditambahkan secara berurutan, diinkubasi, dan dicuci, sehingga akhirnya perubahan optik (misalnya, pengembangan warna oleh produk reaksi enzimatik) terjadi dalam cairan akhir di dalam sumur. Perubahan optik memungkinkan untuk mengukur kuantitas analit dengan apa yang disebut kuantitatif “membaca". Untuk pembacaan kuantitatif, spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer digunakan untuk mendeteksi dan mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan. Sensitivitas deteksi dipengaruhi oleh amplifikasi sinyal selama reaksi analitik. Karena reaksi enzim diselidiki dengan baik dan proses amplifikasi yang andal, enzim digunakan untuk membuat sinyal. Enzim dihubungkan ke reagen deteksi dalam proporsi tetap untuk memungkinkan kuantifikasi yang akurat, yang juga menjelaskan nama uji imunosorben "terkait enzim".
Karena uji ELISA dilakukan dalam pelat mikrotiter / pelat 96 sumur, ini dikenal sebagai teknik pengujian berbasis pelat dan digunakan misalnya dalam diagnostik in-vitro klinis, penelitian, pengembangan obat, dll. untuk mendeteksi dan mengukur antibodi, peptida, protein, dan hormon.
Teknik ELISA sering digunakan sebagai alat diagnostik dalam kedokteran, biotek, patologi tanaman dan juga merupakan pengukuran kontrol kualitas yang penting di berbagai industri.
Unit persiapan sampel ultrasonik VialTweeter digunakan untuk lisis sel dan ekstraksi protein sebelum uji ELISA
Persiapan Sampel Ultrasonik sebelum ELISA
Sebelum uji ELISA dapat dilakukan, sampel memerlukan langkah-langkah persiapan seperti lisis sel dan ekstraksi protein intraseluler, DNA, RNA, dll. Keuntungan dari lisis sel ultrasonik dan isolasi protein adalah efisiensi, keandalan, dan reproduktifitasnya yang tinggi. Semua faktor ini penting untuk mendapatkan diagnostik dan hasil penelitian berkualitas tinggi
- Perlakuan sampel homogen
- Lisis lengkap
- Ekstraksi protein lengkap (misalnya antibodi, DNA)
- Adaptasi optimal terhadap jenis sel
- Untuk ukuran sampel apa pun
- direproduksi
- Suhu dikontrol
- Protokol data otomatis pada kartu SD
Protokol untuk Lisis Sel Ultrasonik Pra-ELISA
- Untuk kultur sel: Sebelum lisis sel ultrasonik, centrifuge sel selama 5 menit pada 270 x g dalam mikrosentrifugal. Keluarkan supernatan dengan aspirasi dan tangguhkan kembali sel dalam 30 – 100 μL buffer RIPA. Kemudian, inkubasi pelet sel di atas es selama 30 menit.
- Sekarang, sampel sel siap untuk lisis ultrasonik:
Gunakan ultrasonicator tipe probe (misalnya UP200Ht dengan probe S26d2) atau perangkat multi-sampel ultrasonik (misalnya VialTweeter untuk sonikasi simultan hingga 10 botol atau UIP400MPT untuk pelat mikrotiter / pelat 96-sumur) tergantung pada jumlah sampel yang perlu Anda siapkan.
Untuk sonikasi tipe probe dari satu sampel, tempatkan sel dalam tabung mikrosentrifugal 1,5 mL. - Atur durasi ultrasonik Anda, input energi total, mode siklus dan / atau batas suhu di menu digital ultrasonicator. Ini memastikan sonikasi dan pengulangan yang sangat andal.
- Masukkan sonotrode dan nyalakan perangkat ultrasonik. Gerakkan perlahan ujung mikro probe ultrasonik melalui sampel untuk sonikasi sampel secara seragam.
Untuk sebagian besar sel, lisis ultrasonik akan selesai setelah 2 -4 siklus sonikasi 10 detik. - Setelah sonikasi, lepaskan sonotrode dari sampel. Sampel harus diinkubasi di atas es selama 5 menit. Kemudian, centrifuge pada 10.000 x g selama 20 menit untuk membuat pelet puing-puing. Pindahkan supernatan ke tabung mikrosentrifugal baru. Beri label pada analit dan simpan pada suhu -20°C.
- Sontrode ultrasonik dapat dibersihkan dengan menyekanya dengan benar dengan alkohol atau sonikat dalam gelas kimia yang diisi dengan alkohol, misalnya etanol 70%. Semua probe ultrasonik yang terbuat dari titanium dapat diautoklaf.
Ekstraksi protein dari sel E.dengan probe ultrasonik UP200St
- Bilas jaringan dengan PBS sedingin es (0,01M, pH=7,4) untuk menghilangkan kelebihan darah hemolisis secara menyeluruh.
- Timbang jaringan (ginjal, jantung, paru-paru, limpa, dll.) dan maserasi menjadi potongan-potongan kecil, yang dihomogenkan dalam PBS. Volume PBS yang dibutuhkan terkait dengan berat jaringan. Sebagai aturan praktis, 1g jaringan membutuhkan sekitar 9mL PBS. Dianjurkan untuk menambahkan beberapa inhibitor protease ke PBS. (RIPA atau buffer lisis hipotonik yang mengandung protease dan koktail inhibitor fosfatase dapat digunakan sebagai alternatif.)
- Tergantung pada ukuran jaringan, perawatan pusaran singkat (sekitar 1-2 menit dalam 15 detik pulsa) dapat membantu untuk melakukan pra-perawatan jaringan.
- Pasang ujung mikro, misalnya S26d2, ke ultrasonicator Anda. Tempatkan tabung sampel dengan jaringan dalam penangas es.
- Sonicasi sampel dengan ultrasonicator Anda, misalnya UP200St (80% amplitudo) selama 1 menit dalam mode pulsa (15 detik aktif, jeda 15 detik). Simpan sampel di penangas es.
- Homogenat kemudian disentrifugasi untuk mendapatkan kumpulan spesifik (sitosolik, nuklir, mitokondria atau lisosomal) untuk memperkaya protein untuk analisis. Dengan sentrifugasi sampel selama 5 menit pada 5000×g, supernatan diambil.
Sonotrode MTP-24-8-96 memiliki delapan probe ultrasonik untuk sonikasi sumur pelat mikrotiter.
Kontrol Suhu yang Andal selama Sonikasi
Suhu adalah faktor penting yang mempengaruhi proses yang sangat penting untuk perlakuan sampel biologis, misalnya untuk mencegah degradasi termal protein. Seperti semua teknik persiapan sampel mekanis, sonikasi menciptakan panas. Namun, suhu sampel dapat dikontrol dengan baik saat menggunakan perangkat Hielscher Ultrasonics. Kami menyajikan berbagai opsi untuk memantau dan mengontrol suhu sampel Anda sambil mempersiapkannya dengan ultrasonicator tipe probe atau VialTweeter pra-analitik.
- Memantau suhu sampel: Semua prosesor ultrasonik digital Hielscher dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dicolokkan. Colokkan sensor suhu ke perangkat ultrasonik (misalnya, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP) dan masukkan ujung sensor suhu ke salah satu tabung sampel. Melalui layar sentuh berwarna digital, Anda dapat mengatur di menu prosesor ultrasonik kisaran suhu tertentu untuk sonikasi sampel Anda. Ultrasonicator akan berhenti secara otomatis ketika suhu maksimum tercapai dan berhenti sampai sample suhu turun ke nilai yang lebih rendah dari ∆ suhu yang disetel. Kemudian sonikasi dimulai secara otomatis lagi. Fitur pintar ini mencegah degradasi yang disebabkan oleh panas.
- Mengenai unit multi-sampel ultrasonik VialTweeter, blok titanium, yang menahan tabung sampel, dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
- Gunakan penangas es atau es kering untuk mendinginkan selama sonikasi. Tempatkan tabung sampel Anda selama sonikasi ke dalam penangas es. Untuk VialTweeter, gunakan nampan dangkal berisi es kering dan letakkan VialTweeter di atas es kering agar panas dapat menghilang dengan cepat.
Pelanggan di seluruh dunia menggunakan ultrasonicators tipe probe Hielscher serta unit sonikasi multi-sampel VialTweeter dan UIP400MTP untuk pekerjaan persiapan sampel harian mereka di laboratorium biologi, biokimia, medis dan klinis. Perangkat lunak cerdas dan kontrol suhu prosesor Hielscher, suhu dikontrol dengan andal dan degradasi sampel yang diinduksi panas dihindari. Persiapan sampel ultrasonik dengan solusi ultrasonik Hielscher memberikan hasil yang sangat andal dan dapat direproduksi!
Baca lebih lanjut tentang sonikasi throughput tinggi menggunakan UIP400MTP sonicator pelat multi-sumur untuk pengujian!
Hubungi Kami! / Tanya Kami!
Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk aplikasi pencampuran, dispersi, emulsifikasi, dan ekstraksi pada skala laboratorium, percontohan, dan industri.
Literatur / Referensi
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
Apa Jenis ELISA yang ada?
Ada beberapa jenis ELISA, yang dibedakan berdasarkan prinsip fungsinya. Mereka dikenal sebagai ELISA langsung, ELISA tidak langsung, ELISA sandwich, ELISA kompetitif, dan ELISA terbalik. Di bawah ini, kami menyajikan gambaran umum tentang berbagai jenis ELISA serta karakteristik serta perbedaan utamanya.
ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan hasil positif atau negatif yang sederhana, sedangkan dalam ELISA kuantitatif kerapatan optik (OD) sampel dibandingkan dengan kurva standar, yang biasanya merupakan pengenceran serial dari larutan konsentrasi yang diketahui dari molekul target.
ELISA Langsung
ELISA langsung adalah bentuk uji Elisa yang paling sederhana, di mana hanya antibodi primer berlabel enzim yang digunakan dan antibodi sekunder tidak diperlukan. Antibodi primer berlabel enzim berikatan langsung ke target, yaitu antigen. Larutan antigen yang dibuffer ditambahkan ke setiap sumur pelat mikrotiter (biasanya pelat 96 sumur, pelat ELISA), di mana menempel pada permukaan plastik melalui interaksi muatan. Ketika enzim yang terkait dengan antibodi primer bereaksi dengan substratnya, ia menghasilkan sinyal terlihat yang dapat diukur melalui spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer.
ELISA Tidak Langsung
Untuk tes ELISA tidak langsung, antibodi primer dan antibodi sekunder diperlukan. Namun, bertentangan dengan ELISA langsung, bukan antibodi primer, tetapi antibodi sekunder diberi label dengan enzim. Antigen diimobilisasi ke pelat sumur dan terikat oleh antibodi primer. Selanjutnya, antibodi sekunder berlabel enzim berikatan dengan antibodi primer. Akhirnya, enzim yang terkait dengan antibodi sekunder bereaksi dengan substratnya untuk menghasilkan sinyal terlihat yang dapat dideteksi.
Sandwich ELISA
Sementara dalam tes ELISA langsung dan tidak langsung, antigen diimobilisasi dan dilapisi ke permukaan pelat sumur, dalam sandwich ELISA antibodi diimobilisasi ke permukaan plastik pelat ELISA. Antibodi yang tidak bergerak dalam sandwich ELISA dikenal sebagai antibodi tangkap. Selain antibodi tangkap, dalam sandwich ELISA juga diperlukan apa yang disebut antibodi deteksi. Antibodi deteksi termasuk antibodi deteksi primer yang tidak berlabel dan antibodi deteksi sekunder berlabel enzim.
Secara bertahap, antigen yang diinginkan berikatan dengan antibodi penangkap yang diimobilisasi ke pelat. Kemudian, antibodi deteksi primer berikatan dengan antigen. Setelah itu, antibodi deteksi sekunder berikatan dengan antibodi deteksi primer. Pada langkah reaksi terakhir, enzim bereaksi dengan substratnya untuk menghasilkan sinyal terlihat yang dapat dideteksi secara optik.
ELISA Kompetitif
ELISA kompetitif, juga dikenal sebagai ELISA penghambat, adalah jenis ELISA yang paling kompleks karena melibatkan penggunaan antigen inhibitor. Masing-masing dari tiga format, langsung, tidak langsung, dan sandwich ELISA, dapat disesuaikan dengan format ELISA yang kompetitif. Dalam ELISA kompetitif, antigen inhibitor dan antigen yang diinginkan bersaing untuk mengikat antibodi primer.
Untuk ELISA kompetitif, antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan adanya antigennya, yaitu sampel. Kompleks antibodi/antigen yang terikat ini kemudian ditambahkan ke sumur berlapis antigen.
Pelat dicuci, sehingga antibodi yang tidak terikat dihilangkan. ELISA kompetitif memiliki namanya karena fakta bahwa semakin banyak antigen dalam sampel, semakin banyak kompleks antigen-antibodi yang terbentuk. Ini berarti, ada lebih sedikit antibodi yang tidak terikat yang tersedia untuk mengikat antigen di dalam sumur dan antigen harus bersaing untuk mendapatkan antibodi yang tersedia. Antibodi sekunder, yang cocok dengan antibodi primer, ditambahkan. Antibodi kedua ini terkait dengan enzim. Ketika substrat ditambahkan, enzim yang tersisa menghasilkan sinyal kromogenik atau fluoresen.
Pada titik ini, reaksi dihentikan untuk menghindari kejenuhan sinyal pada akhirnya.
Beberapa kit ELISA kompetitif menyertakan antigen terkait enzim alih-alih antibodi terkait enzim. Antigen berlabel bersaing untuk situs pengikatan antibodi primer dengan sampel antigen (tidak berlabel). Semakin sedikit antigen dalam sampel, semakin banyak antigen berlabel yang dipertahankan di dalam sumur dan semakin kuat sinyalnya.
ELISA terbalik
Reverse ELISA tidak menggunakan pelat sumur, tetapi membiarkan antigen tersuspensi dalam cairan uji. Tes ELISA terbalik mengukur jumlah antibodi yang terikat melalui antigen. Ini dikembangkan secara khusus untuk mendeteksi dan menyelidiki protein selubung virus West Nile dan bagaimana ia dapat menemukan antibodi spesifik virus.
Penanda Enzim Mana yang Digunakan untuk ELISA?
Daftar di bawah ini memberikan penanda enzimatik yang paling umum digunakan dalam uji ELISA, yang memungkinkan hasil pengujian diukur setelah selesai.
- OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) berubah menjadi kuning untuk mendeteksi HRP (Horseradish Peroxidase), yang sering digunakan sebagai protein terkonjugasi.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) berubah menjadi biru saat mendeteksi HRP dan berubah menjadi kuning setelah penambahan asam sulfat atau fosfat.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) berubah menjadi hijau saat mendeteksi HRP.
- PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) menguning saat mendeteksi alkali fosfatase.