Preparasi Sampel Ultrasonik untuk Uji ELISA

Uji seperti ELISA banyak digunakan untuk diagnostik in vitro, deteksi protein terkait penyakit, dan pengendalian mutu (misalnya pemantauan alergen makanan). Preparasi sampel ultrasonik merupakan teknik yang cepat, andal, dan dapat direproduksi untuk melisis sel serta mengisolasi protein intraseluler, DNA, RNA, dan organel. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi ultrasonik untuk memudahkan preparasi sampel tunggal, beberapa vial, serta pelat mikrotiter dan pelat 96 sumur.

ELISA – Uji Imunosorben Terkait Enzim

ELISA merupakan singkatan dari enzyme-linked immunosorbent assay (uji imunosorben terkait enzim) dan merupakan teknik analisis biokimia yang banyak digunakan dalam kategori uji pengikatan ligan. Dalam ELISA, sampel cair ditambahkan ke fase padat stasioner yang memiliki sifat pengikatan khusus. Biasanya, fase padat stasioner diaplikasikan sebagai lapisan pada pelat sumur atau pelat ELISA. Kemudian, berbagai reagen cair ditambahkan secara berurutan, diinkubasi, dan dicuci, sehingga akhirnya terjadi perubahan optik (misalnya pembentukan warna oleh produk reaksi enzimatik) pada cairan akhir di dalam sumur. Perubahan optik ini memungkinkan pengukuran jumlah analit melalui apa yang disebut “pembacaan” kuantitatif. Untuk pembacaan kuantitatif, spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer digunakan untuk mendeteksi dan mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan. Sensitivitas deteksi dipengaruhi oleh amplifikasi sinyal selama reaksi analitik. Karena reaksi enzim merupakan proses amplifikasi yang telah diteliti secara mendalam dan andal, enzim digunakan untuk menghasilkan sinyal. Enzim dihubungkan dengan reagen deteksi dalam proporsi tetap untuk memungkinkan kuantifikasi yang akurat, yang juga menjelaskan nama uji imunosorben “terkait enzim”.
Karena uji ELISA dilakukan pada pelat mikrotiter / pelat 96 sumur, teknik ini dikenal sebagai teknik uji berbasis pelat dan digunakan, misalnya, dalam diagnostik klinis in vitro, penelitian, pengembangan obat, dan sebagainya untuk mendeteksi dan mengukur antibodi, peptida, protein, serta hormon.
Teknik ELISA sering digunakan sebagai alat diagnostik dalam kedokteran, bioteknologi, dan patologi tumbuhan, serta merupakan pengukuran pengendalian mutu yang penting di berbagai industri.

Susunan lengkap VialTweeter: sonotrode VialTweeter pada prosesor ultrasonik UP200St

Unit preparasi sampel ultrasonik VialTweeter digunakan untuk lisis sel dan ekstraksi protein sebelum uji ELISA

Preparasi Sampel Ultrasonik sebelum ELISA

Sebelum uji ELISA dapat dilakukan, sampel memerlukan tahap preparasi seperti lisis sel dan ekstraksi protein intraseluler, DNA, RNA, dan sebagainya. Keunggulan lisis sel ultrasonik dan isolasi protein adalah efisiensi, keandalan, serta reproduktibilitasnya yang tinggi. Semua faktor ini penting untuk memperoleh hasil diagnostik dan penelitian yang berkualitas tinggi

Keunggulan Lisis Ultrasonik sebelum ELISA

Perlakuan sampel yang homogen
Lisis lengkap
Ekstraksi protein lengkap (misalnya antibodi, DNA)
Penyesuaian optimal dengan jenis sel
Untuk segala ukuran sampel
Dapat direproduksi
Suhu terkendali
Pencatatan data otomatis pada kartu SD

Tutorial ini menjelaskan jenis sonikator yang paling sesuai untuk tugas preparasi sampel Anda, seperti lisis, disrupsi sel, isolasi protein, serta fragmentasi DNA dan RNA di laboratorium, dalam analisis, dan dalam penelitian. Pilih jenis sonikator yang ideal untuk aplikasi, volume sampel, jumlah sampel, dan kapasitas pemrosesan sampel Anda. Hielscher Ultrasonics memiliki homogenizer ultrasonik yang ideal untuk Anda!

Protokol Lisis Sel Ultrasonik sebelum ELISA

Untuk Kultur Sel: Sebelum lisis sel ultrasonik, sentrifugasi sel selama 5 menit pada 270 x g menggunakan mikrosentrifus. Buang supernatan dengan aspirasi dan suspensikan kembali sel dalam 30 – 100 μL larutan penyangga RIPA. Kemudian, inkubasi pelet sel di atas es selama 30 menit.
Kini, sampel sel siap untuk lisis ultrasonik:
Gunakan sonikator ultrasonik tipe probe (misalnya UP200Ht dengan probe S26d2) atau perangkat ultrasonik multisampel (misalnya VialTweeter untuk sonikasi serentak hingga 10 vial atau UIP400MPT untuk pelat mikrotiter / pelat 96 sumur), bergantung pada jumlah sampel yang perlu Anda siapkan.
Untuk sonikasi sampel tunggal dengan tipe probe, tempatkan sel dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL.
Atur terlebih dahulu durasi ultrasonik, masukan energi total, mode siklus, dan/atau batas suhu pada menu digital sonikator ultrasonik. Hal ini memastikan sonikasi yang sangat andal dan keterulangan.
Masukkan sonotrode dan nyalakan perangkat ultrasonik. Gerakkan ujung mikro probe ultrasonik secara perlahan di dalam sampel untuk melakukan sonikasi secara merata.
Untuk sebagian besar sel, lisis ultrasonik akan selesai setelah 2–4 siklus sonikasi masing-masing selama 10 detik.
Setelah sonikasi, keluarkan sonotrode dari sampel. Sampel harus diinkubasi di atas es selama 5 menit. Kemudian, sentrifugasi pada 10.000 x g selama 20 menit untuk mengendapkan debris menjadi pelet. Pindahkan supernatan ke tabung mikrosentrifus baru. Beri label pada analit dan simpan pada -20°C.
Sonotrode ultrasonik dapat dibersihkan dengan menyekanya secara menyeluruh menggunakan alkohol atau melakukan sonikasi dalam gelas beker berisi alkohol, misalnya etanol 70%. Semua probe ultrasonik yang terbuat dari titanium dapat disterilkan menggunakan autoklaf.

Sonikator ultrasonik tipe probe seperti UP200St merupakan homogenizer jaringan yang andal dan banyak digunakan untuk preparasi sampel dalam genetika, misalnya untuk lisis E.coli

Ekstraksi protein dari sel E.coli menggunakan probe ultrasonik UP200St

Untuk Homogenat Jaringan:

Bilas jaringan dengan PBS sedingin es (0,01M, pH=7,4) untuk menghilangkan kelebihan darah yang mengalami hemolisis secara menyeluruh.
Timbang jaringan (ginjal, jantung, paru-paru, limpa, dan sebagainya) dan maserasi menjadi potongan kecil, yang kemudian dihomogenisasi dalam PBS. Volume PBS yang diperlukan berkaitan dengan berat jaringan. Sebagai pedoman umum, 1g jaringan memerlukan sekitar 9mL PBS. Disarankan untuk menambahkan inhibitor protease ke dalam PBS. (Sebagai alternatif, dapat digunakan larutan penyangga RIPA atau larutan penyangga lisis hipotonik yang mengandung campuran inhibitor protease dan fosfatase.)
Bergantung pada ukuran jaringan, perlakuan vorteks singkat (sekitar 1–2 menit dalam pulsa 15 detik) dapat membantu sebagai praperlakuan jaringan.
Pasang ujung mikro, misalnya S26d2, pada sonikator ultrasonik Anda. Tempatkan tabung sampel berisi jaringan dalam penangas es.
Lakukan sonikasi sampel dengan sonikator ultrasonik Anda, misalnya UP200St (amplitudo 80%), selama 1 menit dalam mode pulsa (15 detik aktif, 15 detik jeda). Pertahankan sampel dalam penangas es.
Homogenat kemudian disentrifugasi untuk memperoleh fraksi tertentu (sitosolik, nuklir, mitokondria, atau lisosomal) guna memperkaya protein untuk analisis. Supernatan diperoleh dengan menyentrifugasi sampel selama 5 menit pada 5000×g.

Sonotrode MTP-24-8-96 memiliki delapan probe ultrasonik untuk sonikasi sumur pada pelat mikrotiter.

Pengendalian Suhu yang Andal selama Sonikasi

Suhu merupakan faktor penting yang memengaruhi proses dan sangat penting khususnya untuk perlakuan sampel biologis, misalnya untuk mencegah degradasi termal protein. Seperti semua teknik preparasi sampel mekanis, sonikasi menghasilkan panas. Namun, suhu sampel dapat dikendalikan dengan baik saat menggunakan perangkat Hielscher Ultrasonics. Kami menyajikan berbagai pilihan untuk memantau dan mengendalikan suhu sampel Anda selama preparasi praanalitik menggunakan sonikator ultrasonik tipe probe atau VialTweeter.

Pemantauan suhu sampel: Semua prosesor ultrasonik digital Hielscher dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dihubungkan. Hubungkan sensor suhu ke perangkat ultrasonik (misalnya, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikator pelat multisumur UIP400MTP) dan masukkan ujung sensor suhu ke salah satu tabung sampel. Melalui layar sentuh digital berwarna, Anda dapat mengatur rentang suhu tertentu untuk sonikasi sampel pada menu prosesor ultrasonik. Sonikator ultrasonik akan berhenti secara otomatis saat suhu maksimum tercapai dan menjeda hingga suhu sampel turun ke nilai batas bawah dari rentang suhu ∆ yang diatur. Kemudian, sonikasi dimulai kembali secara otomatis. Fitur cerdas ini mencegah degradasi akibat panas.
Pada unit ultrasonik multisampel VialTweeter, blok titanium yang menampung tabung sampel dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari pendingin atau pembeku untuk mendinginkan blok titanium terlebih dahulu, sehingga membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
Gunakan penangas es atau es kering untuk pendinginan selama sonikasi. Tempatkan tabung sampel Anda dalam penangas es selama sonikasi. Untuk VialTweeter, gunakan baki dangkal berisi es kering dan tempatkan VialTweeter di atas es kering agar panas dapat dilepaskan dengan cepat.

Pelanggan di seluruh dunia menggunakan sonikator ultrasonik tipe probe Hielscher serta unit sonikasi multisampel VialTweeter dan UIP400MTP untuk pekerjaan preparasi sampel sehari-hari di laboratorium biologi, biokimia, medis, dan klinis. Dengan perangkat lunak cerdas dan pengendalian suhu prosesor Hielscher, suhu dikendalikan secara andal dan degradasi sampel akibat panas dapat dihindari. Preparasi sampel ultrasonik dengan solusi ultrasonik Hielscher memberikan hasil yang sangat andal dan dapat direproduksi!
Baca selengkapnya tentang sonikasi dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi menggunakan sonikator pelat multisumur UIP400MTP untuk pengujian!

Hubungi Kami! / Tanyakan kepada Kami!

Homogenizer ultrasonik dengan gaya geser tinggi digunakan dalam pemrosesan di laboratorium, di atas meja kerja, pada skala percontohan, dan pada skala industri.

Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk aplikasi pencampuran, dispersi, emulsifikasi, dan ekstraksi pada skala laboratorium, percontohan, dan industri.

Topik Terkait

Literatur / Referensi

Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.

Fakta yang Perlu Diketahui

Apa Saja Jenis ELISA?

Ada beberapa jenis ELISA yang dibedakan berdasarkan prinsip kerjanya. Jenis-jenis ini dikenal sebagai ELISA langsung, ELISA tidak langsung, ELISA sandwich, ELISA kompetitif, dan ELISA terbalik. Di bawah ini, kami menyajikan gambaran umum berbagai jenis ELISA beserta karakteristik utama dan perbedaannya.
ELISA dapat dilakukan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan hasil sederhana berupa positif atau negatif, sedangkan dalam ELISA kuantitatif, densitas optik (OD) sampel dibandingkan dengan kurva standar, yang biasanya dibuat dari pengenceran serial larutan molekul target dengan konsentrasi yang diketahui.

ELISA Langsung

ELISA langsung merupakan bentuk uji ELISA yang paling sederhana, yang hanya menggunakan antibodi primer berlabel enzim dan tidak memerlukan antibodi sekunder. Antibodi primer berlabel enzim berikatan langsung dengan target, yaitu antigen. Larutan antigen berpenyangga ditambahkan ke setiap sumur pelat mikrotiter (biasanya pelat 96 sumur, pelat ELISA), tempat antigen melekat pada permukaan plastik melalui interaksi muatan. Ketika enzim yang terhubung dengan antibodi primer bereaksi dengan substratnya, enzim tersebut menghasilkan sinyal tampak yang dapat diukur menggunakan spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer.

ELISA Tidak Langsung

Untuk uji ELISA tidak langsung, diperlukan antibodi primer maupun antibodi sekunder. Namun, berbeda dengan ELISA langsung, antibodi yang diberi label enzim adalah antibodi sekunder, bukan antibodi primer. Antigen diimobilisasi pada pelat sumur dan diikat oleh antibodi primer. Selanjutnya, antibodi sekunder berlabel enzim berikatan dengan antibodi primer. Akhirnya, enzim yang terhubung dengan antibodi sekunder bereaksi dengan substratnya untuk menghasilkan sinyal tampak yang dapat dideteksi.

ELISA Sandwich

Pada uji ELISA langsung dan tidak langsung, antigen diimobilisasi dan dilapiskan pada permukaan pelat sumur, sedangkan pada ELISA sandwich, antibodi diimobilisasi pada permukaan plastik pelat ELISA. Antibodi yang diimobilisasi dalam ELISA sandwich dikenal sebagai antibodi penangkap. Selain antibodi penangkap, ELISA sandwich juga memerlukan apa yang disebut antibodi deteksi. Antibodi deteksi mencakup antibodi deteksi primer tanpa label dan antibodi deteksi sekunder berlabel enzim.
Secara bertahap, antigen yang diteliti berikatan dengan antibodi penangkap yang diimobilisasi pada pelat. Kemudian, antibodi deteksi primer berikatan dengan antigen. Setelah itu, antibodi deteksi sekunder berikatan dengan antibodi deteksi primer. Pada tahap reaksi terakhir, enzim bereaksi dengan substratnya untuk menghasilkan sinyal tampak yang dapat dideteksi secara optik.

ELISA Kompetitif

ELISA kompetitif, yang juga dikenal sebagai ELISA inhibisi, merupakan jenis ELISA paling kompleks karena melibatkan penggunaan antigen inhibitor. Ketiga format, yaitu ELISA langsung, tidak langsung, dan sandwich, masing-masing dapat diadaptasi ke format ELISA kompetitif. Dalam ELISA kompetitif, antigen inhibitor dan antigen yang diteliti bersaing untuk berikatan dengan antibodi primer.
Untuk ELISA kompetitif, antibodi tanpa label diinkubasi dengan keberadaan antigennya, yaitu sampel. Kompleks antibodi/antigen yang telah berikatan ini kemudian ditambahkan ke sumur berlapis antigen.
Pelat dicuci sehingga antibodi yang tidak terikat dibuang. ELISA kompetitif dinamai demikian karena semakin banyak antigen dalam sampel, semakin banyak kompleks antigen-antibodi yang terbentuk. Artinya, semakin sedikit antibodi tidak terikat yang tersedia untuk berikatan dengan antigen di dalam sumur, dan antigen harus bersaing untuk mendapatkan antibodi yang tersedia. Antibodi sekunder yang sesuai dengan antibodi primer ditambahkan. Antibodi kedua ini terhubung dengan enzim. Ketika substrat ditambahkan, enzim yang tersisa menghasilkan sinyal kromogenik atau fluoresen.
Pada tahap ini, reaksi dihentikan untuk menghindari kejenuhan sinyal yang pada akhirnya dapat terjadi.
Beberapa kit ELISA kompetitif menyertakan antigen terkait enzim sebagai pengganti antibodi terkait enzim. Antigen berlabel bersaing dengan antigen sampel (tanpa label) untuk mendapatkan situs pengikatan antibodi primer. Semakin sedikit antigen dalam sampel, semakin banyak antigen berlabel yang tertahan di dalam sumur dan semakin kuat sinyalnya.

ELISA Terbalik

ELISA terbalik tidak menggunakan pelat sumur, tetapi membiarkan antigen tersuspensi dalam cairan uji. Uji ELISA terbalik mengukur jumlah antibodi yang terikat melalui antigen. Uji ini dikembangkan secara khusus untuk mendeteksi dan meneliti protein selubung virus West Nile serta bagaimana hal tersebut mampu menemukan antibodi spesifik virus.

Penanda Enzimatik Apa yang Digunakan untuk ELISA?

Daftar di bawah ini memuat penanda enzimatik yang paling umum digunakan dalam uji ELISA, yang memungkinkan hasil uji diukur setelah pengujian selesai.

OPD (o-fenilendiamina dihidroklorida) berubah menjadi kuning ambar untuk mendeteksi HRP (peroksidase lobak), yang sering digunakan sebagai protein terkonjugasi.
TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) berubah menjadi biru saat mendeteksi HRP dan berubah menjadi kuning setelah penambahan asam sulfat atau asam fosfat.
ABTS (garam diamonium 2,2′-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-sulfonat]) berubah menjadi hijau saat mendeteksi HRP.
PNPP (p-nitrofenil fosfat, garam dinatrium) berubah menjadi kuning saat mendeteksi fosfatase alkali.