Persiapan Sampel Ultrasonik untuk Alat Tes ELISA

Alat tes seperti ELISA banyak digunakan untuk diagnostik in-vitro, deteksi protein terkait penyakit dan kontrol kualitas (misalnya memantau alergen makanan). Persiapan sampel ultrasonik adalah teknik cepat, andal dan dapat direproduksi untuk lyse cell dan mengisolasi protein intraseluler, DNA, RNA dan organel. Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi ultrasonik untuk persiapan sampel tunggal yang nyaman, beberapa botol serta untuk pelat mikrotiter dan piring 96 sumur.

ELISA – Enzim-Linked Immunosorbent Assay

ELISA adalah singkatan dari alat tes imunosorbent terkait enzim dan merupakan teknik analisis biokimia yang banyak digunakan dari kategori alat tes ligan-mengikat. Di ELISA, sampel cairan ditambahkan ke fase padat stasioner dengan sifat pengikatan khusus. Biasanya, fase padat stasioner diterapkan sebagai pelapis ke pelat sumur atau pelat ELISA. Kemudian, berbagai reagen cair ditambahkan secara berurutan, diinkubasi, dan dicuci, sehingga akhirnya terjadi perubahan optik (misalnya, pengembangan warna oleh produk reaksi enzimatik) terjadi pada cairan akhir di dalam sumur. Perubahan optik memungkinkan untuk mengukur kuantitas anilit oleh apa yang disebut kuantitatif “membaca". Untuk pembacaan kuantitatif, spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer digunakan untuk mendeteksi dan mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan. Sensitivitas deteksi dipengaruhi oleh amplifikasi sinyal selama reaksi analitik. Karena reaksi enzim diselidiki dengan baik dan proses amplifikasi yang dapat diandalkan, enzim digunakan untuk membuat sinyal. Enzim terkait dengan reagen deteksi dalam proporsi tetap untuk memungkinkan kuantifikasi yang akurat, yang menjelaskan juga nama "enzim-linked" alat tes imuno.
Karena alat tes ELISA dilakukan dalam pelat mikrotiter / pelat 96 sumur, dikenal sebagai teknik alat tes berbasis lempeng dan digunakan misalnya dalam diagnostik in-vitro klinis, penelitian, pengembangan obat dll untuk mendeteksi dan mengukur antibodi, peptida, protein, dan hormon.
Teknik ELISA sering digunakan sebagai alat diagnostik dalam kedokteran, bioteknologi, patologi tanaman dan juga merupakan pengukuran kontrol kualitas yang penting di beberapa industri.

Persiapan Sampel Ultrasonik sebelum ELISA

Sebelum alat tes ELISA dapat dilakukan, sampel memerlukan langkah-langkah persiapan lisis sel tersebut dan ekstraksi protein intraseluler, DNA, RNA dll. Keuntungan dari lisis sel ultrasonik dan isolasi protein adalah efisiensi, keandalan, dan reproduksi yang tinggi. Semua faktor ini penting untuk mendapatkan diagnostik dan hasil penelitian berkualitas tinggi

Protokol untuk Pra-ELISA Ultrasonic Cell Lysis

• Untuk Budaya Sel: Sebelum lisis sel ultrasonik, sel sentrifuge selama 5 menit pada 270 x g dalam mikrocentrifuge. Hapus supernatant dengan aspirasi dan resuspend sel dalam 30 – 100 μL penyangga RIPA. Kemudian, inkubasi pelet sel di atas es selama 30 menit.
• Sekarang, sampel sel siap untuk lisis ultrasonik:
  Gunakan ultrasonikator tipe probe (misalnya. UP200Ht dengan S26d2 probe) atau perangkat multi-sampel ultrasonik (misalnya VialTweeter untuk sonikasi simultan hingga 10 botol atau UIP400MPT untuk pelat mikrotiter / pelat 96-sumur) tergantung pada jumlah sampel yang perlu Anda siapkan.
  Untuk sonikasi jenis probe dari satu sampel, tempatkan sel dalam tabung mikrocentrifuge 1,5 mL.
• Pra-atur durasi ultrasonik Anda, input energi total, mode siklus dan / atau batas suhu di menu digital ultrasonikator. Ini memastikan sonikasi dan pengulangan yang sangat andal.
• Inset sonotrode dan nyalakan perangkat ultrasonik. Gerakkan mikro-ujung probe ultrasonik dengan lembut melalui sampel untuk membuat sonikasi sampel secara seragam.
  Untuk sebagian besar sel, lisis ultrasonik akan selesai setelah 2 -4 siklus sonikasi 10 detik.
• Setelah sonikasi, keluarkan sonotrode dari sampel. Sampel harus diinkubasi di atas es selama 5 menit. Kemudian, sentrifuge pada 10.000 x g selama 20 menit untuk pelet puing-puing. Transfer supernatants ke tabung microcentrifuge baru. Beri label analit dan simpan pada -20 °C.
• Sonotrode ultrasonik dapat dibersihkan dengan menyekanya dengan benar dengan alkohol atau sonikat dalam gelas bir yang diisi dengan alkohol, misalnya 70% etanol. Semua probe ultrasonik yang terbuat dari titanium dapat diotolabel.

Untuk Homogenates Jaringan:

• Bilas jaringan dengan PBS dingin es (0,01M, pH = 7,4) untuk menghilangkan kelebihan darah hemolisis secara menyeluruh.
• Timbang jaringan (ginjal, jantung, paru-paru, limpa dll.) dan maserasi menjadi potongan-potongan kecil, yang homogen di PBS. Volume PBS yang dibutuhkan terkait dengan berat jaringan. Sebagai aturan praktis, 1g jaringan membutuhkan sekitar 9mL PBS. Disarankan untuk menambahkan beberapa inhibitor protease ke PBS. (RIPA atau penyangga lisis hipontonik yang mengandung koktail protease dan inhibitor fosfat dapat digunakan sebagai alternatif.)
• Tergantung pada ukuran jaringan, perawatan pusaran pendek (sekitar 1-2 menit. dalam 15 detik. pulsa) dapat membantu untuk pra-mengobati jaringan.
• Pasang micro-tip, misalnya S26d2, ke ultrasonikator Anda. Tempatkan tabung sampel dengan jaringan di bak es.
• Sonikasikan sampel dengan ultrasonikator Anda, misalnya UP200St (amplitudo 80%) selama 1 menit dalam mode pulsa (15 detik pada, jeda 15 detik). Simpan sampelnya di bak es.
• Homogenates kemudian diberangkatkan untuk mendapatkan kolam tertentu (sitoksolik, nuklir, mitokondria atau lisosomal) untuk memperkaya protein untuk analisis. Dengan memerutkan sampel selama 5 menit pada 5000×g, supernatant diambil.

Kontrol Suhu yang Andal selama Sonikasi

Suhu adalah faktor yang mempengaruhi proses penting yang sangat penting untuk pengobatan sampel biologis, misalnya untuk mencegah degradasi termal protein. Karena semua teknik persiapan sampel mekanis, sonikasi menciptakan panas. Namun, suhu sampel dapat dikontrol dengan baik ketika menggunakan perangkat Hielscher Ultrasonics. Kami menyajikan berbagai opsi untuk memantau dan mengontrol suhu sampel Anda sambil mempersiapkannya dengan ultrasonikator tipe probe atau VialTweeter pra-analitik.

1. Pemantauan suhu sampel: Semua prosesor ultrasonik digital Hielscher dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu pluggable. Colokkan sensor suhu ke perangkat ultrasonik (misalnya, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) dan masukkan ujung sensor suhu di salah satu tabung sampel. Melalui tampilan sentuh berwarna digital, Anda dapat mengatur menu prosesor ultrasonik kisaran suhu tertentu untuk sonikasi sampel Anda. Ultrasonicator akan secara otomatis berhenti ketika suhu maks tercapai dan jeda sampai suhu sampel turun ke nilai yang lebih rendah dari suhu yang ditetapkan ∆. Kemudian sonikasi dimulai secara otomatis lagi. Fitur pintar ini mencegah degradasi yang diinduksi panas.
2. Mengenai unit multi-sampel ultrasonik VialTweeter, blok titanium, yang memegang tabung sampel, dapat didinginkan t depan. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium terlebih dahulu membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri dapat didinginkan juga.
3. Gunakan mandi es atau es kering untuk mendinginkan selama sonikasi. Tempatkan tabung sampel Anda selama sonikasi ke dalam bak es. Untuk VialTweeter, gunakan nampan dangkal yang diisi dengan es kering dan letakkan VialTweeter di atas es kering sehingga panas dapat dengan cepat menghilang.

Pelanggan di seluruh dunia menggunakan hielscher probe-ultrasonicators serta unit sonikasi multi-sampel VialTweeter dan UIP400MTP untuk pekerjaan persiapan sampel harian mereka di laboratorium biologis, biokimia, medis dan klinis. Perangkat lunak cerdas dan kontrol suhu prosesor Hielscher, suhu dikontrol dengan andal dan degradasi sampel yang diinduksi panas dihindari. Persiapan sampel ultrasonik dengan solusi ultrasonik Hielscher memberikan hasil yang sangat andal dan dapat direproduksi!