Fragmentasi DNA Ultrasonik untuk Sekuensing Gen Berikutnya
Next Generation Sequencing (NGS) membutuhkan geser dan fragmentasi DNA genom yang andal untuk mengurutkan untai DNA genom dan untuk membuat perpustakaan genom. Fragmentasi DNA yang terkontrol menjadi fragmen DNA adalah langkah persiapan sampel penting yang diperlukan sebelum DNA diurutkan. Ultrasonication terbukti sebagai teknik yang efisien dan dapat diandalkan untuk fragmentasi DNA dengan panjang tertentu. Protokol fragmentasi DNA ultrasonik mencapai hasil fragmentasi yang dapat direproduksi. Hielscher ultrasonicators mampu menghasilkan berbagai distribusi ukuran fragmen DNA genomik, tepat dikontrol melalui parameter operasi. Karena sistem geser DNA ultrasonik Hielscher tersedia untuk botol tunggal dan ganda serta untuk microplates, persiapan sampel menjadi sangat efisien.
Elektroforesis analisis DNA genom E. coli EDL933 mengalami 0-15 menit ultrasonication. L menunjukkan Tangga DNA. (Basselet et al. 2008)
- hasil berulang / dapat direproduksi
- tepat disesuaikan untuk mendapatkan panjang fragmen tertentu
- pengolahan cepat
- Hasil fragmentasi DNA yang konsisten
- perangkat untuk setiap volume sampel (misalnya, beberapa botol atau microplates)
- throughput tinggi
- kontrol temperatur yang tepat
- operasi sederhana dan mudah digunakan
Next-Gen Sequencing: Fragmentasi DNA Ultrasonik untuk Persiapan Perpustakaan
Untuk melakukan sekuensing generasi berikutnya, tiga langkah dasar dari (1) persiapan perpustakaan, (2) sekuensing, dan (3) analisis data harus dilakukan. Selama persiapan perpustakaan, DNA terfragmentasi, kemudian ujung fragmen diperbaiki (dipoles) dengan menambahkan basa adenin tunggal dan fragmen target diubah menjadi DNA beruntai ganda. Akhirnya apa yang disebut adaptor dilampirkan oleh ligasi, PCR, atau tagmentasi sehingga produk DNA perpustakaan akhir dapat dikutasikan untuk sekuensing.
Fragmentasi DNA menggunakan Sonication: Terutama ketika teknologi sekuensing baca pendek seperti Illumina, yang tidak dapat membaca fragmen DNA yang lebih panjang dengan mudah, dudukan DNA harus terfragmentasi dengan ukuran tertentu yang dapat dicapai dengan andal dengan ultrasonikasi.
Ultrasonication dapat diandalkan digunakan untuk DNA, RNA dan kromatin fragmentasi.
Bagaimana Fragmentasi DNA Ultrasonik Bekerja?
Sonikasi, juga dikenal sebagai pemrosesan sampel akustik, adalah metode yang banyak digunakan untuk memecah DNA. Untuk geser DNA ultrasonik, sampel terkena gelombang ultrasonik dalam kondisi terkendali. Prinsip kerja fragmentasi DNA ultrasonik didasarkan pada getaran dan kavitasi yang dihasilkan oleh gelombang ultrasound. Gaya geser yang dihasilkan dari kavitasi ultrasonik (akustik) memecahkan molekul DNA berat molekul tinggi. Pengaturan sonikasi seperti intensitas (amplitudo, durasi), mode denyutan dan suhu memungkinkan fragmentasi DNA yang tepat hingga panjang fragmen DNA tertentu yang diinginkan. Sementara DNA sering dikurangi menjadi 100 hingga 600 bp menggunakan ultrasonikasi, fragmen DNA yang lebih panjang hingga 1300 bp dapat diperoleh ketika kondisi ultrasonik yang lebih ringan diterapkan.
Ultrasonic DNA geser selama ChIP – kromatin immunoprecipitation
Diadaptasi dari Jkwchui di bawah CC-BY-SA.03
Kontrol Suhu Untuk Mencegah Degradasi DNA
Bentuk molekul DNA beruntai ganda sangat sensitif terhadap suhu tinggi sehingga kontrol yang tepat atas suhu selama langkah-langkah persiapan sampel merupakan faktor penting untuk hasil analisis yang dapat diandalkan.
Apakah Anda menggunakan ultrasonicator probe Hielscher, VialTweeter atau UIP400MTP – Pemantauan dan kontrol suhu berkelanjutan dipastikan karena sensor suhu yang dapat dicolokkan dan perangkat lunak perangkat pintar. Untuk mempertahankan suhu dalam kisaran tertentu, Anda dapat menetapkan batas suhu atas dan bawah. Akibatnya, ultrasonicator akan berhenti segera setelah batas suhu ini terlampaui dan secara otomatis akan terus sonikasi ketika suhu telah diturunkan dengan satu set ∆T.
Perangkat lunak canggih ultrasonikator Hielscher memastikan pemeliharaan yang andal dari kondisi perawatan sampel yang ideal.
Sampel Massal Fragmentasi DNA dengan Ultrasonicator Multi-Well Plate UIP400MTP
Jumlah sampel dalam ilmu kehidupan telah meningkat secara signifikan dalam dekade terakhir. Ini berarti jumlah sampel yang sangat tinggi (misalnya, 384, 1536, atau 3456 sumur per mikroplate) harus diproses selama persiapan sampel dan analisis dalam kondisi yang sama secara konsisten untuk mendapatkan hasil yang sebanding dan valid. Dengan UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics mengikuti tren pemrosesan sampel massal. UIP400MTP adalah ultrasonicator untuk persiapan sampel menggunakan microplates. UIP400MTP dapat memproses pelat dengan 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, atau 3456 sumur. Tergantung pada jenis microplate, masing-masing sumur biasanya dapat menahan volume sampel antara puluhan nanoliter hingga beberapa mililiter. Banyak digunakan dalam penelitian ilmu kehidupan, UIP400MTP sangat umum digunakan untuk persiapan sampel sebelum tes seperti ELISA (tes imunosorben terkait enzim) atau PCR, sebelum analisis protein, serta untuk persiapan kromatin sebelum CHiP dan CHiP-seq, identifikasi modifikasi histon, dan perawatan analitis lainnya (misalnya, elektroforesis gel, spektrometri massa).
VialTweeter untuk Praparasi Sampel hingga 10 Botol
VialTweeter adalah ultrasonicator laboratorium yang banyak digunakan VialTweeter yang memungkinkan sonikasi yang efektif dan nyaman hingga 10 botol secara bersamaan. Karena botol dan tabung reaksi (misalnya, botol Eppendorf, botol cryo, tabung sentrifugal) sonikasi secara tidak langsung, kontaminasi silang dihindari. Karena intensitas ultrasound yang sama dikirim ke setiap sampel, semua hasil sonikasi homogen dan dapat direproduksi. VialTweeter menawarkan semua fitur pintar seperti perangkat digital kami yang lain (misalnya, menu pintar, pengaturan yang dapat diprogram, kontrol suhu, remote control, dll.) sehingga kenyamanan pengguna tertinggi terjamin.
Probe Multi-Jari untuk Pelat Microwell
Tersedia untuk homogenizer probe ultrasonik UP200Ht dan UP200St, probe multi-jari dengan 4 atau 8 jari adalah pilihan yang nyaman untuk sonikasi beberapa sampel pada saat yang sama dalam kondisi yang sama. Misalnya, sonotrode MTP-24-8-96 adalah probe delapan jari, yang sangat ideal untuk integrasi ke dalam sistem otomatis atau persiapan sampel manual yang efisien dari sumur pelat multi-sumur. Sonotrode multi-jari sangat ideal untuk otomatis untuk laboratorium, di mana sebagian besar gelas dan tabung reaksi menggunakan sonotrode ultrasonik standar diproses. Probe multi-jari dan standar dapat dengan cepat diubah dalam beberapa menit mengubah ultrasonikator probe tunggal menjadi pengganggu ultrasonik multi-probe.
Hielscher Ultrasonicators untuk Fragmentasi DNA
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai platform berbasis ultrasound untuk fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin. Platform yang berbeda ini termasuk probe ultrasonik (sonotrodes), solusi sonikasi tidak langsung untuk persiapan sampel simultan dari beberapa tabung atau pelat multi-sumur (misalnya, pelat 96-well, pelat microtiter), sonoreactors, dan cuphorns ultrasonik. Semua platform untuk geser DNA didukung oleh frekuensi-tuned, prosesor ultrasonik berkinerja tinggi, yang tepat dikontrol dan memberikan hasil yang dapat direproduksi.
Prosesor Ultrasonik untuk Setiap Nomor Sampel dan Ukuran
Dengan ultrasonicator multi-sampel Hielscher VialTweeter (hingga 10 tabung reaksi) dan UIP400MTP (untuk pelat mikro / multiwell) menjadi mudah untuk mengurangi waktu pemrosesan sampel karena ultrasonikasi yang intens dan dapat dikontrol dengan tepat sambil mendapatkan distribusi dan hasil ukuran fragmen DNA yang diinginkan. Fragmentasi DNA ultrasonik membuat persiapan sampel efisien, dapat diandalkan dan terukur. Protokol dapat diskalakan secara linear dari satu ke banyak sampel dengan menerapkan ultrasound yang terus dikontrol.
Probe ultrasonicators dengan satu sampai lima jari sangat ideal untuk persiapan nomor sampel yang lebih kecil. Ultrasonicator laboratorium Hielscher tersedia dalam berbagai ukuran sehingga kami dapat merekomendasikan Perangkat yang ideal untuk aplikasi dan persyaratan Anda.
pengendalian proses yang tepat
Pengaturan sonikasi yang dapat dikontrol dengan tepat sangat penting karena sonifikasi lengkap dapat menghancurkan DNA, RNA dan kromatin, tetapi shearing ultrasonik yang tidak memadai menghasilkan fragmen DNA dan kromatin yang terlalu panjang. Ultrasonicator digital Hielscher dapat dengan mudah diatur ke parameter sonikasi yang tepat. Pengaturan sonikasi tertentu juga dapat disimpan sebagai pengaturan terprogram untuk pengulangan cepat prosedur yang sama.
Semua sonikasi secara otomatis di-protokol dan disimpan sebagai file CSV pada kartu SD bawaan. Hal ini memungkinkan untuk dokumentasi yang akurat dari uji coba yang dilakukan dan memungkinkan untuk merevisi sonikasi berjalan dengan mudah.
Melalui remote control browser, semua ultrasonicator digital dapat dioperasikan dan dipantau melalui browser standar apa pun. Instalasi perangkat lunak tambahan tidak diperlukan, karena koneksi LAN memungkinkan pengaturan plug-n-play yang sangat sederhana.
Keramahan Pengguna Tertinggi dalam Persiapan Sampel Ultrasonik
Semua ultrasonicator Hielscher dirancang untuk memberikan ultrasound berkinerja tinggi, sementara pada saat yang sama selalu sangat user-friendly dan mudah dioperasikan. Semua pengaturan terstruktur dengan baik dalam menu yang jelas, yang dapat dengan mudah diakses melalui layar sentuh berwarna atau remote control browser. Perangkat lunak pintar dengan pengaturan yang dapat diprogram dan perekaman data otomatis memastikan pengaturan sonikasi yang optimal untuk hasil yang andal dan dapat direproduksi. Antarmuka menu yang bersih dan mudah digunakan mengubah ultrasonicator Hielscher menjadi perangkat yang mudah digunakan dan efisien.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator laboratorium kami, yang ideal untuk tugas persiapan sampel seperti fragmentasi DNA dan RNA, lisis sel serta ekstraksi protein:
| Perangkat | Kekuatan [W] | Jenis | Volume [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | untuk microplates | 6 – 3456 sumur | VialTweeter | 200 | hingga 10 botol ditambah kemungkinan penjepit | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | Probe-jenis | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Probe-jenis | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Probe-jenis | 01. – 1000 |
| UP200St | 200 | Probe-jenis | 01. – 1000 |
| UP400St | 400 | Probe-jenis | 5.0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | aliran bebas kontaminasi sel |
Hubungi Kami! / Tanya Kami!
Unit persiapan multi-sampel ultrasonik VialTweeter memungkinkan sonikasi simultan hingga 10 botol. Dengan perangkat klem VialPress, hingga 4 tabung tambahan dapat ditekan ke depan untuk sonikasi intens.
Sonotrode MTP-24-8-96 memiliki delapan probe ultrasonik untuk sonikasi sumur pelat mikrotiter.
Literatur/referensi
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
Apa itu Sekuensing Generasi Berikutnya?
Sekuensing generasi berikutnya, juga Next Gen Sequencing (NGS), sekuensing throughput tinggi atau sekuensing generasi kedua, mengacu pada pendekatan sekuensing paralel besar, di mana jumlah DNA yang sangat besar (besar) dari jutaan fragmen diurutkan secara bersamaan secara paralel per run.
Untuk melakukan sekuensing generasi berikutnya, tiga langkah dasar dari (1) persiapan perpustakaan, (2) sekuensing, dan (3) analisis data harus dilakukan. Selama persiapan perpustakaan, untai DNA harus terfragmentasi menjadi fragmen DNA dengan panjang tertentu. Sonication adalah salah satu teknik yang lebih disukai untuk memecah DNA.
Selama proses sekuensing DNA, urutan nukleotida dalam DNA – Dikenal sebagai urutan asam nukleat - ditentukan. Urutan asam nukleat terdiri dari empat basa nukleotida – adenin, sitosin, guanin, timin – kode untuk informasi yang mana.
Sekuensing generasi berikutnya mendorong penelitian dalam ilmu kehidupan dan obat yang dipersonalisasi karena sekuensing DNA dan RNA banyak digunakan dalam penelitian genomik, penelitian kanker, penelitian penyakit langka dan kompleks, penelitian mikroba, agrigenomik dan banyak bidang penelitian lainnya.
Sekuensing Generasi Berikutnya vs Sekuensing Sanger
Sementara dengan Next Generation Sequencing (NGS) adalah mungkin untuk mengurutkan sejumlah besar sampel genomik, Sanger Sequencing (juga dikenal sebagai metode pemutusan rantai atau Sekuensing Generasi Pertama) hanya memiliki kemampuan untuk mengurutkan nomor sampel kecil. Sekuensing sanger hanya mengurutkan fragmen DNA tunggal pada satu waktu dan dapat dicapai dalam satu hari. Karena akuracy-nya, sekuensing Sanger juga dianggap sebagai teknologi standar emas, yang digunakan untuk memverifikasi hasil yang diperoleh oleh sekuensing generasi berikutnya.
Sekuensing Sanger mencapai panjang baca sekitar 800bp (biasanya 500-600bp dengan DNA yang tidak diperkaya). Panjang baca yang lebih panjang dalam sekuensing Sanger menampilkan keuntungan yang signifikan dibandingkan metode sekuensing lainnya terutama dalam hal sekuensing daerah berulang genom. Tantangan data urutan bacaan pendek terutama merupakan masalah dalam mengurutkan genom baru (de novo) dan dalam mengurutkan segmen genom yang sangat diatur ulang, biasanya yang terlihat dari genom kanker atau di daerah kromosom yang menunjukkan variasi struktural. [cp. Morozova dan Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizers ultrasonik kinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.