Lisis Ultrasonik Sampel Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster banyak digunakan di laboratorium sebagai organisme model. Oleh karena itu, langkah-langkah persiapan pra-analitik seperti lisis, gangguan sel, ekstraksi protein, dan pemotongan DNA sampel Drosophila melanogaster harus sering dilakukan. Pemmembrator ultrasonik dapat diandalkan dan efisien dan dapat digunakan untuk melakukan berbagai tugas seperti lisis, ekstraksi protein atau fragmentasi DNA dengan mudah hanya dengan menyesuaikan parameter proses ultrasonik. Homogenizer ultrasonik dengan demikian merupakan alat yang fleksibel dengan berbagai aplikasi.

Lisis Ultrasonik dan Ekstraksi Protein

Lisis, pelarutan sel, homogenisasi jaringan, dan ekstraksi protein adalah tugas khas untuk dismembrator ultrasonik di laboratorium biologi. Dismembrator ultrasonik dan pengganggu sel sangat cocok untuk menghomogenkan jaringan hewan, serangga (misalnya, Drosophila melanogaster, C. elegans) atau spesimen tumbuhan. Aplikasi ultrasonikasi selanjutnya adalah lisis suspensi sel dan pelet serta ekstraksi protein intraseluler.
Lisis ultrasonik dan ekstraksi protein adalah proses yang sangat andal dan dapat direproduksi, yang dapat dilakukan berdasarkan protokol yang ditetapkan. Karena intensitas proses ultrasonik dapat disesuaikan dengan tepat melalui parameter sonikasi seperti amplitudo, mode siklus / pulsa, suhu dan volume sampel, setelah protokol terbukti dapat diulang dengan hasil yang sama berulang kali.

DNA ultrasonik dan fragmentasi RNA

Setelah lisis sel dan ekstraksi protein, langkah umum yang diperlukan dalam persiapan sampel adalah geser dan fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin, misalnya sebelum imunopresipitasi kromatin (ChIP). Fragmentasi DNA dan RNA dapat dicapai dengan andal dengan memutus ikatan kovalen yang menyatukan DNA oleh kekuatan fisik. Menggunakan geser fisik seperti sonikasi, pada awalnya untaian DNA dipatahkan, kemudian DNA terfragmentasi menjadi potongan-potongan yang lebih kecil.
Fragmentasi DNA ultrasonik dapat diandalkan dan efisien dalam mencukur DNA dengan panjang yang ditargetkan, misalnya 500bp (pasangan basa). Keuntungan utama dari fragmentasi DNA ultrasonik termasuk kontrol yang tepat dari parameter dan intensitas proses ultrasonik. Parameter proses ultrasonik dapat disesuaikan dengan menyetel intensitas sonikasi, siklus dan waktu dengan tepat. Hal ini memungkinkan untuk membuat ukuran DNA yang diinginkan dan panjang DNA yang ditargetkan dapat diproduksi dan direproduksi dengan andal. Geser DNA ultrasonik juga ideal untuk membuat fragmen DNA dengan berat molekul tinggi.

Protokol untuk Lisis Ultrasonik Drosophila melanogaster

Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol untuk lisis yang dibantu ultrasonik, ekstraksi protein, dan fragmentasi DNA atau kromatin dari sampel Drosophila.

Lisis Ultrasonik untuk Uji Cross-linking Immunoprecipitation (CLIP)

Uji CLIP dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. Sekitar 20 mg ovarium dari betina tipe liar berusia 0 hingga 1 hari dihubungkan silang UV (3 × 2000 μJ/cm2), dihomogenisasi di atas es dalam buffer RCB 1 mL (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sukrosa, 1 mM DTT, 1× Inhibitor Protease Lengkap bebas EDTA, 1 mM PMSF) dilengkapi dengan 300 U RNAseOUT dan ditempatkan di atas es selama 30 menit. Homogenat disonikasi di atas es, pada daya 80%, lima kali dalam semburan 20 detik dengan istirahat 60 detik di antaranya menggunakan Prosesor Ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) dan disentrifugasi (16000 × g selama 5 menit pada suhu 4°C). Ekstrak terlarut telah dibersihkan sebelumnya dengan 20 μl Protein-G dynabeads selama 20 menit pada suhu 4°C. Setelah pengangkatan sampel untuk imunoblotting dan kuantitasi input RNA (1%), HP1 diimunopresipitasi dengan antibodi anti-HP1 9A9 dari 450 μl ekstrak yang telah dibersihkan sebelumnya dengan inkubasi selama 4 jam dengan 50 μl dinadizat Protein-G. Imunopresipita dicuci 4 kali dengan RCB. Untuk mengelusi RNA yang diimunopresipitasi, manik-manik pelet direbus dalam 100 μL Air yang diolah dengan UltraPure DEPC selama 5 menit. 900 μL Reagen Qiazol ditambahkan ke supernatan yang dipulihkan untuk persiapan RNA. RNA yang dimurnikan digunakan sebagai templat untuk mensintesis cDNA menggunakan oligo dT, heksamer acak dan SuperScript reverse transcriptase III sesuai dengan protokol pabrikan.
(Cassale dkk. 2019)

Lisis Ultrasonik untuk Uji Imunopresipitasi Kromatin

Imunopresipitasi kromatin dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Menet dengan sedikit modifikasi. Sekitar 20 mg ovarium dari betina tipe liar berumur 0 hingga 1 hari dihomogenisasi dalam 1 mL buffer NEB (10 mM HEPES-Na pada pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na pada pH 8, 0.5 mM EDTA-Na pada pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× Inhibitor Protease Lengkap bebas EDTA) dengan homogenizer / disperser perendaman 1 menit (pada 3000 rpm). Homogenat dipindahkan ke gelas yang sudah didinginkan sebelumnya dan 15 pukulan penuh diterapkan dengan alu yang ketat. Inti bebas kemudian disentrifugasi pada 6000xg selama 10 menit pada suhu 4°C. Pelet yang mengandung inti disuspensi kembali dalam 1 mL NEB dan disentrifugasi pada 20000 × g selama 20 menit pada gradien sukrosa (0,65 mL sukrosa 1,6 M dalam NEB, 0,35 mL sukrosa 0,8 M dalam NEB). Pelet disuspensi kembali dalam 1 mL NEB dan formaldehida hingga konsentrasi akhir 1%. Inti dihubungkan silang selama 10 menit pada suhu kamar dan dipadamkan dengan menambahkan 1/10 vol 1,375 M glisin. Inti dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6000 × g selama 5 menit. Inti dicuci dua kali dalam 1 mL NEB dan disuspensi kembali dalam 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na pada pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pada pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine dan 1× Inhibitor Protease Lengkap bebas EDTA). Inti disonikasi menggunakan Prosesor Ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) enam kali selama 20 detik dan 1 menit di atas es. Inti yang disonitasi disentrifugasi pada 13000 × g selama 4 menit pada suhu 4°C. Mayoritas kromatin sonikasi memiliki panjang 500 hingga 1000 pasangan basa (bp). Untuk setiap imunopresipitasi, 15 μg kromatin diinkubasi dengan adanya 10 μg antibodi monoklonal HP1 9A9 (3 jam pada 4°C dalam roda yang berputar). Kemudian, 50 μl protein dynabeads G ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan semalaman pada suhu 4°C. Supernatan dibuang dan sampel dicuci dua kali dalam Lysis Buffer (masing-masing dicuci 15 menit pada 4 °C) dan dua kali dalam TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pada pH 8). Kromatin dielusi dari manik-manik dalam dua langkah; pertama dalam 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pada pH 8) pada 65°C selama 15 menit, diikuti dengan sentrifugasi dan pemulihan supernatan. Bahan manik-manik diekstraksi ulang dalam 100 μl TE + 0,67% SDS. Eluat gabungan (200 μl) diinkubasi semalaman pada suhu 65°C untuk membalikkan ikatan silang dan diolah dengan 50 μg/ml RNaseA selama 15 menit pada suhu 65°C dan dengan 500 μg/ml Proteinase K selama 3 jam pada suhu 65°C. Sampel diekstraksi fenol-kloroform dan etanol diendapkan. DNA disuspensi kembali dalam 25 μl air. Untuk memaksimalkan analisis molekuler dengan DNA immunoprecipitated, gen kandidat diperkuat berpasangan melalui protokol duplex-PCR yang dioptimalkan dengan menggunakan dua set primer berbeda yang memiliki suhu leleh yang sama dalam satu reaksi.
(Casale dkk. 2019)
 

Pengganggu Sel Ultrasonik Kinerja Tinggi untuk Sampel Biologis

Hielscher Ultrasonics adalah mitra Anda yang telah lama berpengalaman dalam hal ultrasonicator berkinerja tinggi untuk gangguan sel, lisis, ekstraksi protein, DNA, RNA, dan fragmentasi kromatin serta langkah-langkah persiapan sampel pra-analitik lainnya. Menawarkan portofolio komprehensif homogenizer lab ultrasonik dan unit persiapan sampel, Hielscher memiliki perangkat ultrasonik yang ideal untuk aplikasi dan kebutuhan biologis Anda.
Ultrasonicator tipe probe klasik dengan ujung mikro seperti UP200St (200W; lihat gambar kiri) atau salah satu unit persiapan sampel ultrasonik VialTweeter atau UP200St_TD_CupHorn dengan VialHolder adalah model favorit di laboratorium penelitian dan analitik. Probe ultrasonik klasik sangat ideal, ketika menyiapkan lebih sedikit sampel yang harus dilisiskan, diekstraksi atau terfragmentasi. Unit persiapan sampel VialTweeter dan UP200St_TD_CupHorn memungkinkan sonikasi simultan masing-masing hingga 10 atau 5 vial.
Jika jumlah sampel yang tinggi (misalnya pelat 96 sumur, pelat mikrotiter, dll.) harus diproses, UIP400MTP adalah pengaturan sonikasi yang ideal. UIP400MTP berfungsi seperti cuphorn yang lebih besar, yang diisi dengan air dan memiliki ruang yang cukup untuk menampung pelat sumur mikro. Didukung oleh prosesor ultrasonik 400 watt yang kuat, UIP400MTP ini memberikan sonikasi pelat multi-sumur yang sangat seragam dan intens untuk mengganggu sel, melisiskan sampel, melarutkan pelet, mengekstrak protein atau geser DNA.

Kontrol Tepat melalui Perangkat Lunak Cerdas

Semua solusi sonikasi Hielscher dari 200 watt ke atas dilengkapi dengan layar sentuh warna digital dan perangkat lunak cerdas. Melalui protokol data pintar, semua parameter proses ultrasonik secara otomatis disimpan sebagai file CSV pada kartu SD bawaan segera setelah ultrasonicator dimulai. Ini membuat penelitian dan protokolisasi jauh lebih nyaman. Setelah uji coba sonikasi atau persiapan sampel, Anda cukup meninjau parameter sonikasi dari setiap sonikasi dan membandingkannya.
Melalui menu intuitif, banyak parameter dapat diatur sebelum sonikasi: Misalnya, untuk mengontrol suhu dalam sampel dan untuk mencegah degradasi termalnya, batas atas suhu sampel dapat diatur. Sensor suhu yang dapat dicolokkan, yang dilengkapi dengan unit ultrasonik, memberikan umpan balik prosesor ultrasonik pada suhu sonikasi yang sebenarnya. Ketika batas suhu atas tercapai, perangkat ultrasonik berhenti sampai batas bawah ∆T yang ditetapkan tercapai dan mulai kemudian secara otomatis sonication lagi.
Jika sonikasi dengan input energi tertentu diperlukan, Anda dapat mengatur energi ultrasonik akhir dari jalannya sonikasi. Tentu saja, denyut ultrasonik dan mode siklus juga dapat diatur secara individual.
Untuk menggunakan kembali parameter sonikasi Anda yang paling sukses, Anda dapat menyimpan berbagai mode sonikasi (misalnya waktu sonikasi, intensitas, mode siklus, dll.) sebagai mode yang telah ditentukan sebelumnya, sehingga dapat dengan mudah dan cepat dimulai lagi.
Untuk kenyamanan operasional yang lebih baik, semua unit ultrasonik digital dapat dioperasikan melalui remote control browser di browser umum apa pun (misalnya, InternetExplorer, Safari, Chrome, dll.). Koneksi LAN adalah pengaturan plug-n-play sederhana dan tidak memerlukan instalasi perangkat lunak tambahan.
Kami di Hielscher tahu bahwa sonikasi sampel biologis yang sukses membutuhkan presisi dan pengulangan. Oleh karena itu, kami merancang ultrasonicator kami sebagai perangkat pintar dengan semua fitur yang memungkinkan persiapan sampel yang efisien, andal, dapat direproduksi, dan nyaman.

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami dari ujung mikro ultrasonik dan homogenizer ultrasonik klasik hingga ultrasonicators MultiSample untuk persiapan yang nyaman dan andal dari banyak sampel: