Ultrasonic Lysis dari Drosophila melanogaster Sampel

Drosophila melanogaster banyak digunakan di laboratorium sebagai organisme model. Oleh karena itu, langkah-langkah persiapan pra-analitik seperti lisis, gangguan sel, ekstraksi protein dan geser DNA sampel melanogaster Drosophila harus sering dilakukan. Dismembrator ultrasonik dapat diandalkan dan efisien dan dapat digunakan untuk melakukan berbagai tugas seperti lisis, ekstraksi protein atau fragmentasi DNA dengan mudah dengan hanya menyesuaikan parameter proses ultrasonik. Homogenizers ultrasonik adalah alat yang fleksibel dengan berbagai aplikasi.

Ultrasonic Lisis dan protein ekstraksi

Drosophila melanogaster is widely used as model organism in biological labs. Find here protocols for lysis, protein extracion and DNA shearing of D. melanogaster samples.Lisis, solubilisasi sel, homogenisasi jaringan dan ekstraksi protein adalah tugas khas untuk dismembrator ultrasonik di laboratorium biologis. Dismembrator ultrasonik dan pengganggu sel sangat cocok untuk homogenisasi jaringan hewan, serangga (misalnya, Drosophila melanogaster, C. elegans) atau spesimen tanaman. Aplikasi ultrasonikasi berikutnya adalah lisis suspensi sel dan pelet serta ekstraksi protein intraseluler.
Ultrasonic lysis dan ekstraksi protein adalah proses yang sangat dapat diandalkan dan dapat direproduksi, yang dapat dilakukan berdasarkan protokol yang ditetapkan. Karena intensitas proses ultrasonik dapat disesuaikan dengan tepat melalui parameter sonikasi seperti amplitudo, mode siklus / pulsa, suhu dan volume sampel, setelah protokol yang terbukti dapat diulang dengan hasil yang sama berulang-ulang.

Keuntungan dari Persiapan Sampel Ultrasonik

  • Sangat efisien
  • Dapat disesuaikan dengan bahan sampel tertentu
  • Cocok untuk volume apa pun
  • Perawatan non-termal
  • Hasil yang dapat digandakan
  • Sederhana dan aman

Ultrasonic DNA dan RNA Fragmentasi

Setelah tesis sel dan ekstraksi protein, langkah umum yang diperlukan dalam persiapan sampel adalah geser dan fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin, misalnya sebelum imunoprespipitasi kromatin (ChIP). Fragmentasi DNA dan RNA dapat dicapai dengan mematahkan ikatan valen yang memegang DNA bersama-sama oleh kekuatan fisik. Menggunakan geser fisik seperti sonikasi, pada awalnya untaian DNA rusak, maka DNA dipecah menjadi potongan-potongan yang lebih kecil.
Fragmentasi DNA ultrasonik dapat diandalkan dan efisien dalam geser DNA hingga panjang yang ditargetkan, misalnya 500bp (pasangan dasar). Keuntungan utama fragmentasi DNA ultrasonik termasuk kontrol yang tepat dari parameter dan intensitas proses ultrasonik. Parameter proses ultrasonik dapat disesuaikan dengan menyetel intensitas sonikasi, siklus dan waktu dengan tepat. Ini memungkinkan untuk membuat ukuran DNA yang diinginkan dan panjang DNA yang ditargetkan dapat diproduksi dengan andal serta direproduksi. Geser DNA ultrasonik juga ideal untuk menciptakan fragmen DNA berat molekul yang tinggi.

Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of Drosophila samples

Ultrasonicator UP200Ht dengan microtip 2mm S26d2 untuk sonikasi sampel Drosophila

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Protokol untuk Ultrasonic Lysis dari Drosophila melanogaster

Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol untuk lisis ultrasonically dibantu, ekstraksi protein, dan DNA atau fragmentasi kromatin sampel Drosophila.

Ultrasonic Lysis untuk Cross-linking Immunoprecipitation (CLIP) Tes

Alat tes CLIP dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. Sekitar 20 ovarium mg dari betina tipe liar berusia 0 hingga 1 hari di-crosslinked UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogen di atas es dalam penyangga RCB 1 mL (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sukrosa, 1 mM DTT, 1× Inhibitor Protease Lengkap bebas EDTA, 1 mM PMSF) dilengkapi dengan 300 U RNAseOUT dan ditempatkan di atas es selama 30 menit. Homogenat itu disonikasi di atas es, dengan daya 80%, lima kali dalam 20 s semburan dengan istirahat 60 s di antaranya menggunakan Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) dan sentrifuged (16000 × g selama 5 menit pada 4 ° C). Ekstrak larut dipancarkan dengan 20 μl Protein-G dynabeads selama 20 menit pada 4 ° C. Setelah penghapusan sampel untuk imunoblot dan kuantitasi input RNA (1%), HP1 di immunoprecipitated dengan antibodi anti-HP1 9A9 dari ekstrak precleared 450 μl dengan inkubasi selama 4 jam dengan 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoapresit dicuci 4 kali dengan RCB. Untuk menghindari RNAs yang diomutasikan, manik-manik pelet direbus dalam 100 μL Air yang dirawat UltraPure DEPC selama 5 menit. 900 μL Qiazol Reagen ditambahkan ke supernatant yang dipulihkan untuk persiapan RNA. RNA yang dimurnikan digunakan sebagai template untuk mensintesis cDNA menggunakan oligo dT, hexamers acak dan SuperScript reverse transcriptase III sesuai dengan protokol produsen.
(Cassale dkk. 2019)

Ultrasonic Lysis untuk Chromatin Immunoprecipitation Assay

Imunoaprespiitasi kromater dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Menet dengan modifikasi kecil. Sekitar 20 ovarium mg dari betina tipe liar berusia 0 hingga 1 hari di homogen dalam 1 mL penyangga NEB (10 mM HEPES-Na pada pH 8.0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na di pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pada pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- Inhibitor Protease Lengkap gratis) dengan dispersi homogenizer / perendaman 1 menit (pada 3000 rpm). Homogenat dipindahkan ke dounce kaca pra-dingin dan 15 stroke penuh diterapkan dengan alu yang ketat. Nuklei gratis kemudian disolah 6000xg selama 10 menit pada suhu 4 °C. Pelet yang mengandung nuklei diresuspended dalam 1 mL NEB dan diserbu pada 20000 × g selama 20 menit pada gradien sukrosa (0,65 mL sukrosa 1,6 M di NEB, 0,35 mL 0,8 M sukrosa di NEB). Pelet diresuspended dalam 1 mL NEB dan formaldehida ke konsentrasi akhir 1%. Nuclei dihubungkan silang selama 10 menit pada suhu kamar dan diwariskan dengan menambahkan 1/10 vol glisin 1,375 M. Inti dikumpulkan oleh sentrifugasi pada 6000 × g selama 5 menit. Nuclei dicuci dua kali dalam 1 mL NEB dan diresuspended dalam 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na di pH 7.6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pada pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine dan 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuklei disonikasi menggunakan Prosesor Ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) enam kali untuk 20 s on dan 1 menit di atas es. Inti sonik berpusat pada 13000 × selama 4 menit pada suhu 4 °C. Mayoritas kromatin sonikasi adalah 500 hingga 1000 pasangan dasar (bp) panjangnya. Untuk setiap imunoteprespitasi, 15 μg kromatin diinkubasi di hadapan 10 μg antibodi monoklonal HP1 9A9 (3 jam pada 4 ° C dalam roda berputar). Kemudian, 50 μl protein dynabeads G ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan semalam pada suhu 4 °C. Supernatants dibuang dan sampel dicuci dua kali di Lysis Buffer (masing-masing mencuci 15 menit pada 4 ° C) dan dua kali di TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl di pH 8). Kromatin ditinggikan dari manik-manik dalam dua langkah; pertama dalam 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pada pH 8) pada 65 ° C selama 15 menit, diikuti oleh sentrifugasi dan pemulihan supernatant. Bahan manik-manik diekstraksi ulang dalam 100 μl TE + 0,67% SDS. Eluate gabungan (200 μl) diinkubasi semalam pada 65 ° C untuk membalikkan tautan silang dan dirawat oleh 50 μg / ml RNaseA selama 15 menit pada 65 ° C dan oleh 500 μg / ml Proteinase K selama 3 jam pada 65 ° C. Sampel adalah fenol-kloroform diekstraksi dan etanol diendapkan. DNA diresuspended dalam 25 μl air. Untuk memaksimalkan analisis molekuler dengan imunoprespitasi DNA, gen kandidat diperkuat berpasangan melalui protokol duplex-PCR yang dioptimalkan dengan menggunakan dua set primer yang berbeda memiliki suhu leleh yang sama dalam satu reaksi.
(Casale et al. 2019)

UP200St TD_CupHorn untuk sonikasi sampel tidak langsung

UP200St TD_CupHorn untuk sonikasi tidak langsung dari sampel seperti DNA dan geser kromatatin

Disruptor Sel Ultrasonik Kinerja Tinggi untuk Sampel Biologis

Hielscher Ultrasonics adalah mitra anda yang telah lama berpengalaman dalam hal ultrasonikator kinerja tinggi untuk gangguan sel, lisis, ekstraksi protein, DNA, RNA, dan fragmentasi kromatin serta langkah-langkah persiapan sampel pra-analitik lainnya. Menawarkan portofolio komprehensif homogenizers lab ultrasonik dan unit persiapan sampel, Hielscher memiliki perangkat ultrasonik yang ideal untuk aplikasi dan persyaratan biologis Anda.
Probe-jenis insonifier UP200St untuk lisisKlasik probe-jenis ultrasonicator dengan micro-tip seperti UP200St (200W; lihat gambar kiri) atau salah satu unit persiapan sampel ultrasonik VialTweeter atau UP200St_TD_CupHorn dengan VialHolder adalah model favorit dalam penelitian dan laboratorium analitis. Probe ultrasonik klasik sangat ideal, ketika menyiapkan lebih sedikit sampel harus dipeliakan, diekstraksi atau di fragmen. Unit persiapan sampel VialTweeter dan UP200St_TD_CupHorn untuk sonikasi simultan hingga 10 atau 5 botol, masing-masing.
Jika angka sampel tinggi (misalnya pelat 96 sumur, pelat mikrotiter, dll.) harus diproses, UIP400MTP adalah pengaturan sonikasi yang ideal. UIP400MTP berfungsi seperti cuphorn yang lebih besar, yang diisi dengan air dan memiliki cukup ruang untuk memegang pelat sumur mikro. Didukung oleh prosesor ultrasonik kuat 400 watt, UIP400MTP memberikan sonikasi pelat multi-sumur yang sangat seragam dan intens untuk mengganggu sel, sampel lis, pelet solubilize, protein ekstrak atau DNA geser.

Kontrol Tepat melalui Perangkat Lunak Cerdas

prosesor industri Hielscher dari seri HDT bisa nyaman dan dioperasikan melalui browser remote control user-friendly.Semua solusi sonikasi Hielscher dari 200 watt ke atas dilengkapi dengan layar sentuh warna digital dan perangkat lunak cerdas. Melalui protokol data pintar semua parameter proses ultrasonik secara otomatis disimpan sebagai file CSV pada SD-card bawaan segera setelah ultrasonicator dimulai. Ini membuat penelitian dan protokol menjadi jauh lebih nyaman. Setelah uji coba sonikasi atau persiapan sampel, Anda cukup meninjau parameter sonikasi dari setiap sonikasi yang dijalankan dan membandingkannya.
Melalui menu intuitif, banyak parameter dapat diatur sebelum sonikasi: Misalnya, untuk mengontrol suhu dalam sampel dan untuk mencegah degradasi termalnya, batas atas suhu sampel dapat diatur. Sensor suhu pluggable, yang dilengkapi dengan unit ultrasonik, memberikan umpan balik prosesor ultrasonik pada suhu sonikasi yang sebenarnya. Ketika batas suhu atas tercapai, perangkat ultrasonik berhenti sampai batas bawah set ∆T tercapai dan mulai kemudian secara otomatis sonicating lagi.
Jika sonikasi dengan input energi tertentu diperlukan, Anda dapat preset energi ultrasonik akhir dari lari sonikasi. Tentu saja, pulsation ultrasonik dan mode siklus dapat diatur secara individual juga.
Untuk menggunakan kembali parameter sonikasi Anda yang paling sukses, Anda dapat menyimpan berbagai mode sonikasi (misalnya waktu sonikasi, intensitas, mode siklus, dll.) sebagai mode yang telah ditetapkan sebelumnya, sehingga dapat dengan mudah dan cepat dimulai lagi.
Untuk kenyamanan yang lebih operasional, semua unit ultrasonik digital dapat dioperasikan melalui remote control browser di browser umum apa pun (misalnya, InternetExplorer, Safari, Chrome dll.). Koneksi LAN adalah pengaturan plug-n-play sederhana dan tidak memerlukan instalasi perangkat lunak tambahan.
Kami di Hielscher tahu bahwa sonikasi sampel biologis yang sukses membutuhkan ketelitian dan pengulangan. Oleh karena itu, kami merancang ultrasonicators kami sebagai perangkat pintar dengan semua fitur yang memungkinkan persiapan sampel yang efisien, andal, dapat direproduksi, dan nyaman.

Hubungi kami sekarang dan beri tahu kami tentang sampel biologis Anda dan langkah-langkah persiapan yang diperlukan. Kami akan mengusulkan Anda perangkat persiapan sampel ultrasonik yang paling cocok dan membantu Anda dengan informasi tambahan seperti protokol dan rekomendasi.

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami dari ujung mikro ultrasonik dan homogenizers ultrasonik klasik hingga ultrasonicator MultiSample untuk persiapan yang nyaman dan andal dari banyak sampel:

Batch Volume Flow Rate Direkomendasikan perangkat
Pelat 96-well / microtiter n.a. UIP400MTP
10 botol à 0,5 hingga 1,5mL n.a. VialTweeter di UP200St
CupHorn untuk sonikasi tidak langsung, misalnya hingga 5 botol n.a. UP200St_TD_CupHorn
0.01 hingga 250mL 5 hingga 100mL/menit UP50H
0.01 hingga 500mL 10-200mL/min UP100H
0.02 ke 1L 20 hingga 400mL/min UP200Ht / UP200St
10-2000mL 20 hingga 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.25 sampai 5L 0.05 hingga 1L/menit UIP500hdT

Hubungi Kami! / Tanya Kami!

Meminta informasi lebih lanjut

Silakan gunakan formulir di bawah ini untuk meminta informasi tambahan tentang prosesor ultrasonik, aplikasi dan harga. Kami akan senang untuk mendiskusikan proses Anda dengan Anda dan menawarkan sistem ultrasonik yang memenuhi kebutuhan Anda!









Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Unit persiapan multi-sampel ultrasonik VialTweeter memungkinkan sonikasi simultan hingga 10 botol. Dengan perangkat klem VialPress, hingga 4 tabung tambahan dapat ditekan ke depan untuk sonikasi intens.

Literatur/referensi



Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

Ultrasonik kinerja tinggi! Rangkaian produk Hielscher mencakup spektrum penuh dari ultrasonikator lab kompak di atas unit bench-top hingga sistem ultrasonik industri penuh.


Fakta-fakta yang Patut Diketahui

Metabolomis

Metabolomis adalah studi molekul kecil, yang dikenal sebagai metabolit, hadir dalam sel, biofluid, jaringan atau organisme. Molekul-molekul kecil ini dan interaksi mereka dalam sistem biologis dirangkum di bawah istilah payung "metabolome" dan bidang penelitian disebut metabolomik. Penelitian metabolome terhubung erat dengan bidang kedokteran presisi yang berkembang pesat. Pemahaman tentang metabolome dan hubungannya dengan berbagai penyakit membantu mengembangkan strategi pencegahan penyakit dan perawatan klinis sementara variabilitas individu dalam lingkungan, gaya hidup, genetika, dan fenotipe molekuler. Untuk melepaskan molekul metabolit dari sel, ultrasonikasi sering digunakan di laboratorium biologis untuk persiapan sampel pra-analitik seperti gangguan sel, lisis dan ekstraksi protein, lipid dan molekul lainnya.