Lisis Ultrasonik Sampel Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster banyak digunakan di laboratorium sebagai organisme model. Oleh karena itu, tahap preparasi praanalitik seperti lisis, disrupsi sel, ekstraksi protein, dan pemotongan DNA melalui gaya geser pada sampel Drosophila melanogaster harus sering dilakukan. Alat penghancur ultrasonik andal dan efisien serta dapat digunakan untuk melakukan berbagai tugas seperti lisis, ekstraksi protein, atau fragmentasi DNA dengan mudah hanya dengan menyesuaikan parameter proses ultrasonik. Dengan demikian, homogenizer ultrasonik merupakan alat fleksibel dengan beragam aplikasi.

Lisis Ultrasonik dan Ekstraksi Protein

Lisis, solubilisasi sel, homogenisasi jaringan, dan ekstraksi protein merupakan tugas umum alat penghancur ultrasonik di laboratorium biologi. Alat penghancur ultrasonik dan alat disrupsi sel sangat sesuai untuk menghomogenisasi jaringan hewan, serangga (misalnya, Drosophila melanogaster, C. elegans), atau spesimen tumbuhan. Aplikasi ultrasonikasi selanjutnya meliputi lisis suspensi dan pelet sel serta ekstraksi protein intraseluler.
Lisis ultrasonik dan ekstraksi protein merupakan proses yang sangat andal dan dapat direproduksi, yang dapat dilakukan berdasarkan protokol yang telah ditetapkan. Karena intensitas proses ultrasonik dapat diatur secara tepat melalui parameter sonikasi seperti amplitudo, mode siklus / pulsa, suhu, dan volume sampel, protokol yang telah terbukti dapat diulang dengan hasil yang sama secara terus-menerus.

Fragmentasi DNA dan RNA Ultrasonik

Setelah lisis sel dan ekstraksi protein, tahap yang umumnya diperlukan dalam preparasi sampel adalah pemotongan melalui gaya geser dan fragmentasi DNA, RNA, serta kromatin, misalnya sebelum imunopresipitasi kromatin (ChIP). Fragmentasi DNA dan RNA dapat dicapai secara andal dengan memutus ikatan kovalen yang menyatukan DNA menggunakan gaya fisik. Dengan pemotongan melalui gaya geser fisik seperti sonikasi, mula-mula untai DNA diputus, kemudian DNA difragmentasi menjadi bagian-bagian yang lebih kecil.
Fragmentasi DNA ultrasonik andal dan efisien dalam memotong DNA melalui gaya geser hingga panjang yang ditargetkan, misalnya 500bp (pasangan basa). Keunggulan utama fragmentasi DNA ultrasonik meliputi pengendalian parameter dan intensitas proses ultrasonik secara presisi. Parameter proses ultrasonik dapat disesuaikan dengan mengatur intensitas, siklus, dan waktu sonikasi secara tepat. Hal ini memungkinkan pembuatan DNA berukuran sesuai keinginan, dan panjang DNA yang ditargetkan dapat dihasilkan serta direproduksi secara andal. Pemotongan DNA melalui gaya geser ultrasonik juga ideal untuk menghasilkan fragmen DNA dengan berat molekul tinggi.

Protokol Lisis Ultrasonik Drosophila melanogaster

Di bawah ini Anda dapat menemukan berbagai protokol untuk lisis, ekstraksi protein, dan fragmentasi DNA atau kromatin sampel Drosophila berbantuan ultrasonik.

Lisis Ultrasonik untuk Uji Imunopresipitasi dengan Ikatan Silang (CLIP)

Uji CLIP dilakukan sebagaimana dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. Sekitar 20 mg ovarium dari betina tipe liar berumur 0–1 hari diberi ikatan silang dengan UV (3 × 2000 μJ/cm2), dihomogenisasi di atas es dalam 1 mL bufer RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sukrosa, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors bebas EDTA, 1 mM PMSF) yang ditambah 300 U RNAseOUT, lalu diletakkan di atas es selama 30 min. Homogenat disonikasi di atas es pada daya 80%, sebanyak lima kali dalam pulsa 20 s dengan jeda 60 s di antaranya menggunakan Prosesor Ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) dan disentrifugasi (16.000 × g selama 5 min pada 4°C). Ekstrak terlarut dijernihkan terlebih dahulu dengan 20 μl Protein-G dynabeads selama 20 min pada 4°C. Setelah sebagian sampel diambil untuk imunoblot dan kuantifikasi RNA masukan (1%), HP1 diimunopresipitasi dengan antibodi anti-HP1 9A9 dari 450 μl ekstrak yang telah dijernihkan melalui inkubasi selama 4 h dengan 50 μl Protein-G dynabeads. Imunopresipitat dicuci 4 kali dengan RCB. Untuk mengelusi RNA yang telah diimunopresipitasi, manik-manik yang telah dipeletkan dididihkan dalam 100 μL UltraPure DEPC-treated Water selama 5 min. Sebanyak 900 μL Qiazol Reagent ditambahkan ke supernatan yang diperoleh untuk preparasi RNA. RNA yang telah dimurnikan digunakan sebagai cetakan untuk menyintesis cDNA menggunakan oligo dT, heksamer acak, dan transkriptase balik SuperScript III sesuai protokol produsen.
(Cassale et al. 2019)

Lisis Ultrasonik untuk Uji Imunopresipitasi Kromatin

Imunopresipitasi kromatin dilakukan sesuai metode yang dijelaskan oleh Menet dengan sedikit modifikasi. Sekitar 20 mg ovarium dari betina tipe liar berumur 0–1 hari dihomogenisasi dalam 1 mL bufer NEB (10 mM HEPES-Na pada pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pada pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pada pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× Complete Protease Inhibitors bebas EDTA) dengan homogenizer / alat pendispersi celup selama 1 min (pada 3000 rpm). Homogenat dipindahkan ke homogenizer Dounce kaca yang telah didinginkan dan diberi 15 gerakan penuh dengan penumbuk bercelah rapat. Inti sel bebas kemudian disentrifugasi pada 6000xg selama 10 min pada 4°C. Pelet yang mengandung inti sel disuspensikan kembali dalam 1 mL NEB dan disentrifugasi pada 20.000 × g selama 20 min pada gradien sukrosa (0,65 mL sukrosa 1,6 M dalam NEB, 0,35 mL sukrosa 0,8 M dalam NEB). Pelet disuspensikan kembali dalam 1 mL NEB dan formaldehida hingga konsentrasi akhir 1%. Inti sel diberi ikatan silang selama 10 min pada suhu ruang dan reaksi dihentikan dengan menambahkan 1/10 vol glisina 1,375 M. Inti sel dikumpulkan melalui sentrifugasi pada 6000 × g selama 5 min. Inti sel dicuci dua kali dalam 1 mL NEB dan disuspensikan kembali dalam 1 mL Bufer Lisis (15 mM HEPES-Na pada pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pada pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoksikolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkosina, dan 1× Complete Protease Inhibitors bebas EDTA). Inti sel disonikasi menggunakan Prosesor Ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sebanyak enam kali dengan 20 s sonikasi aktif dan 1 min di atas es. Inti sel yang telah disonikasi disentrifugasi pada 13.000 × g selama 4 min pada 4°C. Sebagian besar kromatin yang telah disonikasi memiliki panjang 500 hingga 1000 pasangan basa (bp). Untuk setiap imunopresipitasi, 15 μg kromatin diinkubasi bersama 10 μg antibodi monoklonal HP1 9A9 (3 h pada 4°C dalam roda berputar). Kemudian, 50 μl dynabeads protein G ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan semalaman pada 4°C. Supernatan dibuang dan sampel dicuci dua kali dalam Bufer Lisis (setiap pencucian selama 15 min pada 4 °C) dan dua kali dalam Bufer TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pada pH 8). Kromatin dielusi dari manik-manik dalam dua tahap; pertama dalam 100 μl Bufer Elusi 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pada pH 8) pada 65°C selama 15 min, diikuti sentrifugasi dan pengambilan supernatan. Bahan manik-manik diekstraksi kembali dalam 100 μl TE + 0,67% SDS. Eluat gabungan (200 μl) diinkubasi semalaman pada 65°C untuk membalikkan ikatan silang dan diberi perlakuan dengan 50 μg/ml RNaseA selama 15 min pada 65°C serta dengan 500 μg/ml Proteinase K selama 3 h pada 65°C. Sampel diekstraksi dengan fenol–kloroform dan diendapkan dengan etanol. DNA disuspensikan kembali dalam 25 μl air. Untuk memaksimalkan analisis molekuler dengan DNA yang telah diimunopresipitasi, gen kandidat diamplifikasi secara berpasangan melalui protokol duplex-PCR yang dioptimalkan dengan menggunakan dua set primer berbeda yang memiliki suhu leleh serupa dalam satu reaksi.
(Casale et al. 2019)
 

Alat Disrupsi Sel Ultrasonik Berkinerja Tinggi untuk Sampel Biologis

Hielscher Ultrasonics adalah mitra Anda yang berpengalaman panjang dalam penyediaan sonikator ultrasonik berkinerja tinggi untuk disrupsi sel, lisis, ekstraksi protein, fragmentasi DNA, RNA, dan kromatin, serta tahap preparasi sampel praanalitik lainnya. Dengan menawarkan portofolio lengkap homogenizer laboratorium ultrasonik dan unit preparasi sampel, Hielscher memiliki perangkat ultrasonik yang ideal untuk aplikasi dan kebutuhan biologis Anda.
Sonikator ultrasonik tipe probe klasik dengan ujung mikro seperti UP200St (200W; lihat gambar di sebelah kiri) atau salah satu unit preparasi sampel ultrasonik VialTweeter atau UP200ST_TD_CupHorn dengan VialHolder merupakan model favorit di laboratorium penelitian dan analitik. Probe ultrasonik klasik ideal ketika sampel dalam jumlah lebih sedikit perlu dilisis, diekstraksi, atau difragmentasi. Unit preparasi sampel VialTweeter dan UP200St_TD_CupHorn memungkinkan sonikasi secara simultan masing-masing hingga 10 atau 5 vial.
Jika sampel dalam jumlah besar (misalnya pelat 96 sumur, pelat mikrotiter, dan sebagainya) harus diproses, UIP400MTP merupakan sistem sonikasi yang ideal. UIP400MTP berfungsi seperti cuphorn yang lebih besar, yang diisi air dan memiliki ruang yang cukup untuk menampung pelat sumur mikro. Ditenagai oleh prosesor ultrasonik berdaya 400 watt, UIP400MTP menghasilkan sonikasi pelat multisumur yang sangat seragam dan intens untuk mendisrupsi sel, melisis sampel, melarutkan pelet, mengekstraksi protein, atau memotong DNA melalui gaya geser.

Pengendalian Presisi melalui Perangkat Lunak Cerdas

Semua solusi sonikasi Hielscher berdaya 200 watt ke atas dilengkapi layar sentuh digital berwarna dan perangkat lunak cerdas. Melalui pencatatan data cerdas, semua parameter proses ultrasonik secara otomatis disimpan sebagai berkas CSV pada kartu SD bawaan segera setelah sonikator ultrasonik dijalankan. Hal ini membuat penelitian dan pencatatan menjadi jauh lebih mudah. Setelah uji sonikasi atau preparasi sampel, Anda dapat dengan mudah meninjau parameter sonikasi dari setiap proses sonikasi dan membandingkannya.
Melalui menu yang intuitif, berbagai parameter dapat diatur sebelum sonikasi: Misalnya, untuk mengendalikan suhu dalam sampel dan mencegah degradasi termalnya, batas atas suhu sampel dapat ditetapkan. Sensor suhu yang dapat dicolokkan, yang disertakan bersama unit ultrasonik, memberikan umpan balik kepada prosesor ultrasonik mengenai suhu sonikasi aktual. Ketika batas atas suhu tercapai, perangkat ultrasonik berhenti sementara hingga batas bawah ∆T yang ditetapkan tercapai, lalu secara otomatis memulai sonikasi kembali.
Jika diperlukan sonikasi dengan masukan energi tertentu, Anda dapat mengatur energi ultrasonik akhir proses sonikasi terlebih dahulu. Tentu saja, pulsasi ultrasonik dan mode siklus juga dapat diatur secara individual.
Untuk menggunakan kembali parameter sonikasi Anda yang paling berhasil, Anda dapat menyimpan berbagai mode sonikasi (misalnya waktu sonikasi, intensitas, mode siklus, dan sebagainya) sebagai mode prasetel, sehingga dapat dijalankan kembali dengan mudah dan cepat.
Untuk kemudahan pengoperasian lebih lanjut, semua unit ultrasonik digital dapat dioperasikan melalui kendali jarak jauh berbasis peramban di peramban umum apa pun (misalnya InternetExplorer, Safari, Chrome, dan sebagainya). Koneksi LAN menggunakan pengaturan plug-n-play yang sederhana dan tidak memerlukan instalasi perangkat lunak tambahan.
Kami di Hielscher mengetahui bahwa keberhasilan sonikasi sampel biologis memerlukan presisi dan keterulangan. Oleh karena itu, kami merancang sonikator ultrasonik kami sebagai perangkat cerdas dengan semua fitur yang memungkinkan preparasi sampel yang efisien, andal, dapat direproduksi, dan mudah.

Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami, mulai dari ujung mikro ultrasonik dan homogenizer ultrasonik klasik hingga sonikator ultrasonik MultiSample untuk preparasi banyak sampel secara mudah dan andal: