Lisis Sel Sel BL21 dengan Ultrasonikasi
Sel BL21 adalah strain E. yang banyak digunakan di laboratorium penelitian, bioteknologi dan produksi industri karena kemampuannya untuk mengekspresikan protein yang sangat efisien. Gangguan sel ultrasonik, lisis dan ekstraksi protein adalah metode umum untuk mengisolasi dan mengumpulkan protein yang ditargetkan dari bagian dalam sel BL21. Ultrasonikasi mengganggu sel sepenuhnya dan melepaskan semua protein yang terperangkap, membuat 100% protein tersedia.
Sel BL21 untuk Ekspresi Protein
Sel BL21 adalah strain bakteri E. yang kompeten secara kimiawi yang cocok untuk transformasi dan ekspresi protein tingkat tinggi menggunakan sistem induksi T7 RNA polimerase-IPTG. Sel BL21 memungkinkan ekspresi protein efisiensi tinggi dari gen apa pun yang berada di bawah kendali promotor T7. Strain E. BL21 (DE3) adalah strain produksi protein berbasis polimerase RNA T7 yang dikombinasikan dengan vektor ekspresi berbasis promotor T7 dan banyak diterapkan di laboratorium dan industri untuk menghasilkan protein rekombinan. Pada BL21 (DE3), ekspresi gen yang mengkodekan protein rekombinan ditranskripsi oleh polimerase RNA T7 yang dikodekan secara kromosom (T7 RNAP), yang mentranskripsikan delapan kali lebih cepat daripada RNAP E. konvensional. Hal ini membuat strain BL21 (DE3) sangat efisien dan mengubahnya menjadi salah satu sistem sel ekspresi protein yang paling disukai.
Protokol untuk Lisis Ultrasonik dan Ekstraksi Protein dari Sel BL21
Lisis sel sel BL21 sebagian besar dilakukan menggunakan ultrasonikasi dalam kombinasi dengan natrium lauroyl sarcosinate (juga dikenal sebagai sarkosil) sebagai buffer lisis. Keuntungan dari gangguan sel ultrasonik dan ekstraksi protein terletak pada keandalan, reproduktifitas serta pengoperasian ultrasonicator yang sederhana, aman dan cepat. Protokol di bawah ini memberikan arahan langkah demi langkah untuk lisis sel ultrasonik BL21:
- Untuk menghilangkan protein pendamping, pelet bakteri BL21 disuspensi kembali dalam 50 ml buffer Sodium Tris-EDTA (STE) dingin es (terdiri dari 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl ditambah dengan 100 mM PMSF).
- Itu, 500 ul lisozim (10 mg/ ml) ditambahkan dan sel-sel diinkubasi di atas es selama 15 menit.
- Setelah itu, 500 ul DTT dan 7 ml sarkosyl (10% (w / v) dibuat dalam buffer STE) ditambahkan.
- Sangat penting untuk menjaga semua buffer pemurnian sedingin es dan menjaga sampel di atas es sepanjang waktu. Semua langkah pemurnian harus dilakukan di ruang dingin jika memungkinkan.
- Untuk lisis ultrasonik dan ekstraksi protein, sampel disonikasi di VialTweeter MultiSample Ultrasonicator selama 4 x 30 detik pada amplitudo 100% dengan interval 2 menit antara setiap sonikasi. Atau, homogenizer ultrasonik tipe probe dengan ujung mikro misalnya, UP200Ht dengan S26d2 (3 x 30 detik, jeda 2 menit antara siklus ultrasonik, amplitudo 80%) dapat digunakan.
- Untuk langkah pemurnian lebih lanjut, sampel harus disimpan di atas es atau disimpan pada suhu -80°C hingga pemrosesan lebih lanjut.

Pengganggu sel ultrasonik UP200St dengan ujung mikro S26d2 untuk lisis dan ekstraksi protein
Lisis Ultrasonik di bawah Kontrol Suhu Prescise
Kontrol suhu yang tepat dan andal sangat penting saat menangani sampel biologis. Suhu tinggi memulai degradasi protein yang diinduksi secara termal dalam sampel.
Seperti semua teknik persiapan sampel mekanis, sonikasi menciptakan panas. Namun, suhu sampel dapat dikontrol dengan baik saat menggunakan VialTweeter. Kami menyajikan berbagai opsi untuk memantau dan mengontrol suhu sampel Anda sambil menyiapkannya dengan VialTweeter dan VialPress untuk analisis.
- Memantau suhu sampel: Prosesor ultrasonik UP200St, yang menggerakkan VialTweeter, dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dicolokkan. Colokkan sensor suhu ke UP200St dan masukkan ujung sensor suhu ke salah satu sample tabung. Melalui layar sentuh berwarna digital, Anda dapat mengatur di menu UP200St kisaran suhu tertentu untuk sonikasi sampel Anda. Ultrasonicator akan berhenti secara otomatis ketika suhu maksimum tercapai dan berhenti sampai sample suhu turun ke nilai yang lebih rendah dari ∆ suhu yang disetel. Kemudian sonikasi dimulai secara otomatis lagi. Fitur pintar ini mencegah degradasi yang disebabkan oleh panas.
- Blok VialTweeter dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
- Gunakan es kering untuk mendinginkan selama sonikasi. Gunakan nampan dangkal berisi es kering dan letakkan VialTweeter di atas es agar panas dapat menghilang dengan cepat.
Pelanggan di seluruh dunia menggunakan VialTweeter dan VialPress untuk pekerjaan persiapan sampel harian mereka di laboratorium biologi, biokimia, medis, dan klinis. Perangkat lunak cerdas dan kontrol suhu prosesor UP200St, suhu dikontrol dengan andal dan degradasi sampel yang diinduksi panas dihindari. Persiapan sampel ultrasonik dengan VialTweeter dan VialPress memberikan hasil yang sangat andal dan dapat direproduksi!
Temukan Pengganggu Ultrasonik yang Optimal untuk Aplikasi Lisis Anda
Hielscher Ultrasonics adalah produsen pengganggu sel ultrasonik dan homogenizer berkinerja tinggi yang berpengalaman lama untuk laboratorium, bench-top dan sistem skala industri. Ukuran kultur sel bakteri Anda, tujuan penelitian atau produksi Anda, dan volume sel yang akan diproses per jam atau hari adalah faktor penting untuk menemukan pengganggu sel ultrasonik yang tepat untuk aplikasi Anda.
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk sonikasi simultan multi-sampel (hingga 10 vial dengan VialTweeter) dan sampel massa (yaitu, pelat mikrotiter / pelat ELISA dengan UIP400MTP), serta ultrasonicator laboratorium tipe probe klasik dengan tingkat daya yang berbeda dari 50 hingga 400 watt untuk prosesor ultrasonik industri sepenuhnya dengan hingga 16.000watt per unit untuk gangguan sel komersial dan ekstraksi protein dalam produksi besar. Semua ultrasonicator Hielscher dibangun untuk operasi 24/7/365 di bawah beban penuh. Kekokohan dan keandalan adalah fitur inti dari perangkat ultrasonik kami.
Semua homogenizer ultrasonik digital dilengkapi dengan perangkat lunak pintar, layar sentuh berwarna, dan protokol data otomatis, yang membuat perangkat ultrasonik menjadi alat kerja yang nyaman di laboratorium dan fasilitas produksi.
Beri tahu kami, jenis sel apa, volume apa, dengan frekuensi apa dan dengan target apa yang Anda miliki untuk memproses sampel biologis Anda. Kami akan merekomendasikan Anda pengganggu sel ultrasonik yang paling cocok untuk kebutuhan proses Anda.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami dari homogenizer genggam kompak dan Ultrasonicators MultiSample hingga prosesor ultrasonik industri untuk aplikasi komersial:
Batch Volume | Flow Rate | Direkomendasikan perangkat |
---|---|---|
Pelat 96 sumur / mikrotiter | n.a. | UIP400MTP |
10 vial à 0,5 hingga 1,5mL | n.a. | VialTweeter di UP200St |
0.01 hingga 250mL | 5 hingga 100mL / menit | UP50H |
001 hingga 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
10-2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 hingga 20L | 0.2 sampai 4L/min | UIP2000hdT |
10 sampai 100L | 2-10L/min | UIP4000hdT |
n.a. | 10 sampai 100L/menit | UIP16000 |
n.a. | kristal yang lebbig | cluster UIP16000 |
Hubungi Kami! / Tanya Kami!

UIP400MTP pelat sonicator untuk gangguan sel throughput tinggi dalam pelat 96 sumur

Ultrasonicator UP200Ht dengan microtip 2mm S26d2 untuk sonikasi sampel kecil
Baca lebih lanjut tentang bagaimana Anda dapat menggunakan homogenizer jaringan ultrasonik Anda untuk persiapan larutan buffer yang efisien dan andal!
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
Bakteri Escherichia
Escherichia adalah jenis bakteri, yaitu tidak membentuk spora, Gram-negatif dan ditandai dengan bentuk batang lurus. Bakteri E.hadir di lingkungan, makanan, dan usus manusia dan hewan. E. biasanya bergerak dengan menggunakan flagela peritrichous, tetapi ada juga jenis nonmotile. E.adalah apa yang disebut organisme kemoorganotrof anaerobik fakultatif, yang berarti mereka mampu melakukan metabolisme pernapasan dan fermentatif. Sebagian besar jenis E.jinak dan memenuhi fungsi yang berguna dalam tubuh, misalnya menekan pertumbuhan spesies bakteri berbahaya, mensintesis vitamin, dll.
Sel bakteri Escherichia dari apa yang disebut tipe B adalah kategori khusus dari strain E., yang banyak digunakan dalam penelitian untuk menyelidiki mekanisme seperti sensitivitas bakteriofag atau sistem modifikasi restriksi. Selain itu, bakteri E.dihargai sebagai pekerja keras yang andal untuk ekspresi protein di laboratorium bioteknologi dan ilmu kehidupan. Misalnya, E.digunakan untuk mensintesis senyawa seperti protein dan oligosakarida pada skala industri. Karena fitur spesifik seperti defisiensi protease, produksi asetat rendah pada tingkat glukosa yang tinggi, dan peningkatan permeabilitas, sel E. B adalah sel inang yang paling sering digunakan untuk produksi protein rekayasa genetika.
Protein Rekombinan
Protein rekombinan (rProt) semakin penting dalam berbagai cabang, termasuk dalam produksi kimia, farmasi, kosmetik, obat manusia dan hewan, pertanian, makanan, serta industri pengolahan limbah.
Produksi protein rekombinan membutuhkan penggunaan sistem ekspresi. Sebagai sistem sel yang mengekspresikan untuk produksi DNA rekombinan, sel prokariotik dan eukariotik dapat digunakan. Sementara sel bakteri paling banyak digunakan untuk ekspresi protein karena faktor-faktor seperti biaya rendah, skalabilitas yang mudah, dan kondisi media yang sederhana, sistem mamalia, ragi, ganggang, serangga, dan bebas sel adalah alternatif yang mapan. Jenis protein, aktivitas fungsional, serta hasil protein yang diekspresikan yang diperlukan mempengaruhi pemilihan sistem sel yang digunakan untuk ekspresi protein.
Untuk mengekspresikan protein rekombinan, sel tertentu harus ditransfeksi dengan vektor DNA yang mengandung templat DNA rekombinan. Sel-sel yang ditransfeksi dengan templat kemudian dikulturkan. Sebagai konsekuensi dari mekanisme seluler, sel menyalin dan menerjemahkan protein yang diinginkan, sehingga menghasilkan protein yang ditargetkan.
Karena protein yang diekspresikan terperangkap dalam matriks seluler, sel harus dilisis (terganggu dan dipecahkan) untuk melepaskan protein. Pada langkah pemurnian berikutnya, protein dipisahkan dan dimurnikan.
Protein rekombinan pertama yang digunakan dalam pengobatan adalah insulin manusia rekombinan pada tahun 1982. Saat ini, lebih dari 170 jenis protein rekombinan diproduksi di seluruh dunia untuk perawatan medis. Protein rekombinan yang umum digunakan dalam pengobatan misalnya hormon rekombinan, interferon, interleukin, faktor pertumbuhan, faktor nekrosis tumor, faktor pembekuan darah, obat trombolitik, dan enzim untuk mengobati penyakit utama seperti diabetes, dwarfisme, infark miokard, gagal jantung kongestif, apoplexy serebral, multiple sclerosis, neutropenia, trombositopenia, anemia, hepatitis, rheumatoid arthritis, asma, penyakit Crohn, dan terapi kanker. (lih. Phuc V. Pham, dalam Teknologi Omics dan Bio-Teknik, 2018)
Literatur / Referensi
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.

Sonikator VialTweeter untuk sonikasi simultan dari 10 sampel, misalnya untuk mengganggu sel BL21