Lisis Sel BL21 dengan Ultrasonikasi

Sel BL21 merupakan galur E. coli yang banyak digunakan di laboratorium penelitian, bioteknologi, dan produksi industri karena kemampuannya mengekspresikan protein dengan sangat efisien. Disrupsi sel, lisis, dan ekstraksi protein secara ultrasonik merupakan metode umum untuk mengisolasi dan mengumpulkan protein target dari bagian dalam sel BL21. Ultrasonikasi mendisrupsi sel sepenuhnya dan melepaskan semua protein yang terperangkap, sehingga 100% protein tersedia.

Sel BL21 untuk Ekspresi Protein

Sel BL21 merupakan galur bakteri E. coli yang kompeten secara kimiawi dan sesuai untuk transformasi serta ekspresi protein tingkat tinggi menggunakan sistem induksi T7 RNA polimerase-IPTG. Sel BL21 memungkinkan ekspresi protein dengan efisiensi tinggi dari gen apa pun yang berada di bawah kendali promotor T7. Galur E. coli BL21(DE3) merupakan galur produksi protein berbasis T7 RNA polimerase yang dikombinasikan dengan vektor ekspresi berbasis promotor T7 dan banyak digunakan di laboratorium serta industri untuk menghasilkan protein rekombinan. Pada BL21(DE3), ekspresi gen yang mengode protein rekombinan ditranskripsikan oleh T7 RNA polimerase (T7 RNAP) yang dikode pada kromosom, yang melakukan transkripsi delapan kali lebih cepat daripada RNAP E. coli konvensional. Hal ini menjadikan galur BL21(DE3) sangat efisien dan salah satu sistem sel untuk ekspresi protein yang paling diminati.

Protokol Lisis Ultrasonik dan Ekstraksi Protein dari Sel BL21

Lisis sel BL21 sebagian besar dilakukan menggunakan ultrasonikasi yang dikombinasikan dengan natrium lauroil sarkosinat (juga dikenal sebagai sarkosyl) sebagai larutan penyangga lisis. Keunggulan disrupsi sel dan ekstraksi protein secara ultrasonik terletak pada keandalan, reproduktibilitas, serta pengoperasian sonikator yang sederhana, aman, dan cepat. Protokol di bawah ini memberikan petunjuk langkah demi langkah untuk lisis sel BL21 secara ultrasonik:

• Untuk menghilangkan protein pendamping, pelet bakteri BL21 disuspensikan kembali dalam 50 ml larutan penyangga Sodium Tris-EDTA (STE) sedingin es (terdiri atas 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl yang ditambah dengan 100 mM PMSF).
• Kemudian, 500 ul lisozim (10 mg/ ml) ditambahkan dan sel diinkubasi di atas es selama 15 min.
• Setelah itu, 500 ul DTT dan 7 ml sarkosyl (10% (w/v) yang dibuat dalam larutan penyangga STE) ditambahkan.
• Semua larutan penyangga pemurnian harus tetap sedingin es dan sampel harus selalu diletakkan di atas es. Semua tahap pemurnian harus dilakukan di ruang dingin jika memungkinkan.



• Untuk lisis ultrasonik dan ekstraksi protein, sampel disonikasi dalam VialTweeter MultiSample Ultrasonicator selama 4 x 30 sec pada amplitudo 100% dengan interval 2 min di antara setiap sonikasi. Sebagai alternatif, homogenizer ultrasonik tipe probe dengan ujung mikro, misalnya UP200Ht dengan S26d2 (3 x 30 sec, jeda 2 min. di antara siklus ultrasonik, amplitudo 80%) dapat digunakan.
• Untuk tahap pemurnian selanjutnya, sampel harus tetap diletakkan di atas es atau sebagai alternatif disimpan pada -80°C hingga pemrosesan lebih lanjut.

Lisis Ultrasonik dengan Kendali Suhu yang Presisi

Kendali suhu yang presisi dan andal sangat penting saat menangani sampel biologis. Suhu tinggi memicu degradasi protein akibat panas dalam sampel.
Seperti semua teknik preparasi sampel mekanis, sonikasi menghasilkan panas. Namun, suhu sampel dapat dikendalikan dengan baik saat menggunakan VialTweeter. Kami menyajikan berbagai pilihan untuk memantau dan mengendalikan suhu sampel Anda saat mempersiapkannya dengan VialTweeter dan VialPress untuk analisis.

1. Pemantauan suhu sampel: Prosesor ultrasonik UP200St, yang menggerakkan VialTweeter, dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas dan sensor suhu yang dapat dipasang. Hubungkan sensor suhu ke UP200St dan masukkan ujung sensor suhu ke dalam salah satu tabung sampel. Melalui layar sentuh digital berwarna, Anda dapat mengatur rentang suhu tertentu untuk sonikasi sampel pada menu UP200St. Sonikator akan berhenti secara otomatis saat suhu maksimum tercapai dan menjeda operasi hingga suhu sampel turun ke nilai bawah dari ∆ suhu yang ditetapkan. Kemudian sonikasi dimulai kembali secara otomatis. Fitur cerdas ini mencegah degradasi akibat panas.
2. Blok VialTweeter dapat didinginkan terlebih dahulu. Masukkan blok VialTweeter (hanya sonotrode tanpa transduser!) ke dalam lemari es atau freezer untuk mendinginkan blok titanium terlebih dahulu, sehingga membantu menunda kenaikan suhu dalam sampel. Jika memungkinkan, sampel itu sendiri juga dapat didinginkan terlebih dahulu.
3. Gunakan es kering untuk pendinginan selama sonikasi. Gunakan baki dangkal yang diisi es kering dan letakkan VialTweeter di atas es tersebut agar panas dapat terdisipasi dengan cepat.

Pelanggan di seluruh dunia menggunakan VialTweeter dan VialPress untuk pekerjaan preparasi sampel harian mereka di laboratorium biologi, biokimia, kedokteran, dan klinis. Dengan perangkat lunak cerdas dan kendali suhu prosesor UP200St, suhu dikendalikan secara andal dan degradasi sampel akibat panas dapat dihindari. Preparasi sampel ultrasonik dengan VialTweeter dan VialPress memberikan hasil yang sangat andal dan dapat direproduksi!
 

Temukan Alat Disrupsi Ultrasonik yang Optimal untuk Aplikasi Lisis Anda

Hielscher Ultrasonics merupakan produsen berpengalaman selama bertahun-tahun dalam pembuatan alat disrupsi sel dan homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi untuk laboratorium, sistem meja laboratorium, dan sistem skala industri. Ukuran kultur sel bakteri Anda, tujuan penelitian atau produksi Anda, serta volume sel yang akan diproses per jam atau per hari merupakan faktor penting untuk menemukan alat disrupsi sel ultrasonik yang tepat bagi aplikasi Anda.
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai solusi untuk sonikasi beberapa sampel secara bersamaan (hingga 10 vial dengan VialTweeter) dan sampel dalam jumlah besar (yaitu pelat mikrotiter / pelat ELISA dengan UIP400MTP), serta sonikator laboratorium tipe probe klasik dengan berbagai tingkat daya dari 50 hingga 400 watt sampai prosesor ultrasonik industri sepenuhnya dengan daya hingga 16.000watt per unit untuk disrupsi sel dan ekstraksi protein komersial dalam produksi skala besar. Semua sonikator Hielscher dirancang untuk pengoperasian 24/7/365 pada beban penuh. Ketangguhan dan keandalan merupakan fitur utama perangkat ultrasonik kami.
Semua homogenizer ultrasonik digital dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas, layar sentuh berwarna, dan pencatatan data otomatis, yang menjadikan perangkat ultrasonik sebagai alat kerja yang praktis di laboratorium dan fasilitas produksi.
Beri tahu kami jenis sel, volume, frekuensi, serta tujuan pemrosesan sampel biologis Anda. Kami akan merekomendasikan alat disrupsi sel ultrasonik yang paling sesuai dengan kebutuhan proses Anda.

Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sistem ultrasonik kami, mulai dari homogenizer genggam ringkas dan sonikator multisampel hingga prosesor ultrasonik industri untuk aplikasi komersial:

Literatur / Referensi

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.