Protokol untuk Inaktivasi Virus Corona SARS-CoV-2 dengan Sonikasi

Hielscher VialTweeter adalah unit persiapan multi-sampel ultrasonik yang unik, yang digunakan untuk menonaktifkan virus corona SARS-COV-2. VialTweeter memungkinkan untuk menyiapkan hingga 10 botol sampel secara bersamaan dan dengan demikian merupakan unit yang ideal untuk pemrosesan sampel massal.

Inaktivasi Virus Corona SARS-CoV-2 dengan VialTweeter

Setelah menghilangkan fiksatif, monolayer dicuci tiga kali dengan phosphate-buffered saline (PBS) sebelum mengikis sel menjadi 1mL MEM/5% FBS dan disonikasi (3 × 10 detik aktif, 10 detik mati pada daya dan amplitudo 100%) menggunakan prosesor ultrasonik Hielscher UP200St dengan VialTweeter Lampiran. Supernatan diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 3000 × g selama 10 menit. 

Baca protokol lengkapnya di sini untuk penonaktifan virus corona SARS-CoV-2 oleh Welch et al. (2020) di bawah ini:

Sel dan Virus

Sel Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) dibiakkan dalam media esensial minimum (MEM) Eagle yang dimodifikasi dilengkapi dengan 10% (v/v) serum betis janin (FCS). Virus yang digunakan adalah strain SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, diisolasi oleh PHE dari klaster pasien pertama di Inggris pada 29/01/2020. Virus ini diperoleh pada bagian 1 dan digunakan untuk studi inaktivasi pada bagian 2 atau 3.
Untuk reagen dan bahan kimia yang digunakan untuk inaktivasi SARS-CoV-2 serta penghapusan sitotoksisitas reagen, silakan lihat laporan ilmiah Welch et al. (2020).

Penonaktifan virus oleh deterjen – Protokol Inaktivasi Virus Corona SARS-CoV-2 oleh Welch et al. 2020

Inaktivasi SARS-CoV-2

Untuk produk komersial, sediaan virus (cairan kultur jaringan, titer mulai dari 1 × 10⁶ hingga 1 × 10^8. PFU/ml) diolah tiga kali lipat dengan reagen pada konsentrasi dan untuk waktu kontak yang direkomendasikan dalam petunjuk penggunaan produsen, jika tersedia, atau untuk konsentrasi dan waktu yang secara khusus diminta oleh laboratorium pengujian. Di mana kisaran konsentrasi diberikan oleh pabrikan, rasio terendah produk terhadap sampel diuji (yaitu konsentrasi terendah yang direkomendasikan dari produk uji). Reagen tabung transportasi spesimen diuji menggunakan rasio satu volume cairan kultur jaringan dengan sepuluh volume reagen, kecuali rasio volume cairan sampel terhadap reagen ditentukan oleh pabrikan. Deterjen, fiksatif, dan pelarut diuji pada konsentrasi yang ditunjukkan untuk waktu yang ditunjukkan. Semua langkah inaktivasi dilakukan pada suhu ruangan sekitar (18 – 25°C). Untuk pengujian jenis sampel alternatif, virus dimasukkan ke dalam matriks sampel yang ditunjukkan dengan perbandingan 1:9, kemudian diobati dengan reagen uji seperti di atas. Semua percobaan termasuk sampel yang diolah dengan kontrol tiga kali lipat dengan volume PBS yang setara sebagai pengganti reagen uji. Segera setelah waktu kontak yang diperlukan, 1mL sampel yang diolah diproses menggunakan matriks filtrasi yang dipilih dengan tepat. Penghapusan reagen untuk pengujian inaktivasi dilakukan dalam format kolom spin yang lebih besar menggunakan Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), atau dengan mengisi kolom centrifuge berkapasitas Pierce 10mL kosong (Thermo Fisher) dengan SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR atau Sephadex LH-20 untuk menghasilkan manik-manik/resin kemasan 4mL. Untuk pemurnian menggunakan filter Amicon, sampel 2 × 500μl dimurnikan menggunakan dua filter sentrifugal dengan metode yang dijelaskan sebelumnya, kemudian dikumpulkan bersama. Untuk formaldehida dan formaldehida dengan penghilangan glutaraldehida, satu filter digunakan dengan volume sampel 1× 500μl, ditangguhkan kembali setelah diproses dalam 500μl PBS, dan ditambahkan ke 400ul MEM/5% FBS. Untuk penonaktifan yang terinfeksi lapisan tunggal, 12,5 cm² labu sel Vero E6 (2,5 × 10⁶ sel/labu dalam 2.5mL MEM/5% FBS) terinfeksi pada MOI 0.001 dan diinkubasi pada 37°C/5% CO₂ selama 24 jam. Supernatan dihilangkan, dan sel diperbaiki menggunakan 5mL formaldehida, atau formaldehida dan glutaraldehida pada suhu kamar selama 15 atau 60 menit. Fisatif dihilangkan, dan monolayer dicuci tiga kali dengan PBS sebelum mengikis sel menjadi 1mL MEM / 5% FBS dan disonikasi (3 × 10 detik aktif, 10 detik mati pada daya dan amplitudo 100%) menggunakan UP200St dengan lampiran VialTweeter (Teknologi Ultrasound Hielscher). Supernatan diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 3000 × g selama 10 menit.

Rincian reagen yang digunakan untuk inaktivasi virus corona SARS-CoV-2 dengan VialTweeter ultrasonik sesuai dengan protokol oleh Welch et al. 2020

Protokol lengkap termasuk penggunaan Hielscher VialTweeter dapat ditemukan di sini:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dismembrator Ultrasonik Canggih dan Pengganggu Sel

Ultrasonicator multi-sampel VialTweeter hanyalah salah satu dari banyak solusi ultrasonik untuk persiapan sampel di laboratorium biologis, biokimia dan klinis. Hielscher Ultrasonics menawarkan dismembrator ultrasonik yang ideal untuk aplikasi Anda, misalnya lisis sel, ekstraksi sel, homogenisasi jaringan, pelarutan lisat, pelarutan, degassing sampel, dll.
Beri tahu kami berapa banyak sampel yang harus Anda proses per jam dan hari, jika Anda lebih suka sonikasi langsung atau tidak langsung dan apa target perawatan sampel ultrasonik. Kami akan merekomendasikan Anda unit ultrasonik yang paling cocok untuk rutinitas kerja harian Anda!
Prosesor ultrasonik digital Hielscher Ultrasonic dilengkapi dengan perangkat lunak pintar, perekaman data otomatis, opsi pra-pengaturan yang mudah untuk kontrol suhu, durasi sonikasi, mode siklus / pulsa serta penerangan sampel dan remote control browser. Kami berusaha untuk membuat perangkat ultrasonik kami secerdas mungkin sehingga penelitian dan rutinitas kerja Anda menjadi senyaman dan sesukses mungkin.
Klik di sini, untuk menemukan lebih banyak aplikasi termasuk protokol persiapan sampel ultrasonik dengan VialTweeter!