Protokol Inaktivasi Coronavirus SARS-CoV-2 dengan Sonikasi

Hielscher VialTweeter adalah unit preparasi multisampel ultrasonik yang unik, yang digunakan untuk menginaktivasi coronavirus SARS-COV-2. VialTweeter memungkinkan preparasi hingga 10 vial sampel secara bersamaan sehingga merupakan unit yang ideal untuk pemrosesan sampel secara massal.

Inaktivasi Coronavirus SARS-CoV-2 dengan VialTweeter

Setelah fiksatif dibuang, lapisan tunggal sel dicuci tiga kali dengan larutan salin berpenyangga fosfat (PBS) sebelum sel dikerok ke dalam 1mL MEM/5% FBS dan disonikasi (3 × 10 detik aktif, 10 detik nonaktif dengan daya dan amplitudo 100%) menggunakan prosesor ultrasonik Hielscher UP200St dengan VialTweeter sebagai aksesori. Supernatan dijernihkan dengan sentrifugasi pada 3000 × g selama 10 menit. Baca protokol lengkap inaktivasi coronavirus SARS-CoV-2 oleh Welch et al. (2020) di bawah ini:

Sel dan Virus

Sel Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) dikultur dalam medium esensial minimum Eagle yang dimodifikasi (MEM) dengan penambahan 10% (v/v) serum janin sapi (FCS). Virus yang digunakan adalah SARS-CoV-2 galur hCOV-19/England/2/2020, yang diisolasi oleh PHE dari klaster pasien pertama di Inggris Raya pada 29/01/2020. Virus ini diperoleh pada pasase 1 dan digunakan untuk studi inaktivasi pada pasase 2 atau 3.
Untuk reagen dan bahan kimia yang digunakan dalam inaktivasi SARS-CoV-2 serta penghilangan sitotoksisitas reagen, silakan lihat laporan ilmiah Welch et al. (2020).

Inaktivasi virus oleh detergen – Protokol Inaktivasi Coronavirus SARS-CoV-2 oleh Welch et al. 2020

Inaktivasi SARS-CoV-2


Untuk produk komersial, preparat virus (cairan kultur jaringan, dengan titer berkisar dari 1 × 10⁶ hingga 1 × 10⁸ PFU/ml) diberi perlakuan dalam tiga ulangan dengan reagen pada konsentrasi dan selama waktu kontak yang direkomendasikan dalam petunjuk penggunaan produsen, jika tersedia, atau pada konsentrasi dan selama waktu yang secara khusus diminta oleh laboratorium pengujian. Jika produsen memberikan rentang konsentrasi, rasio produk terhadap sampel yang terendah diuji (yaitu konsentrasi produk uji terendah yang direkomendasikan). Reagen tabung transportasi spesimen diuji menggunakan rasio satu volume cairan kultur jaringan terhadap sepuluh volume reagen, kecuali jika produsen menetapkan rasio volume cairan sampel terhadap reagen. Detergen, fiksatif, dan pelarut diuji pada konsentrasi dan selama waktu yang ditunjukkan. Semua tahap inaktivasi dilakukan pada suhu ruang sekitar (18 – 25°C). Untuk pengujian jenis sampel alternatif, virus ditambahkan ke dalam matriks sampel yang ditunjukkan dengan rasio 1:9, lalu diberi perlakuan dengan reagen uji seperti di atas. Semua eksperimen mencakup sampel kontrol dengan perlakuan semu dalam tiga ulangan, menggunakan PBS dengan volume yang setara sebagai pengganti reagen uji. Segera setelah waktu kontak yang diperlukan, 1mL sampel yang telah diberi perlakuan diproses menggunakan matriks filtrasi yang dipilih sesuai kebutuhan. Penghilangan reagen untuk pengujian inaktivasi dilakukan dalam format kolom sentrifugasi yang lebih besar menggunakan Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), atau dengan mengisi kolom sentrifugasi Pierce kosong berkapasitas 10mL (Thermo Fisher) dengan SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR, atau Sephadex LH-20 hingga diperoleh 4mL manik/resin yang dipadatkan. Untuk pemurnian menggunakan filter Amicon, sampel 2 × 500μl dimurnikan menggunakan dua filter sentrifugal dengan metode yang dijelaskan sebelumnya, kemudian digabungkan. Untuk penghilangan formaldehida dan formaldehida dengan glutaraldehida, satu filter digunakan dengan volume sampel 1× 500μl; setelah pemrosesan, sampel diresuspensi dalam 500μl PBS dan ditambahkan ke 400ul MEM/5% FBS. Untuk inaktivasi lapisan tunggal sel yang terinfeksi, labu kultur berukuran 12,5 cm² yang berisi sel Vero E6 (2,5 × 10⁶ sel/labu dalam 2,5mL MEM/5% FBS) diinfeksi pada MOI 0,001 dan diinkubasi pada 37°C/5% CO₂ selama 24 jam. Supernatan dibuang, dan sel difiksasi menggunakan 5mL formaldehida, atau formaldehida dan glutaraldehida pada suhu ruang selama 15 atau 60 menit. Fiksatif dibuang, dan lapisan tunggal sel dicuci tiga kali dengan PBS sebelum sel dikerok ke dalam 1mL MEM/5% FBS dan disonikasi (3 × 10 detik aktif, 10 detik nonaktif dengan daya dan amplitudo 100%) menggunakan UP200St dengan aksesori VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatan dijernihkan dengan sentrifugasi pada 3000 × g selama 10 menit.


Rincian reagen yang digunakan untuk inaktivasi coronavirus SARS-CoV-2 dengan VialTweeter ultrasonik menurut protokol Welch et al. 2020

Protokol lengkap yang mencakup penggunaan Hielscher VialTweeter dapat ditemukan di sini:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Alat Penghancur Jaringan dan Disrupsi Sel Ultrasonik yang Canggih

Sonikator multisampel VialTweeter hanyalah salah satu dari banyak solusi ultrasonik untuk preparasi sampel di laboratorium biologi, biokimia, dan klinis. Hielscher Ultrasonics menawarkan alat penghancur ultrasonik yang ideal untuk aplikasi Anda, misalnya lisis sel, ekstraksi sel, homogenisasi jaringan, solubilisasi lisat, pelarutan, penghilangan gas dari sampel, dan sebagainya.
Beri tahu kami berapa banyak sampel yang harus Anda proses per jam dan per hari, apakah Anda lebih memilih sonikasi langsung atau tidak langsung, serta apa tujuan perlakuan ultrasonik terhadap sampel tersebut. Kami akan merekomendasikan unit ultrasonik yang paling sesuai untuk rutinitas kerja harian Anda!
Prosesor ultrasonik digital Hielscher Ultrasonics dilengkapi dengan perangkat lunak cerdas, pencatatan data otomatis, opsi prapengaturan yang mudah untuk kontrol suhu, durasi sonikasi, mode siklus/pulsa, serta pencahayaan sampel dan kendali jarak jauh melalui peramban. Kami berupaya membuat perangkat ultrasonik kami secerdas mungkin agar penelitian dan rutinitas kerja Anda menjadi senyaman dan seberhasil mungkin.
Klik di sini untuk menemukan lebih banyak aplikasi, termasuk protokol preparasi sampel ultrasonik dengan VialTweeter!