Ultrasonik Protein Ekstraksi dari Jaringan dan Sel Kultur
- Ekstraksi protein merupakan langkah persiapan sampel penting dalam proteomik.
- Protein dapat diekstrak dari tanaman dan jaringan binatang, ragi dan mikroorganisme.
- Sonikasi adalah metode ekstraksi protein yang handal, efisien yang memberikan hasil protein yang tinggi dalam ekstraksi dengan waktu yang singkat.
Ekstraksi protein dari jaringan dan sel
Ekstraksi protein dari jaringan dan sel yang dikultur adalah langkah persiapan sampel penting yang dilakukan selama banyak teknik biokimia dan analitis seperti ELISA, PAGE, western blotting, spektrometri massa, atau pemurnian protein. Gangguan sel ultrasonik, lisis dan ekstraksi adalah teknik non-termal yang dapat dikontrol dengan tepat untuk memastikan hasil protein yang tinggi.
Ekstraksi protein dari sel dengan probe ultrasonik UP200St
- Cepat
- Hasil yang tinggi
- Sangat efisien
- Kontrol yang tepat atas parameter
- Hasil yang dapat digandakan
- Skalabilitas linear
Petunjuk Umum Untuk Ultrasonic Lysis dan Ekstraksi Protein
- Pengatur suhu: Untuk memastikan hasil protein tinggi tanpa denaturasi termal, suhu selama ekstraksi harus dikendalikan. state-of-art homogenizers ultrasonik Hielscher ini – Juga disebut disintegrasi ultrasonik atau ultrasonifier – adalah justru dikontrol. Mereka datang dengan sensor suhu plugable. Dalam opsi pengaturan dari homogenizer ultrasonik, suhu maksimum dapat diatur. Ketika max suhu ini tercapai, Ultrasonikator secara otomatis berhenti sampai sampel sudah dingin.
- Penyangga: Choise penyangga yang sesuai dan volume yang tepat buffer bervariasi dari jaringan ke jaringan dan harus pikir-out dengan tes trial-and-error.
- Isolasi / pemurnian: lysates Protein dapat berisi kelebihan biomolekul seperti DNA atau karbohidrat, yang dapat dihilangkan dengan presipitasi protein (asam deoksikolat-trikloroasetat) atau buffer pertukaran.
Chittapalo dan Noomhorm (2009) melaporkan dalam studi mereka bahwa hasil protein meningkat menggunakan sonikasi dan bahwa homogenisasi jaringan ultrasonik dan proses lisis dapat meningkatkan proses ekstraksi yang ada secara signifikan – memungkinkan untuk peluang ekstraksi komersial baru.
Ultrasonik CupHorn untuk persiapan sampel simultan dan sangat berkhasiat dari beberapa sampel dalam kondisi yang sama untuk isolasi protein dan fragmentasi DNA.
Ekstraksi Protein dari Jaringan Binatang
Untuk persiapan jaringan berukuran keseluruhan (misalnya ginjal, jantung, paru-paru, otot dll.), Jaringan harus dibedah menjadi potongan yang sangat kecil dengan alat bersih, di atas es sebaiknya, dan secepat mungkin untuk mencegah degradasi oleh protease (mis. buffer lisis seperti buffer lisis RIPA atau hipotonik yang mengandung koktail inhibitor protease dan fosfatase). Setelah pembedahan, sampel direndam menjadi nitrogen cair untuk pembekuan seketika. Sampel dapat disimpan pada suhu -80 ° C untuk penggunaan selanjutnya atau digantikan es untuk homogenisasi segera. Segera sebelum ekstraksi ultrasonik, buffer lisis dingin dingin (dengan protease inhibitor DTT, leupeptin dan aprotinin) ditambahkan dengan cepat ke dalam tabung sampel (per ~ 10 mg kira-kira kira ~ 600 μL buffer direkomendasikan). Kira-kira. 20-60mg jaringan direkomendasikan per tabung sampel.
Homogenisasi ultrasonik, lisis dan ekstraksi dilakukan dengan homogenizer ultrasonik seperti UP100H atau UP200Ht, dilengkapi dengan sonotrode micro-tip. Durasi sonikasi adalah 60-90 detik pada mode siklus ultrasonik 15 detik sonikasi dan 10 detik waktu istirahat. Sampel harus disimpan dalam es sepanjang waktu.
Setelah ultrasonik homogenisasi / ekstraksi, lysate disentrifugasi di 27.000 g untuk kira-kira 20 menit setelah itu supernatent yang dikumpulkan, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan oleh sebuah assay protein seperti Pierce protein assay BCA.
Ekstraksi Protein dari Serum Darah
Untuk campuran homogen serum dan buffer fosfat, sampel dipusaran terlebih dahulu sebelum lisis sel ultrasonik. Untuk lisis ultrasonik, sampel disonikasi dengan homogenizer laboratorium ultrasonik seperti UP100H selama 8 siklus pada amplitudo 20%, untuk siklus setiap 5 detik hidup dan 15 detik mati. Ekstraksi protein dilakukan dengan sonikasi dalam siklus (mode denyut) dan dengan menempatkan sampel di atas es sehingga panas berlebih dan degradasi termal sampel dihindari. Karena serum mengandung sejumlah besar protein dengan berat molekul tinggi (seperti albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, imunoglobulin G dan imunoglobulin A), yang mengganggu pemisahan protein dengan berat molekul rendah selama IEF, disarankan untuk mengurasnya dari serum menggunakan kolom penipisan.
Ekstraksi Protein dari jaringan Tumbuhan
Segar, jaringan tanaman lunak, misalnya lumut dll, dapat dengan mudah terganggu dengan hanya menempatkan materi sampel cincang di buffer lisis untuk sonikasi. Tangguh, jaringan tanaman ligenous, seperti biji, cemara jarum dll, harus tanah kering. Beberapa keras, bahan tanaman berkayu harus dibekukan dan tanah dalam nitrogen cair sebelum diekstraksi dengan sonikasi. Untuk suspensi kultur sel tanaman, pengobatan ultrasonik antara 30 dan 150 detik dalam buffer lisis sebagian besar cukup. bahan lebih keras seperti biji labu memerlukan sonikasi lebih intens seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Protokol untuk Ultrasonik Ekstraksi Albumin dari Biji Labu
Untuk ekstraksi protein ultrasonik albumin dari bubuk biji labu halus, 10 g bubuk biji labu defatted dan 100 mL air deionisasi sebagai pelarut ditambahkan dalam gelas gelas 250mL. Ekstraksi protein terdiri dari dua langkah: Pertama, sampel disonikasi dengan ultrasonikator tipe probe UP400St (400W, 24kHz) dilengkapi dengan sonotrode S24d7. Gelas kimia ditempatkan dalam bak air dingin selama homogenisasi ultrasonik. Sensor suhu pluggable dan pengaturan kontrol suhu ultrasonikator UP400St memastikan bahwa suhu sampel selalu dijaga di bawah 30 ° C. Dengan kontrol suhu yang tepat selama sonikasi, denaturasi albumin dihindari. Kedua, ekstraksi dilakukan dengan mixer pada kecepatan 200 rpm dan pada suhu 30°C. Setelah itu gelas kimia dipindahkan ke shaker termostatik. Globulin dihilangkan melalui dialisis dengan air suling. Setelah penghilangan globulin, ekstrak protein dapat diambil sampelnya untuk penentuan profil albumin dan selanjutnya disesuaikan dengan pI=3,0 menggunakan 0,1 M HCl untuk koagulasi albumin. Fase padat dipisahkan dengan sentrifugasi pada 5000g, 20°C dan dilarutkan kembali dalam air deionisasi. Koagulasi albumin dilakukan dua kali untuk meningkatkan rasio protein dalam konsentrat albumin.
Ultrasonik ekstraksi protein basa untuk persiapan konsentrat protein dari dedak padi menunjukkan bahwa hasil pengobatan ultrasonik dalam hasil protein yang lebih tinggi dalam waktu ekstraksi secara signifikan lebih pendek – dibandingkan dengan metode ekstraksi konvensional.
protokol persiapan sampel untuk enzim iNOS fungsional
Untuk mendapatkan enzim iNOS yang berfungsi penuh (misalnya untuk skrining obat), protokol berikut direkomendasikan: Suspensi sel harus ditempatkan di atas es dan disonikasi dengan UP100H pada amplitudo 10μm pada mode siklus sonikasi 5 detik dan 25 detik bertumpu pada es. Prosedur ini harus diulang sekitar 3 kali. Waktu istirahat di antara siklus sonikasi mengurangi kenaikan suhu dan karenanya akan mengurangi risiko denaturasi.
Ultrasonic Protein Solubilisasi
Sonication dapat mempercepat proses pelarutan protein, yang biasanya membutuhkan beberapa jam. Agar tidak terlalu panas sampel dan mencegah degradasi protein dan modifikasi dalam larutan yang mengandung urea, semburan ultrasonik seharusnya tidak berlangsung lebih lama dari beberapa detik.
Ultrasonicator UP200Ht dengan 2mm microtip S26d2 untuk sonikasi sampel kecil.
Peralatan ultrasonik untuk Ekstraksi Protein
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai homogenizers ultrasonik untuk disintegrasi sel, jaringan, bakteri, mikroorganisme, ragi, dan spora.
Ultrasonikator lab Hielscher sangat kuat dan mudah dioperasikan. Dibuat untuk operasi 24/7, perangkat ini dirancang sebagai perangkat lab dan bench-top yang kuat dan efisien. Untuk semua perangkat, output energi dan amplitudo dapat dikontrol dengan tepat. Berbagai macam aksesori membuka opsi pengaturan lebih lanjut. Ultrasonikator digital seperti VialTweeter, UP200Ht, UP200St, dan UP400St memiliki kontrol suhu terintegrasi dan kartu SD built-in untuk perekaman data otomatis.
Untuk sonikasi tidak langsung, bebas kontaminasi silang dan simultan dari beberapa sampel, kami menawarkan VialTweeter atau CupHorn ultrasonik.
Tabel di bawah ini memberi Anda gambaran umum tentang ultrasonicators kami untuk persiapan sampel, gangguan sel dan ekstraksi. Klik pada jenis perangkat untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang setiap homogenizer ultrasonik. Staf teknis kami yang terlatih dan berpengalaman lama akan dengan senang hati membantu Anda memilih ultrasonicator yang paling cocok untuk persiapan sampel Anda!
| Batch Volume | Flow Rate | Direkomendasikan perangkat |
|---|---|---|
| hingga 10 botol atau tabung | n.a. | VialTweeter |
| pelat multiwell / microtiter | n.a. | UIP400MTP |
| beberapa tabung / pembuluh | n.a. | CupHorn |
| 1 hingga 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
| 10 hingga 1000mL | 20 hingga 200mL/menit | UP200Ht, UP200St |
| 10-2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP400St |
Tergantung pada aplikasi, materi, dan volume sampel Anda, kami akan merekomendasikan Anda setup yang paling cocok untuk persiapan sampel Anda. Hubungi kami hari ini!
Hubungi Kami! / Tanya Kami!
Ultrasonicators digital Hielscher fitur remote control browser dan protokol data otomatis pada SD-card terintegrasi.
VialTweeter untuk sonikasi langsung.
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
proteomik
Proteomik adalah bidang penelitian yang menyelidiki protein dan proteoma. Protein fullfil array yang luas dari fungsi-fungsi vital dalam organisme. proteome adalah seluruh set protein diungkapkan oleh genom, sel, jaringan, atau organisme pada waktu tertentu. proteome bervariasi dengan waktu dan berbeda persyaratan, atau tekanan, bahwa sebuah sel atau organisme mengalami. Lebih khusus lagi, adalah set protein diekspresikan dalam jenis tertentu dari sel atau organisme, pada waktu tertentu, di bawah kondisi yang ditetapkan. Istilah adalah campuran dari protein dan genom. Proteomik adalah studi tentang proteoma.
protein
Protein adalah yang biomolekul besar, yang disebut makromolekul – yang terdiri dari satu atau lebih rantai panjang residu asam amino. Protein hadir dalam semua organisme dari tumbuhan dan hewan dan sangat penting untuk sebagian besar fungsi biologisnya. Karena protein mengandung banyak informasi biologis, protein tersebut diekstraksi untuk tujuan analisis, misalnya untuk penelitian proteomik. Fungsi terpenting yang dilakukan oleh protein meliputi katalisis reaksi metabolik, replikasi DNA, respon terhadap rangsangan, dan pengangkutan molekul dari satu lokasi ke lokasi lainnya. Protein berbeda satu sama lain terutama dalam urutan asam amino mereka, yang didikte oleh urutan nukleotida gen mereka, dan yang biasanya menghasilkan protein yang dilipat menjadi struktur tiga dimensi spesifik yang menentukan aktivitasnya. Protein adalah – selain peptida – salah satu komponen kunci dari makanan. Oleh karena itu, proteomik adalah alat yang ampuh dalam ilmu makanan untuk mengoptimalkan proses, keamanan pangan dan penilaian gizi.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction adalah prosedur pra-analitis untuk memisahkan dan pra-konsetir. Dalam kombinasi dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik awan dapat diintensifkan membuat proses lebih efisien, lebih cepat, dan ramah lingkungan. Dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik awan adalah metode persiapan analit yang jauh lebih efisien. Baca lebih lanjut tentang ekstraksi titik awan ultrasonically dibantu!gel Elektroforesis
Gel elektroforesis adalah metode utama untuk pemisahan dan analisis makromolekul seperti DNA, RNA dan protein serta fragmen mereka, berdasarkan ukuran dan biaya mereka. Hal ini digunakan dalam kimia klinis untuk memisahkan protein dengan muatan dan / atau ukuran (IEF agarosa, pada dasarnya ukuran independen) dan biokimia, biologi molekuler dan proteomik untuk memisahkan populasi campuran fragmen DNA dan RNA oleh panjang, untuk memperkirakan ukuran DNA dan RNA fragmen atau untuk memisahkan protein oleh biaya.
Budaya sel
kultur sel adalah proses tumbuh dikendalikan oleh sel-sel yang dibudidayakan dalam kondisi yang terkendali. kondisi kultur sel bervariasi untuk setiap jenis sel. Secara umum, lingkungan kultur sel terdiri dari sebuah kapal yang cocok (misalnya cawan petri) dengan substrat atau media yang memasok nutrisi penting (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral), faktor pertumbuhan, hormon, dan gas (CO2, The2), Dan mengatur lingkungan fisio-kimia (pH penyangga, tekanan osmotik, suhu). Kebanyakan sel membutuhkan permukaan atau substrat buatan, sementara kultur sel lainnya dapat dibudidayakan mengambang bebas dalam medium kultur (budaya suspensi, suspensi sel).
budaya massa garis sel hewan yang digunakan dalam produksi industri vaksin virus dan produk biotechnologically berasal lainnya. sel induk manusia yang dibudidayakan untuk memperluas jumlah sel dan membedakan sel menjadi berbagai jenis sel somatik untuk tujuan transplantasi.
Sampel jaringan
Jaringan Istilah menggambarkan menengah selular, di mana materi sel pada tingkat organisasi antara sel-sel dan organ lengkap. Dalam jaringan, sel-sel yang sama, dari asal yang sama yang bersama-sama melaksanakan fungsi tertentu, dirakit. Dengan pengelompokan fungsional beberapa jaringan, struktur kompleks organ terbentuk.
Tissue sampel untuk penelitian dalam biologi, histologi / histopatologi, parasitologi, biokimia, imunohistokimia serta untuk menumbuhkan dan ekstrak DNA. Hal ini dapat dibedakan antara hewan (subdivisi: jaringan mamalia) dan jaringan tanaman. jaringan hewan dikelompokkan ke dalam empat jenis dasar ikat, otot, saraf, dan jaringan epitel. jaringan tanaman dibagi menjadi berikut tiga sistem jaringan: epidermis, jaringan dasar, dan jaringan pembuluh darah.
sampel jaringan dapat dibuat dari hewan atau tumbuhan bagian, misalnya tulang, otot, daun, dll
Cairan tubuh
Darah, serum, plasma, cairan serebrospinal, air liur dan cairan sinovial yang cairan tubuh, yang menawarkan sumber besar informasi diagnostik yang relevan. Oleh karena itu, persiapan canggih sampel cairan tubuh untuk analisis penting. Kesulitan pertama adalah terkait dengan rentang dinamis yang luas dari komponen hadir dalam cairan tubuh.
Penentuan konsentrasi protein
Bradford assay, uji Lowry dan asam bicinchoninic (BCA) assay adalah tes umum untuk menentukan konsentrasi protein. Bovine serum albumin (BSA) adalah salah satu standar protein yang paling sering digunakan.
lisis Buffer
Buffer lisis harus terpilih sesuai dengan materi sel atau jaringan (kultur jaringan, tanaman, bakteri, jamur, dll), dan apakah sel-sel dalam struktur dan jenis struktur. Berbagai lisis buffer untuk ekstraksi protein, membran, dan organel diformulasikan dengan satu atau lebih deterjen. deterjen biasanya dipilih melalui tes trial-and-error atau – jika tersedia – menurut sebuah protokol ekstraksi protein yang ada. deterjen harus kompatibel dengan sumber jaringan dan protein. Secara umum, deterjen paling ringan yang bekerja untuk jaringan / protein tertentu, yang dipilih untuk mempertahankan fungsi maksimal dari ekstrak. Selanjutnya, dalam kasus ekstraksi membran dan organel, deterjen ringan membuat membran utuh. deterjen yang biasa digunakan dalam buffer lisis sebagian besar nonionik atau zwiterionik, misalnya CHAPS, deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40, dan Tween 20.
Misalnya, jaringan seperti otak, hati, usus, ginjal, limpa dll dapat hanya buffered dengan RIPA – Namun protease inhibitor dan DTT (misalnya untuk elektroforesis gel) harus dimasukkan.
Buffer lisis untuk jaringan otot rangka (es dingin): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (b / v) gliserol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol dilengkapi dengan protease dan fosfatase inhibitor cocktail
Tabel buffer umum dan kisaran pH mereka. Secara umum, buffer ini biasanya digunakan pada konsentrasi 20-50 mM.
| Penyangga | kisaran pH |
|---|---|
| asam sitrun – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natrium sitrat – asam sitrun | 3,0 – 6,2 |
| natrium asetat – asam asetat | 3,6 – 5,6 |
| Asam Cacodylic garam natrium – Hcl | 5.0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natrium dihidrogen fosfat – disodium hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Mops – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamine hidroklorida – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| sodium tetraborat – asam borat | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glycine – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Kebanyakan buffer menunjukkan pH-ketergantungan dengan suhu. Hal ini terutama berlaku untuk Tris buffer. PKa berubah dari 8,06 pada 25 ° C ke 8,85 pada 0 ° C.
(PH dan pKa dari buffer: pH mengukur konsentrasi ion hidrogen dalam larutan berair pKa (= konstanta disosiasi asam) adalah ukuran terkait, tapi lebih spesifik, dalam hal ini membantu untuk memprediksi bagaimana molekul akan bertindak pada tertentu. nilai pH.)
Trizol
Trizol adalah larutan kimia yang digunakan untuk mengekstrak RNA / DNA / protein selama ekstraksi guanidinium tiosianat-fenol-kloroform. Penggunaan hasil ekstraksi Trizol ultrasonically dibantu dalam DNA tinggi, RNA, dan hasil protein dari sampel yang sama dan unggul metode ekstraksi sehingga lainnya.
Literatur / Referensi
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.