Ultrasonik Protein Ekstraksi dari Jaringan dan Sel Kultur
- Ekstraksi protein merupakan langkah persiapan sampel penting dalam proteomik.
- Protein dapat diekstrak dari tanaman dan jaringan binatang, ragi dan mikroorganisme.
- Sonikasi adalah metode ekstraksi protein yang handal, efisien yang memberikan hasil protein yang tinggi dalam ekstraksi dengan waktu yang singkat.
Ekstraksi Protein dari Jaringan dan Sel
Ekstraksi protein dari jaringan dan sel yang dikultur adalah langkah persiapan sampel penting yang dilakukan selama banyak teknik biokimia dan analitik seperti ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometri massa, atau pemurnian protein. Gangguan sel ultrasonik, lisis, dan ekstraksi adalah teknik non-termal yang dapat dikontrol secara tepat untuk memastikan hasil protein yang tinggi.
Ekstraksi protein dari sel dengan probe ultrasonik UP200St
- Cepat
- Hasil yang tinggi
- Sangat efisien
- Kontrol yang tepat atas parameter
- Hasil yang dapat digandakan
- Skalabilitas linear
Instruksi Umum Untuk Lisis Ultrasonik dan Ekstraksi Protein
- Kontrol Suhu: Untuk memastikan hasil protein yang tinggi tanpa denaturasi termal, suhu selama ekstraksi harus dikontrol. Homogenizer ultrasonik canggih Hielscher – juga disebut disintegrator ultrasonik atau ultrasonifier – dapat dikontrol dengan tepat. Mereka dilengkapi dengan sensor suhu yang dapat dicolokkan. Dalam opsi pengaturan homogenizer ultrasonik, suhu maksimum dapat diatur. Ketika suhu maksimum ini tercapai, ultrasonicator secara otomatis berhenti sampai sampel mendingin.
- Buffer: Pilihan buffer yang sesuai dan volume buffer yang tepat bervariasi dari satu jaringan ke jaringan lain dan harus diketahui dengan pengujian coba-coba.
- Isolasi / pemurnian: Lisat protein dapat mengandung kelebihan biomolekul seperti DNA atau karbohidrat, yang dapat dihilangkan oleh pengendapan protein (asam deoksikolat-trikloroasetat) atau pertukaran penyangga.
Chittapalo dan Noomhorm (2009) melaporkan dalam penelitian mereka bahwa hasil protein meningkat menggunakan sonikasi dan bahwa proses homogenisasi dan lisis jaringan ultrasonik dapat meningkatkan proses ekstraksi yang ada secara signifikan – memungkinkan peluang ekstraksi komersial baru.
Ultrasonik CupHorn untuk persiapan sampel yang simultan dan sangat berkhasiat dari beberapa sampel dalam kondisi yang sama untuk isolasi protein dan fragmentasi DNA.
Ekstraksi Protein dari Jaringan Binatang
Untuk persiapan jaringan berukuran utuh (misalnya ginjal, jantung, paru-paru, otot, dll.), Jaringan harus dibedah menjadi potongan-potongan yang sangat kecil dengan alat bersih, lebih disukai di atas es, dan secepat mungkin untuk mencegah degradasi oleh protease (misalnya buffer lisis seperti RIPA atau buffer lisis hipotonik yang mengandung protease dan koktail inhibitor fosfatase). Setelah dibedah, sampel direndam ke dalam nitrogen cair untuk pembekuan jepret. Sampel dapat disimpan pada suhu -80°C untuk digunakan nanti atau disimpan di atas es untuk homogenisasi segera. Segera sebelum ekstraksi ultrasonik, buffer lisis dingin es (dengan inhibitor protease DTT, leupeptin dan aprotinin) dengan cepat ditambahkan ke dalam tabung sampel (per ~10 mg jaringan sekitar ~600 μL buffer direkomendasikan). Sekitar 20-60mg jaringan direkomendasikan per tabung sampel.
Homogenisasi, lisis dan ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan homogenizer ultrasonik seperti UP100H atau UP200Ht, dilengkapi dengan sonotrode ujung mikro. Durasi sonikasi adalah 60-90 detik pada mode siklus ultrasonik 15 detik sonikasi dan 10 detik waktu istirahat. Sampel harus disimpan dalam es sepanjang waktu.
Setelah ultrasonik homogenisasi / ekstraksi, lysate disentrifugasi di 27.000 g untuk kira-kira 20 menit setelah itu supernatent yang dikumpulkan, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan oleh sebuah assay protein seperti Pierce protein assay BCA.
Ekstraksi Protein dari Serum Darah
Untuk campuran homogen serum dan buffer fosfat, sampel diputar terlebih dahulu sebelum lisis sel ultrasonik. Untuk lisis ultrasonik, sampel disonikasi dengan homogenizer lab ultrasonik seperti UP100H selama 8 siklus pada amplitudo 20%, untuk siklus setiap 5 detik aktif dan 15 detik mati. Ekstraksi protein dilakukan dengan sonication dalam siklus (mode denyut) dan dengan menempatkan sampel di atas es sehingga panas berlebih dan degradasi termal sampel dihindari. Karena serum mengandung sejumlah besar protein dengan berat molekul tinggi (seperti albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, imunoglobulin G dan imunoglobulin A), yang mengganggu pemisahan protein dengan berat molekul rendah selama IEF, disarankan untuk menguras mereka dari serum menggunakan kolom penipisan.
Ekstraksi Protein dari jaringan Tumbuhan
Jaringan tanaman segar dan lunak, misalnya lumut dll., Dapat dengan mudah terganggu hanya dengan menempatkan bahan sampel cincang dalam buffer lisis untuk sonikasi. Jaringan tanaman yang keras dan linia, seperti biji, jarum cemara, dll., Harus digiling kering. Beberapa bahan tanaman kayu yang keras harus dibekukan dan digiling dalam nitrogen cair sebelum diekstraksi dengan sonikasi. Untuk suspensi kultur sel tumbuhan, perlakuan ultrasonik antara 30 dan 150 detik dalam buffer lisis sebagian besar sudah cukup. Bahan yang lebih keras seperti biji labu membutuhkan sonikasi yang lebih intens seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Protokol untuk Ultrasonik Ekstraksi Albumin dari Biji Labu
Untuk ekstraksi protein ultrasonik albumin dari bubuk biji labu yang digiling halus, 10 g bubuk biji labu yang dihilangkan lemaknya dan 100 mL air deionisasi sebagai pelarut ditambahkan ke dalam gelas kimia kaca 250mL. Ekstraksi protein terdiri dari dua langkah: Pertama, sampel disonikasi dengan ultrasonicator tipe probe UP400St (400W, 24kHz) dilengkapi dengan sonotrode S24d7. Gelas kimia kaca ditempatkan dalam bak air dingin selama homogenisasi ultrasonik. Sensor suhu yang dapat dicolokkan dan pengaturan kontrol suhu ultrasonicator UP400St memastikan bahwa suhu sampel selalu dijaga di bawah 30 °C. Dengan kontrol suhu yang tepat selama sonikasi, denaturasi albumin dihindari. Kedua, ekstraksi dilakukan dengan mixer pada kecepatan 200 rpm dan pada 30°C. Setelah itu gelas kimia dipindahkan ke pengocok termostatik. Globulin dikeluarkan melalui dialisis dengan air suling. Setelah pengangkatan globulin, ekstrak protein dapat diambil sampelnya untuk penentuan profil albumin dan kemudian disesuaikan ke pI=3.0 menggunakan 0.1 M HCl untuk koagulasi albumin. Fase padat dipisahkan dengan sentrifugasi pada 5000g, 20°C dan dilarutkan kembali dalam air deionisasi. Koagulasi albumin dilakukan dua kali untuk meningkatkan rasio protein dalam konsentrat albumin.
Ekstraksi protein alkali ultrasonik untuk persiapan konsentrat protein dari dedak padi menunjukkan bahwa perawatan ultrasonik menghasilkan hasil protein yang lebih tinggi dalam waktu ekstraksi yang jauh lebih singkat – dibandingkan dengan metode ekstraksi konvensional.
Protokol Persiapan Sampel untuk Enzim iNOS Fungsional
Untuk mendapatkan enzim iNOS yang berfungsi penuh (misalnya untuk skrining obat), protokol berikut direkomendasikan: Suspensi sel harus ditempatkan di atas es dan disonikasi dengan UP100H pada amplitudo 10μm pada mode siklus 5 detik sonikasi dan 25 detik istirahat di atas es. Prosedur harus diulang kira-kira 3 kali. Waktu istirahat di antara siklus sonikasi mengurangi kenaikan suhu dan karenanya akan mengurangi risiko denaturasi.
Pelarutan protein ultrasonik
Sonikasi dapat mempercepat proses pelarutan protein, yang biasanya membutuhkan beberapa jam. Agar sampel tidak terlalu panas dan mencegah degradasi protein dan modifikasi dalam larutan yang mengandung urea, semburan ultrasonik tidak boleh bertahan lebih dari beberapa detik.
Ultrasonicator UP200Ht dengan microtip 2mm S26d2 untuk sonikasi sampel kecil.
Peralatan Ultrasonik untuk Ekstraksi Protein
Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai homogenizer ultrasonik untuk disintegrasi sel, jaringan, bakteri, mikroorganisme, ragi, dan spora.
Ultrasonicators lab Hielscher kuat dan mudah dioperasikan. Dibuat untuk pengoperasian 24/7, mereka dirancang sebagai perangkat lab dan bench-top yang kuat dan efisien. Untuk semua perangkat, keluaran energi dan amplitudo dapat dikontrol dengan tepat. Berbagai macam aksesori membuka opsi pengaturan lebih lanjut. Ultrasonicator digital seperti VialTweeter, UP200Ht, UP200St, dan UP400St memiliki kontrol suhu terintegrasi dan kartu SD bawaan untuk perekaman data otomatis.
Untuk sonikasi tidak langsung, bebas kontaminasi silang dan simultan dari beberapa sampel, kami menawarkan VialTweeter atau CupHorn ultrasonik.
Tabel di bawah ini memberi Anda gambaran umum tentang ultrasonicators kami untuk persiapan sampel, gangguan sel, dan ekstraksi. Klik pada jenis perangkat untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang setiap homogenizer ultrasonik. Staf teknis kami yang terlatih dan berpengalaman lama akan dengan senang hati membantu Anda memilih ultrasonicator yang paling cocok untuk persiapan sampel Anda!
| Batch Volume | Flow Rate | Direkomendasikan perangkat |
|---|---|---|
| hingga 10 botol atau tabung | n.a. | VialTweeter |
| pelat multisumur / mikrotiter | n.a. | UIP400MTP |
| beberapa tabung / bejana | n.a. | CupHorn |
| 1 hingga 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
| 10 hingga 1000mL | 20 hingga 200mL / mnt | UP200Ht, UP200St |
| 10-2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP400St |
Bergantung pada aplikasi, bahan, dan volume sampel Anda, kami akan merekomendasikan pengaturan yang paling sesuai untuk persiapan sampel Anda. Hubungi kami hari ini!
Hubungi Kami! / Tanya Kami!
Ultrasonicators digital Hielscher memiliki remote control browser dan protokol data otomatis pada kartu SD terintegrasi.
VialTweeter untuk sonikasi langsung.
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
proteomik
Proteomik adalah bidang penelitian yang menyelidiki protein dan proteom. Protein memenuhi beragam fungsi vital dalam organisme. Proteom adalah seluruh kumpulan protein yang diekspresikan oleh genom, sel, jaringan, atau organisme pada waktu tertentu. Proteom bervariasi dengan waktu dan persyaratan yang berbeda, atau tekanan, yang dialami sel atau organisme. Lebih khusus lagi, ini adalah kumpulan protein yang diekspresikan dalam jenis sel atau organisme tertentu, pada waktu tertentu, dalam kondisi yang ditentukan. Istilah ini adalah campuran protein dan genom. Proteomik adalah studi tentang proteom.
Protein
Protein adalah biomolekul besar, yang disebut makromolekul – yang terdiri dari satu atau lebih rantai panjang residu asam amino. Protein hadir di semua organisme yang berasal dari nabati dan hewani dan sangat penting untuk sebagian besar fungsi biologis. Karena protein mengandung banyak informasi biologis, mereka diekstraksi untuk tujuan analitis, misalnya untuk penelitian proteomik. Fungsi terpenting yang dilakukan oleh protein termasuk katalisis reaksi metabolisme, replikasi DNA, respons terhadap rangsangan, dan pengangkutan molekul dari satu lokasi ke lokasi lain. Protein berbeda satu sama lain terutama dalam urutan asam aminonya, yang ditentukan oleh urutan nukleotida gen mereka, dan yang biasanya menghasilkan pelipatan protein menjadi struktur tiga dimensi tertentu yang menentukan aktivitasnya. Protein adalah – selain peptida – salah satu komponen kunci makanan. Oleh karena itu, proteomik adalah alat yang ampuh dalam ilmu pangan untuk mengoptimalkan proses, keamanan pangan, dan penilaian nutrisi.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction adalah prosedur pra-analitik untuk memisahkan dan melakukan pra-konsesi analit. Dalam kombinasi dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik awan dapat diintensifkan membuat proses lebih efisien, lebih cepat, dan lebih ramah lingkungan. Dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik awan adalah metode persiapan analit yang jauh lebih efisien. Baca lebih lanjut tentang ekstraksi titik awan yang dibantu ultrasonik!Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel adalah metode utama untuk pemisahan dan analisis makromolekul seperti DNA, RNA dan protein serta fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatannya. Ini digunakan dalam kimia klinis untuk memisahkan protein berdasarkan muatan dan/atau ukuran (IEF agarosa, pada dasarnya ukuran independen) dan dalam biokimia, biologi molekuler dan proteomik untuk memisahkan populasi campuran fragmen DNA dan RNA berdasarkan panjangnya, untuk memperkirakan ukuran fragmen DNA dan RNA atau untuk memisahkan protein berdasarkan muatan.
kultur sel
Kultur sel adalah proses pertumbuhan terkontrol di mana sel dibudidayakan dalam kondisi terkontrol. Kondisi kultur sel bervariasi untuk setiap jenis sel. Secara umum, lingkungan kultur sel terdiri dari bejana yang sesuai (misalnya cawan Petri) dengan substrat atau media yang memasok nutrisi penting (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral), faktor pertumbuhan, hormon, dan gas (CO2, O2), dan mengatur lingkungan fisio-kimia (penyangga pH, tekanan osmotik, suhu). Sebagian besar sel membutuhkan permukaan atau substrat buatan, sementara kultur sel lainnya dapat dibudidayakan mengambang bebas dalam media kultur (kultur suspensi, suspensi sel).
Kultur massal garis sel hewan digunakan dalam produksi industri vaksin virus dan produk turunan bioteknologi lainnya. Sel punca manusia dikultur untuk memperluas jumlah sel dan membedakan sel menjadi berbagai jenis sel somatik untuk tujuan transplantasi.
Sampel Jaringan
Istilah jaringan menggambarkan perantara seluler, di mana bahan sel berada pada tingkat organisasi antara sel dan organ lengkap. Dalam jaringan, sel-sel serupa, dari asal yang sama yang bersama-sama menjalankan fungsi tertentu, dirakit. Dengan pengelompokan fungsional beberapa jaringan, struktur organ yang kompleks terbentuk.
Jaringan diambil sampelnya untuk penelitian di bidang biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokimia, imunohistokimia serta untuk membudidayakan dan mengekstrak DNA. Ini dapat dibedakan antara hewan (subdivisi: jaringan mamalia) dan jaringan tumbuhan. Jaringan hewan dikelompokkan menjadi empat jenis dasar jaringan ikat, otot, saraf, dan epitel. Jaringan tumbuhan dibagi lagi menjadi tiga sistem jaringan berikut: epidermis, jaringan tanah, dan jaringan pembuluh darah.
Sampel jaringan dapat dibuat dari bagian hewan atau tumbuhan, misalnya tulang, otot, daun, dll.
Cairan Tubuh
Darah, serum, plasma, cairan serebrospinal, air liur, dan cairan sinovial adalah cairan tubuh, yang menawarkan sumber informasi yang relevan secara diagnostik. Oleh karena itu, persiapan sampel cairan tubuh yang canggih untuk analisis adalah penting. Kesulitan pertama dikaitkan dengan rentang dinamis komponen yang luas yang ada dalam cairan tubuh.
Penentuan konsentrasi protein
Uji Bradford, uji Lowry, dan uji asam bikinkoninat (BCA) adalah uji umum untuk menentukan konsentrasi protein. Albumin serum sapi (BSA) adalah salah satu standar protein yang paling sering digunakan.
Penyangga lisis
Penyangga lisis harus dipilih sesuai dengan bahan sel atau jaringan (kultur jaringan, tanaman, bakteri, jamur, dll.), dan apakah sel berada dalam struktur dan jenis strukturnya. Berbagai macam buffer lisis untuk ekstraksi protein, membran, dan organel diformulasikan dengan satu atau lebih deterjen. Deterjen biasanya dipilih melalui uji coba-coba atau – jika tersedia – sesuai dengan protokol ekstraksi protein yang ada. Deterjen harus kompatibel dengan sumber jaringan dan protein. Secara umum, deterjen paling ringan yang bekerja untuk jaringan / protein tertentu, dipilih untuk mempertahankan fungsionalitas maksimum ekstrak. Selain itu, dalam hal ekstraksi membran dan organel, deterjen ringan menjaga membran tetap utuh. Deterjen yang umum digunakan dalam buffer lisis sebagian besar nonionik atau zwitterionik, misalnya CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, dan Tween 20.
Misalnya, jaringan seperti otak, hati, usus, ginjal, limpa dll dapat dengan mudah dibuffer dengan RIPA – namun penghambat protease dan DTT (misalnya untuk elektroforesis gel) harus disertakan.
Penyangga lisis untuk jaringan otot rangka (dingin es): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (dg/v) gliserol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol yang dilengkapi dengan protease dan koktail penghambat fosfatase
Tabel buffer umum dan kisaran pH-nya. Secara umum, buffer ini biasanya digunakan pada konsentrasi 20-50 mM.
| Buffer | Kisaran pH |
|---|---|
| Asam sitrat – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natrium sitrat – Asam sitrat | 3.0 – 6.2 |
| Natrium asetat – asam asetat | 3.6 – 5.6 |
| Garam natrium asam kakodilat – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natrium dihidrogen fosfat – dinatrium hidrogen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamine hidroklorida – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natrium tetraborat – asam borat | 7.6 – 9.2 |
| Bisina – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Sebagian besar buffer menunjukkan ketergantungan pH dengan suhu. Ini terutama berlaku untuk buffer Tris. pKa berubah dari 8,06 pada 25°C menjadi 8,85 pada 0°C.
(pH dan pKa buffer: pH mengukur konsentrasi ion hidrogen dalam larutan berair. pKa (= konstanta disosiasi asam) adalah ukuran yang terkait, tetapi lebih spesifik, karena membantu memprediksi bagaimana molekul akan bertindak pada nilai pH tertentu.)
PANDUAN
TRIzol adalah larutan kimia yang digunakan untuk mengekstrak RNA/DNA/protein selama ekstraksi guanidinium tiosianat-fenol-kloroform. Penggunaan ekstraksi TRIzol yang dibantu secara ultrasonik menghasilkan hasil DNA, RNA, dan protein yang tinggi dari sampel yang sama dan unggul dengan metode ekstraksi lainnya.
Literatur / Referensi
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.