Ekstraksi Protein Ultrasonik dari Jaringan dan Kultur Sel
- Ekstraksi protein merupakan tahap preparasi sampel yang penting dalam proteomika.
- Protein dapat diekstraksi dari jaringan tumbuhan dan hewan, khamir, serta mikroorganisme.
- Sonikasi merupakan metode ekstraksi protein yang andal dan efisien, menghasilkan rendemen protein yang tinggi dalam waktu ekstraksi yang singkat.
Ekstraksi Protein dari Jaringan dan Sel
Ekstraksi protein dari jaringan dan sel yang dikultur merupakan tahap preparasi sampel penting yang dilakukan dalam berbagai teknik biokimia dan analisis seperti ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometri massa, atau pemurnian protein. Disrupsi sel, lisis, dan ekstraksi ultrasonik merupakan teknik nontermal yang dapat dikontrol secara presisi untuk memastikan rendemen protein yang tinggi.
Ekstraksi protein dari sel dengan probe ultrasonik UP200St
- Cepat
- Rendemen tinggi
- Sangat efisien
- Kontrol parameter yang presisi
- Hasil yang dapat direproduksi
- Skalabilitas linear
Petunjuk Umum untuk Lisis dan Ekstraksi Protein Ultrasonik
- Kontrol suhu: Untuk memastikan rendemen protein yang tinggi tanpa denaturasi termal, suhu selama ekstraksi harus dikontrol. Homogenizer ultrasonik canggih dari Hielscher – juga disebut disintegrator ultrasonik atau ultrasonifier – dapat dikontrol secara presisi. Perangkat ini dilengkapi sensor suhu yang dapat dihubungkan. Suhu maksimum dapat ditetapkan melalui opsi pengaturan homogenizer ultrasonik. Ketika suhu maksimum ini tercapai, sonikator secara otomatis berhenti hingga sampel mendingin.
- Larutan penyangga: Pemilihan larutan penyangga yang sesuai dan volume larutan penyangga yang tepat berbeda untuk setiap jaringan dan harus ditentukan melalui pengujian coba-coba.
- Isolasi / pemurnian: Lisat protein dapat mengandung biomolekul berlebih seperti DNA atau karbohidrat, yang dapat dihilangkan melalui presipitasi protein (deoksikolat–asam trikloroasetat) atau pertukaran larutan penyangga.
Chittapalo dan Noomhorm (2009) melaporkan dalam penelitian mereka bahwa rendemen protein meningkat dengan penggunaan sonikasi dan bahwa proses homogenisasi serta lisis jaringan ultrasonik dapat meningkatkan proses ekstraksi yang ada secara signifikan – sehingga membuka peluang ekstraksi komersial baru.
CupHorn ultrasonik untuk preparasi beberapa sampel secara simultan dan sangat efektif dalam kondisi yang sama untuk isolasi protein dan fragmentasi DNA.
Ekstraksi Protein dari Jaringan Hewan
Untuk preparasi jaringan utuh (misalnya ginjal, jantung, paru-paru, otot, dll.), jaringan harus dipotong menjadi bagian-bagian yang sangat kecil menggunakan alat bersih, sebaiknya di atas es, dan secepat mungkin untuk mencegah degradasi oleh protease (misalnya larutan penyangga lisis seperti RIPA atau larutan penyangga lisis hipotonik yang mengandung campuran inhibitor protease dan fosfatase). Setelah dipotong, sampel direndam dalam nitrogen cair untuk pembekuan cepat. Sampel dapat disimpan pada -80°C untuk digunakan kemudian atau tetap diletakkan di atas es untuk segera dihomogenisasi. Tepat sebelum ekstraksi ultrasonik, larutan penyangga lisis sedingin es (dengan inhibitor protease DTT, leupeptin, dan aprotinin) segera ditambahkan ke dalam tabung sampel (untuk setiap ~10 mg jaringan, dianjurkan sekitar ~600 μL larutan penyangga). Dianjurkan sekitar 20–60mg jaringan per tabung sampel.
Homogenisasi, lisis, dan ekstraksi ultrasonik dilakukan menggunakan homogenizer ultrasonik seperti UP100H atau UP200Ht yang dilengkapi sonotrode berujung mikro. Durasi sonikasi adalah 60–90 detik dalam mode siklus ultrasonik dengan sonikasi selama 15 detik dan waktu jeda 10 detik. Sampel harus selalu dijaga dalam es.
Setelah homogenisasi / ekstraksi ultrasonik, lisat disentrifugasi pada 27.000g selama sekitar 20 menit. Selanjutnya, supernatan dikumpulkan agar konsentrasi protein dapat ditentukan melalui uji protein seperti uji protein BCA Pierce.
Ekstraksi Protein dari Serum Darah
Untuk memperoleh campuran serum dan larutan penyangga fosfat yang homogen, sampel terlebih dahulu dicampur menggunakan vorteks sebelum lisis sel ultrasonik. Untuk lisis ultrasonik, sampel disonikasi menggunakan homogenizer ultrasonik laboratorium seperti UP100H selama 8 siklus pada amplitudo 20%, dengan setiap siklus terdiri dari 5 detik aktif dan 15 detik nonaktif. Ekstraksi protein dilakukan dengan sonikasi bersiklus (mode pulsasi) dan dengan menempatkan sampel di atas es untuk menghindari pemanasan berlebih dan degradasi termal sampel. Karena serum mengandung sejumlah besar protein bermassa molekul tinggi (seperti albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G, dan imunoglobulin A), yang mengganggu pemisahan protein bermassa molekul rendah selama IEF, dianjurkan untuk mengurangi kandungan protein tersebut dari serum menggunakan kolom deplesi.
Ekstraksi Protein dari Jaringan Tumbuhan
Jaringan tumbuhan yang segar dan lunak, misalnya lumut, dll., dapat dengan mudah didisrupsi hanya dengan menempatkan bahan sampel yang telah dicincang dalam larutan penyangga lisis untuk sonikasi. Jaringan tumbuhan yang keras dan berkayu, seperti biji, daun jarum cemara, dll., harus digiling dalam keadaan kering. Beberapa bahan tumbuhan yang keras dan berkayu harus dibekukan dan digiling dalam nitrogen cair sebelum diekstraksi melalui sonikasi. Untuk suspensi kultur sel tumbuhan, perlakuan ultrasonik selama 30 hingga 150 detik dalam larutan penyangga lisis umumnya sudah cukup. Bahan yang lebih keras seperti biji labu memerlukan sonikasi yang lebih intensif seperti dijelaskan di bawah ini.
Protokol Ekstraksi Albumin Ultrasonik dari Biji Labu
Untuk ekstraksi protein albumin secara ultrasonik dari bubuk biji labu yang digiling halus, 10 g bubuk biji labu yang telah dihilangkan lemaknya dan 100 mL air deionisasi sebagai pelarut ditambahkan ke dalam gelas beker 250mL. Ekstraksi protein terdiri dari dua tahap: Pertama, sampel disonikasi menggunakan sonikator tipe probe UP400St (400W, 24kHz) yang dilengkapi sonotrode S24d7. Gelas beker ditempatkan dalam penangas air dingin selama homogenisasi ultrasonik. Sensor suhu yang dapat dihubungkan dan pengaturan kontrol suhu sonikator UP400St memastikan suhu sampel selalu dijaga di bawah 30°C. Kontrol suhu yang presisi selama sonikasi mencegah denaturasi albumin. Kedua, ekstraksi dilakukan menggunakan pengaduk pada kecepatan 200 rpm dan suhu 30°C. Selanjutnya, gelas beker dipindahkan ke alat pengocok termostatik. Globulin dihilangkan melalui dialisis dengan air suling. Setelah globulin dihilangkan, sampel ekstrak protein dapat diambil untuk menentukan profil albumin, kemudian disesuaikan hingga pI=3,0 menggunakan 0,1 M HCl untuk koagulasi albumin. Fase padat dipisahkan melalui sentrifugasi pada 5000g, 20°C dan dilarutkan kembali dalam air deionisasi. Koagulasi albumin dilakukan dua kali untuk meningkatkan rasio protein dalam konsentrat albumin.
Ekstraksi protein alkali ultrasonik untuk preparasi konsentrat protein dari dedak padi menunjukkan bahwa perlakuan ultrasonik menghasilkan rendemen protein yang lebih tinggi dalam waktu ekstraksi yang jauh lebih singkat – dibandingkan dengan metode ekstraksi konvensional.
Protokol Preparasi Sampel untuk Enzim iNOS Fungsional
Untuk memperoleh enzim iNOS yang berfungsi sepenuhnya (misalnya untuk skrining obat), protokol berikut dianjurkan: Suspensi sel harus ditempatkan di atas es dan disonikasi menggunakan UP100H pada amplitudo 10µm dalam mode siklus dengan sonikasi 5 detik dan jeda 25 detik di atas es. Prosedur ini harus diulang sekitar 3 kali. Waktu jeda di antara siklus sonikasi mengurangi kenaikan suhu sehingga mengurangi risiko denaturasi.
Solubilisasi Protein Ultrasonik
Sonikasi dapat mempercepat proses solubilisasi protein, yang biasanya memerlukan beberapa jam. Untuk menghindari pemanasan sampel yang berlebihan serta mencegah degradasi dan modifikasi protein dalam larutan yang mengandung urea, pulsa ultrasonik tidak boleh berlangsung lebih dari beberapa detik.
Sonikator UP200Ht dengan ujung mikro S26d2 2mm untuk sonikasi sampel kecil.
Peralatan Ultrasonik untuk Ekstraksi Protein
Hielscher Ultrasonics menawarkan beragam homogenizer ultrasonik untuk disintegrasi sel, jaringan, bakteri, mikroorganisme, khamir, dan spora.
Sonikator laboratorium Hielscher berdaya tinggi dan mudah dioperasikan. Dibuat untuk pengoperasian 24/7, perangkat ini dirancang sebagai perangkat laboratorium dan perangkat meja yang tangguh serta efisien. Pada semua perangkat, keluaran energi dan amplitudo dapat dikontrol secara presisi. Beragam aksesori membuka lebih banyak opsi konfigurasi. Sonikator digital seperti VialTweeter, UP200Ht, UP200St, dan UP400St memiliki kontrol suhu terintegrasi serta kartu SD bawaan untuk pencatatan data otomatis.
Untuk sonikasi beberapa sampel secara tidak langsung, bebas kontaminasi silang, dan simultan, kami menawarkan VialTweeter atau CupHorn ultrasonik.
Tabel di bawah memberikan gambaran umum tentang sonikator kami untuk preparasi sampel, disrupsi sel, dan ekstraksi. Klik jenis perangkat untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang setiap homogenizer ultrasonik. Staf teknis kami yang terlatih dan berpengalaman selama bertahun-tahun akan dengan senang hati membantu Anda memilih sonikator yang paling sesuai untuk preparasi sampel Anda!
| Volume Batch | Laju Alir | Perangkat yang Direkomendasikan |
|---|---|---|
| hingga 10 vial atau tabung | tidak berlaku | VialTweeter |
| pelat multisumur / mikrotiter | tidak berlaku | UIP400MTP |
| beberapa tabung / wadah | tidak berlaku | CupHorn |
| 1 hingga 500mL | 10 hingga 200mL/min | UP100H |
| 10 hingga 1000mL | 20 hingga 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 hingga 2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP400St |
Berdasarkan aplikasi, bahan, dan volume sampel Anda, kami akan merekomendasikan konfigurasi yang paling sesuai untuk preparasi sampel Anda. Hubungi kami hari ini!
Hubungi Kami! / Tanyakan kepada Kami!
Sonikator digital Hielscher dilengkapi kendali jarak jauh melalui peramban dan pencatatan data otomatis pada kartu SD terintegrasi.
VialTweeter untuk sonikasi tidak langsung.
Fakta yang Perlu Diketahui
Proteomika
Proteomika adalah bidang penelitian yang menyelidiki protein dan proteom. Protein menjalankan beragam fungsi vital dalam organisme. Proteom merupakan keseluruhan protein yang diekspresikan oleh suatu genom, sel, jaringan, atau organisme pada waktu tertentu. Proteom berubah seiring waktu dan berbagai kebutuhan atau tekanan yang dialami sel atau organisme. Secara lebih spesifik, proteom merupakan kumpulan protein yang diekspresikan dalam jenis sel atau organisme tertentu, pada waktu tertentu, dalam kondisi yang ditetapkan. Istilah ini merupakan gabungan kata protein dan genom. Proteomika adalah studi tentang proteom.
Protein
Protein merupakan biomolekul besar, yang disebut makromolekul – tersusun dari satu atau lebih rantai panjang residu asam amino. Protein terdapat pada semua organisme, baik tumbuhan maupun hewan, dan sangat penting bagi sebagian besar fungsi biologis. Karena protein mengandung banyak informasi biologis, protein diekstraksi untuk tujuan analisis, misalnya untuk penelitian proteomika. Fungsi terpenting yang dijalankan protein meliputi katalisis reaksi metabolisme, replikasi DNA, respons terhadap rangsangan, dan pengangkutan molekul dari satu lokasi ke lokasi lain. Protein berbeda satu sama lain terutama dalam urutan asam aminonya, yang ditentukan oleh urutan nukleotida gennya, dan yang biasanya menghasilkan pelipatan protein menjadi struktur tiga dimensi spesifik yang menentukan aktivitasnya. Protein – selain peptida – merupakan salah satu komponen utama pangan. Oleh karena itu, proteomika merupakan sarana yang andal dalam ilmu pangan untuk mengoptimalkan proses, keamanan pangan, dan penilaian gizi.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction merupakan prosedur praanalitik untuk memisahkan dan memekatkan analit terlebih dahulu. Jika dikombinasikan dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik kabut dapat diintensifkan sehingga prosesnya lebih efisien, lebih cepat, dan lebih ramah lingkungan. Dengan ultrasonikasi, ekstraksi titik kabut menjadi metode preparasi analit yang jauh lebih efisien. Baca lebih lanjut tentang ekstraksi titik kabut berbantuan ultrasonik!
Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel merupakan metode utama untuk pemisahan dan analisis makromolekul seperti DNA, RNA, dan protein beserta fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatannya. Metode ini digunakan dalam kimia klinis untuk memisahkan protein berdasarkan muatan dan/atau ukuran (IEF agarosa, pada dasarnya tidak bergantung pada ukuran), serta dalam biokimia, biologi molekuler, dan proteomika untuk memisahkan populasi campuran fragmen DNA dan RNA berdasarkan panjangnya, memperkirakan ukuran fragmen DNA dan RNA, atau memisahkan protein berdasarkan muatannya.
Kultur Sel
Kultur sel merupakan proses pertumbuhan terkontrol yang membudidayakan sel dalam kondisi terkendali. Kondisi kultur sel berbeda untuk setiap jenis sel. Secara umum, lingkungan kultur sel terdiri dari wadah yang sesuai (misalnya cawan Petri) dengan substrat atau medium yang menyediakan nutrien esensial (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral), faktor pertumbuhan, hormon, dan gas (CO2, O2), serta mengatur lingkungan fisikokimia (larutan penyangga pH, tekanan osmotik, suhu). Sebagian besar sel memerlukan permukaan atau substrat buatan, sedangkan kultur sel lainnya dapat ditumbuhkan dengan mengapung bebas dalam medium kultur (kultur suspensi, suspensi sel).
Kultur massal lini sel hewan digunakan dalam produksi industri vaksin virus dan produk lain yang dihasilkan melalui bioteknologi. Sel punca manusia dikultur untuk memperbanyak jumlah sel dan mendiferensiasikan sel menjadi berbagai jenis sel somatik untuk keperluan transplantasi.
Sampel Jaringan
Istilah jaringan menggambarkan tingkat perantara seluler, yaitu ketika materi sel berada pada tingkat organisasi antara sel dan organ utuh. Dalam jaringan, sel-sel sejenis dengan asal yang sama berkumpul untuk bersama-sama menjalankan fungsi tertentu. Pengelompokan fungsional beberapa jaringan membentuk struktur organ yang kompleks.
Sampel jaringan diambil untuk penelitian dalam biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokimia, imunohistokimia, serta untuk dikultur dan diekstraksi DNA-nya. Jaringan dapat dibedakan menjadi jaringan hewan (subbagian: jaringan mamalia) dan jaringan tumbuhan. Jaringan hewan dikelompokkan ke dalam empat jenis dasar, yaitu jaringan ikat, otot, saraf, dan epitel. Jaringan tumbuhan dibagi menjadi tiga sistem jaringan berikut: epidermis, jaringan dasar, dan jaringan pembuluh.
Sampel jaringan dapat disiapkan dari bagian hewan atau tumbuhan, misalnya tulang, otot, daun, dll.
Cairan Tubuh
Darah, serum, plasma, cairan serebrospinal, saliva, dan cairan sinovial merupakan cairan tubuh yang menjadi sumber kaya informasi yang relevan untuk diagnosis. Oleh karena itu, preparasi sampel cairan tubuh yang cermat untuk analisis sangat penting. Kesulitan pertama berkaitan dengan rentang dinamis komponen yang luas dalam cairan tubuh.
Penentuan konsentrasi protein
Uji Bradford, uji Lowry, dan uji asam bisinkoninat (BCA) merupakan uji yang umum digunakan untuk menentukan konsentrasi protein. Albumin serum sapi (BSA) merupakan salah satu standar protein yang paling sering digunakan.
Larutan Penyangga Lisis
Larutan penyangga lisis harus dipilih sesuai dengan bahan sel atau jaringan (kultur jaringan, tumbuhan, bakteri, fungi, dll.), serta apakah sel berada dalam suatu struktur dan jenis strukturnya. Berbagai larutan penyangga lisis untuk ekstraksi protein, membran, dan organel diformulasikan dengan satu atau lebih detergen. Detergen biasanya dipilih melalui pengujian coba-coba atau – jika tersedia – berdasarkan protokol ekstraksi protein yang sudah ada. Detergen harus kompatibel dengan sumber jaringan dan proteinnya. Secara umum, detergen paling lembut yang efektif untuk jaringan / protein tertentu dipilih untuk mempertahankan fungsionalitas ekstrak semaksimal mungkin. Selain itu, dalam ekstraksi membran dan organel, detergen yang lembut menjaga membran tetap utuh. Detergen yang umum digunakan dalam larutan penyangga lisis sebagian besar bersifat nonionik atau zwitterionik, misalnya CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40, dan Tween 20.
Sebagai contoh, jaringan seperti otak, hati, usus, ginjal, limpa, dll. cukup diberi larutan penyangga RIPA – namun inhibitor protease dan DTT (misalnya untuk elektroforesis gel) harus disertakan.
Larutan penyangga lisis untuk jaringan otot rangka (sedingin es): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) gliserol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol yang ditambah dengan campuran inhibitor protease dan fosfatase
Tabel larutan penyangga yang umum digunakan beserta rentang pH-nya. Secara umum, larutan penyangga ini biasanya digunakan pada konsentrasi 20–50 mM.
| Larutan penyangga | Rentang pH |
|---|---|
| Asam sitrat – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natrium sitrat – asam sitrat | 3,0 – 6,2 |
| Natrium asetat – asam asetat | 3,6 – 5,6 |
| Garam natrium asam kakodilat – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natrium dihidrogen fosfat – dinatrium hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamina hidroklorida – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Trisin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natrium tetraborat – asam borat | 7,6 – 9,2 |
| Bisin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glisin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Sebagian besar larutan penyangga menunjukkan ketergantungan pH pada suhu. Hal ini terutama berlaku untuk larutan penyangga Tris. pKa berubah dari 8,06 pada 25°C menjadi 8,85 pada 0°C.
(pH dan pKa larutan penyangga: pH mengukur konsentrasi ion hidrogen dalam larutan berair. pKa (= konstanta disosiasi asam) merupakan ukuran yang berkaitan, tetapi lebih spesifik, karena membantu memprediksi bagaimana suatu molekul akan berperilaku pada nilai pH tertentu.)
TRIzol
TRIzol merupakan larutan kimia yang digunakan untuk mengekstraksi RNA/DNA/protein selama ekstraksi guanidinium tiosianat–fenol–kloroform. Penggunaan ekstraksi TRIzol berbantuan ultrasonik menghasilkan rendemen DNA, RNA, dan protein yang tinggi dari sampel yang sama sehingga mengungguli metode ekstraksi lainnya.
Literatur/Referensi
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.