Teknologi ultrasound Hielscher

Ultrasonik Protein Ekstraksi dari Jaringan dan Sel Kultur

  • Ekstraksi protein merupakan langkah persiapan sampel penting dalam proteomik.
  • Protein dapat diekstrak dari tanaman dan jaringan binatang, ragi dan mikroorganisme.
  • Sonikasi adalah metode ekstraksi protein yang handal, efisien yang memberikan hasil protein yang tinggi dalam ekstraksi dengan waktu yang singkat.

 

Ekstraksi protein dari jaringan dan sel

Ekstraksi protein dari jaringan dankultur sel merupakan langkah persiapan sampel penting yang dilakukan selama banyak biokimia dan analitis teknik seperti ELISA, PAGE, Western Blotting, spektrometri massa, atau pemurnian protein. Ultrasonik sel gangguan, lysis dan ekstraksi adalah teknik yang tepat dapat dikontrol untuk memastikan tinggi menghasilkan protein.

Ekstraksi Protein dari Jaringan Binatang

Untuk persiapan jaringan berukuran keseluruhan (misalnya ginjal, jantung, paru-paru, otot dll.), Jaringan harus dibedah menjadi potongan yang sangat kecil dengan alat bersih, di atas es sebaiknya, dan secepat mungkin untuk mencegah degradasi oleh protease (mis. buffer lisis seperti buffer lisis RIPA atau hipotonik yang mengandung koktail inhibitor protease dan fosfatase). Setelah pembedahan, sampel direndam menjadi nitrogen cair untuk pembekuan seketika. Sampel dapat disimpan pada suhu -80 ° C untuk penggunaan selanjutnya atau digantikan es untuk homogenisasi segera. Segera sebelum ekstraksi ultrasonik, buffer lisis dingin dingin (dengan protease inhibitor DTT, leupeptin dan aprotinin) ditambahkan dengan cepat ke dalam tabung sampel (per ~ 10 mg kira-kira kira ~ 600 μL buffer direkomendasikan). Kira-kira. 20-60mg jaringan direkomendasikan per tabung sampel.
Ultrasonik homogenisasi, lysis dan ekstraksi dilakukan dengan ultrasonik homogenizer seperti UP200Ht atau UP200St, yang dilengkapi dengan sonotrode mikro-tip. Durasi sonication adalah 60-90 sec. pada metode ultrasonik siklus 15 sec. sonikasi dan 10 sec. waktu istirahat. Sampel harus disimpan dalam es sepanjang waktu.
Setelah ultrasonik homogenisasi / ekstraksi, lysate disentrifugasi di 27.000 g untuk kira-kira 20 menit setelah itu supernatent yang dikumpulkan, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan oleh sebuah assay protein seperti Pierce protein assay BCA.

Sonikasi protein adalah metode penting untuk preparasi sample

Ultrasonic protein ekstraksi dari sel dengan UP200St

Permintaan Informasi




Perhatikan Kebijakan pribadi.


Ekstraksi Protein dari Serum Darah

Untuk campuran homogen serum dan buffer fosfat, sampel adalah di vortexed terlebih dahulu sebelum Lisis sel ultrasonik. Untuk lysis ultrasonik, sampel disonikasi dengan ultrasonik homogenizer laboratorium seperti UP100H untuk 8 siklus di amplitudo 20%, untuk siklus setiap 5 detik di dan 15 detik pergi. Sonocation yang dilakukan oleh sonicationg dalam siklus dan menempatkan sampel es sehingga kerusakan thermal dan overheating sampel dihindari. Karena serum ini mengandung sejumlah besar berat molekul tinggi protein (seperti albumin, α1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, antibodi G dan antibodi A), yang mengganggu pemisahan berat molekul rendah protein selama IEF, dianjurkan untuk menguras mereka dari serum menggunakan kolom penipisan.

Ekstraksi Protein dari jaringan Tumbuhan

Segar, jaringan tanaman lunak, misalnya lumut dll, dapat dengan mudah terganggu dengan hanya menempatkan materi sampel cincang di buffer lisis untuk sonikasi. Tangguh, jaringan tanaman ligenous, seperti biji, cemara jarum dll, harus tanah kering. Beberapa keras, bahan tanaman berkayu harus dibekukan dan tanah dalam nitrogen cair sebelum diekstraksi dengan sonikasi. Untuk suspensi kultur sel tanaman, pengobatan ultrasonik antara 30 dan 150 detik dalam buffer lisis sebagian besar cukup. bahan lebih keras seperti biji labu memerlukan sonikasi lebih intens seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Protokol untuk Ultrasonik Ekstraksi Albumin dari Biji Labu

Ultrasonik homogeniser untuk jaringan UP400St dengan S24d40 - untuk ekstraksi protein dari tumbuhan dan hjaringan hewan (klik untuk memperbesar!)Untuk ekstraksi ultrasonik protein albumin dari bubuk biji labu, 10 g bubuk biji labu tanpa lemak dan 100 mL air yang deionized sebagai pelarut ditambahkan dalam beaker kaca 250mL. Ekstraksi protein terdiri dalam dua langkah: pertama, sampel sonikasi dengan probe-jenis ultrasonikator UP400St (400W, 24kHz) dengan mount sonotrode S24d7. Beaker gelas diletakkan dalam wadah air dingin selama homogenisasi ultrasonik. Pengaturan ultrasonikator UP400St dengan sensor suhu plugable memastikan bahwa suhu sampel selalu disimpan di bawah 30° C. Dengan suhu yang dapat dikendalikan selama sonikasi, denaturasi albumin dapat dihindari. Kedua, ekstraksi dilakukan dengan mixer pada kecepatan 200 rpm dan 30° C. Setelah itu beaker ditransfer ke dalam sebuah shaker thermostatic. Globulin dihapus melalui dialisis dengan air suling. Setelah penghapusan globulin, ekstrak protein dapat dicicipi untuk penentuan profil albumin dan kemudian disesuaikan pI = 3.0 menggunakan 0.1 M HCl untuk koagulasi albumin. Fase padat dipisahkan oleh sentrifugasi 5000 g, 20° C dan redissolved dalam ternyahion air. Koagulasi albumin dilakukan dua kali untuk meningkatkan rasio protein dalam konsentrat albumin.

Ultrasonik ekstraksi protein basa untuk persiapan konsentrat protein dari dedak padi menunjukkan bahwa hasil pengobatan ultrasonik dalam hasil protein yang lebih tinggi dalam waktu ekstraksi secara signifikan lebih pendek – dibandingkan dengan metode ekstraksi konvensional.

Ultrasonik perangkat VialTweeter untuk ekstraksi protein dari sampel jaringan (klik untuk memperbesar!)

VialTweeter untuk sonikasi langsung.

Keuntungan

  • Cepat
  • Hasil yang tinggi
  • Sangat efisien
  • Kontrol yang tepat atas parameter
  • Hasil yang dapat digandakan
  • Skalabilitas linear

protokol persiapan sampel untuk enzim iNOS fungsional

Untuk mendapatkan enzim iNOS berfungsi penuh (misalnya untuk skrining obat), protokol berikut dianjurkan: Suspensi sel harus ditempatkan di atas es dan sonicate dengan UP100H pada amplitudo 10ìm pada mode siklus 5 detik. sonikasi dan 25 detik. beristirahat di atas es. Prosedur ini harus diulang approx. 3 kali. Waktu beristirahat di antara siklus sonikasi mengurangi kenaikan suhu dan karena itu akan mengurangi risiko denaturasi.

Ultrasonic Protein Solubilisasi

Sonication dapat mempercepat proses pelarutan protein, yang biasanya membutuhkan beberapa jam. Agar tidak terlalu panas sampel dan mencegah degradasi protein dan modifikasi dalam larutan yang mengandung urea, semburan ultrasonik seharusnya tidak berlangsung lebih lama dari beberapa detik.

Petunjuk umum

Pengatur suhu: Untuk memastikan hasil protein tinggi tanpa denaturasi termal, suhu selama ekstraksi harus dikendalikan. state-of-art homogenizers ultrasonik Hielscher ini – juga disebut disintegrator ultrasonik atau sonificator – adalah justru dikontrol. Mereka datang dengan sensor suhu plugable. Dalam opsi pengaturan dari homogenizer ultrasonik, suhu maksimum dapat diatur. Ketika max suhu ini tercapai, Ultrasonikator secara otomatis berhenti sampai sampel sudah dingin.
Penyangga: Choise penyangga yang sesuai dan volume yang tepat buffer bervariasi dari jaringan ke jaringan dan harus pikir-out dengan tes trial-and-error.
Isolasi / pemurnian: lysates Protein dapat berisi kelebihan biomolekul seperti DNA atau karbohidrat, yang dapat dihilangkan dengan presipitasi protein (asam deoksikolat-trikloroasetat) atau buffer pertukaran.

Chittapalo dan Noomhorm (2009) melaporkan bahwa hasil protein meningkat menggunakan sonikasi dan bahwa homogenisasi jaringan dan lisis proses ultrasonik dapat meningkatkan proses ekstraksi yang ada secara signifikan – memungkinkan untuk peluang ekstraksi komersial baru.

Sound perlindungan dengan Hielscher's suara kandang SPB-L dan perangkat ultrasonik UP200St. (Klik untuk memperbesar!)

Ultrasonik homogeniser untuk jaringan UP200St untuk ekstraksi protein efisien

kontrol yang tepat dari pengobatan ultrasonik (Klik untuk memperbesar!)

kontrol Browser untuk operasi yang tepat dan pemantauan proses sonikasi

Peralatan ultrasonik untuk Ekstraksi Protein

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai homogenizers ultrasonik untuk disintegrasi sel, jaringan, bakteri, mikroorganisme, ragi, dan spora.
ultrasonicators lab Hielscher yang kuat dan mudah dioperasikan. Dibangun untuk 24/7 operasi, mereka dirancang sebagai laboratorium dan bangku-top perangkat yang kuat dan efisien. Untuk semua perangkat, output energi dan amplitudo dapat tepat dikontrol. The berbagai Aksesoris membuka opsi pengaturan lebih lanjut. Perangkat digital seperti VialTweeter, UP200Ht, UP200St, dan UP400St memiliki kontrol suhu terintegrasi dan built-in kartu SD untuk merekam data otomatis.
Untuk tidak langsung, cross-kontaminasi bebas dan sonikasi simultan dari beberapa sampel, kami menawarkan VialTweeter atau Ultrasonik CupHorn.
Tergantung pada aplikasi, materi, dan volume sampel Anda, kami akan merekomendasikan Anda setup yang paling cocok untuk persiapan sampel Anda. Hubungi kami hari ini!

Hubungi Kami! / Tanya Kami!

Silakan gunakan formulir di bawah ini, jika Anda ingin meminta informasi tambahan tentang ultrasonik homogenisasi. Kami akan sangat senang untuk menawarkan Anda sebuah sistem ultrasonik yang memenuhi persyaratan.









Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


Literatur / Referensi

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic dibantu ekstraksi alkali protein dari bekatul lemaknya dan sifat dari konsentrat protein. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Pemulihan Efisien protein dari beberapa sampel sumber setelah Trizol atau Trizol LS ekstraksi RNA dan penyimpanan jangka panjang. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Fakta-fakta yang Patut Diketahui

proteomik

Proteomik adalah bidang penelitian yang menyelidiki protein dan proteoma. Protein fullfil array yang luas dari fungsi-fungsi vital dalam organisme. proteome adalah seluruh set protein diungkapkan oleh genom, sel, jaringan, atau organisme pada waktu tertentu. proteome bervariasi dengan waktu dan berbeda persyaratan, atau tekanan, bahwa sebuah sel atau organisme mengalami. Lebih khusus lagi, adalah set protein diekspresikan dalam jenis tertentu dari sel atau organisme, pada waktu tertentu, di bawah kondisi yang ditetapkan. Istilah adalah campuran dari protein dan genom. Proteomik adalah studi tentang proteoma.

protein

Protein adalah yang biomolekul besar, yang disebut makromolekul – yang terdiri dari satu atau lebih rantai panjang residu asam amino. Protein hadir dalam semua organisme dari tumbuhan dan hewan dan sangat penting untuk sebagian besar fungsi biologisnya. Karena protein mengandung banyak informasi biologis, protein tersebut diekstraksi untuk tujuan analisis, misalnya untuk penelitian proteomik. Fungsi terpenting yang dilakukan oleh protein meliputi katalisis reaksi metabolik, replikasi DNA, respon terhadap rangsangan, dan pengangkutan molekul dari satu lokasi ke lokasi lainnya. Protein berbeda satu sama lain terutama dalam urutan asam amino mereka, yang didikte oleh urutan nukleotida gen mereka, dan yang biasanya menghasilkan protein yang dilipat menjadi struktur tiga dimensi spesifik yang menentukan aktivitasnya. Protein adalah – selain peptida – salah satu komponen kunci dari makanan. Oleh karena itu, proteomik adalah alat yang ampuh dalam ilmu makanan untuk mengoptimalkan proses, keamanan pangan dan penilaian gizi.

gel Elektroforesis

Gel elektroforesis adalah metode utama untuk pemisahan dan analisis makromolekul seperti DNA, RNA dan protein serta fragmen mereka, berdasarkan ukuran dan biaya mereka. Hal ini digunakan dalam kimia klinis untuk memisahkan protein dengan muatan dan / atau ukuran (IEF agarosa, pada dasarnya ukuran independen) dan biokimia, biologi molekuler dan proteomik untuk memisahkan populasi campuran fragmen DNA dan RNA oleh panjang, untuk memperkirakan ukuran DNA dan RNA fragmen atau untuk memisahkan protein oleh biaya.

Budaya sel

kultur sel adalah proses tumbuh dikendalikan oleh sel-sel yang dibudidayakan dalam kondisi yang terkendali. kondisi kultur sel bervariasi untuk setiap jenis sel. Secara umum, lingkungan kultur sel terdiri dari sebuah kapal yang cocok (misalnya cawan petri) dengan substrat atau media yang memasok nutrisi penting (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral), faktor pertumbuhan, hormon, dan gas (CO2, The2), Dan mengatur lingkungan fisio-kimia (pH penyangga, tekanan osmotik, suhu). Kebanyakan sel membutuhkan permukaan atau substrat buatan, sementara kultur sel lainnya dapat dibudidayakan mengambang bebas dalam medium kultur (budaya suspensi, suspensi sel).
budaya massa garis sel hewan yang digunakan dalam produksi industri vaksin virus dan produk biotechnologically berasal lainnya. sel induk manusia yang dibudidayakan untuk memperluas jumlah sel dan membedakan sel menjadi berbagai jenis sel somatik untuk tujuan transplantasi.

Sampel jaringan

Jaringan Istilah menggambarkan menengah selular, di mana materi sel pada tingkat organisasi antara sel-sel dan organ lengkap. Dalam jaringan, sel-sel yang sama, dari asal yang sama yang bersama-sama melaksanakan fungsi tertentu, dirakit. Dengan pengelompokan fungsional beberapa jaringan, struktur kompleks organ terbentuk.
Tissue sampel untuk penelitian dalam biologi, histologi / histopatologi, parasitologi, biokimia, imunohistokimia serta untuk menumbuhkan dan ekstrak DNA. Hal ini dapat dibedakan antara hewan (subdivisi: jaringan mamalia) dan jaringan tanaman. jaringan hewan dikelompokkan ke dalam empat jenis dasar ikat, otot, saraf, dan jaringan epitel. jaringan tanaman dibagi menjadi berikut tiga sistem jaringan: epidermis, jaringan dasar, dan jaringan pembuluh darah.
sampel jaringan dapat dibuat dari hewan atau tumbuhan bagian, misalnya tulang, otot, daun, dll

Cairan tubuh

Darah, serum, plasma, cairan serebrospinal, air liur dan cairan sinovial yang cairan tubuh, yang menawarkan sumber besar informasi diagnostik yang relevan. Oleh karena itu, persiapan canggih sampel cairan tubuh untuk analisis penting. Kesulitan pertama adalah terkait dengan rentang dinamis yang luas dari komponen hadir dalam cairan tubuh.

Penentuan konsentrasi protein

Bradford assay, uji Lowry dan asam bicinchoninic (BCA) assay adalah tes umum untuk menentukan konsentrasi protein. Bovine serum albumin (BSA) adalah salah satu standar protein yang paling sering digunakan.

lisis Buffer

Buffer lisis harus terpilih sesuai dengan materi sel atau jaringan (kultur jaringan, tanaman, bakteri, jamur, dll), dan apakah sel-sel dalam struktur dan jenis struktur. Berbagai lisis buffer untuk ekstraksi protein, membran, dan organel diformulasikan dengan satu atau lebih deterjen. deterjen biasanya dipilih melalui tes trial-and-error atau – jika tersedia – menurut sebuah protokol ekstraksi protein yang ada. deterjen harus kompatibel dengan sumber jaringan dan protein. Secara umum, deterjen paling ringan yang bekerja untuk jaringan / protein tertentu, yang dipilih untuk mempertahankan fungsi maksimal dari ekstrak. Selanjutnya, dalam kasus ekstraksi membran dan organel, deterjen ringan membuat membran utuh. deterjen yang biasa digunakan dalam buffer lisis sebagian besar nonionik atau zwiterionik, misalnya CHAPS, deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40, dan Tween 20.
Misalnya, jaringan seperti otak, hati, usus, ginjal, limpa dll dapat hanya buffered dengan RIPA – Namun protease inhibitor dan DTT (misalnya untuk elektroforesis gel) harus dimasukkan.
Buffer lisis untuk jaringan otot rangka (es dingin): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (b / v) gliserol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol dilengkapi dengan protease dan fosfatase inhibitor cocktail
Tabel buffer umum dan kisaran pH mereka. Secara umum, buffer ini biasanya digunakan pada konsentrasi 20-50 mM.

Penyangga kisaran pH
asam sitrun – Naoh 2,2 – 6,5
Natrium sitrat – asam sitrun 3,0 – 6,2
natrium asetat – asam asetat 3,6 – 5,6
Asam Cacodylic garam natrium – Hcl 5.0 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
Natrium dihidrogen fosfat – disodium hidrogen fosfat 5,8 – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
Mops – Koh 6,6 – 7,8
Triethanolamine hidroklorida – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Tricine – Naoh 7,6 – 8,6
sodium tetraborat – asam borat 7,6 – 9,2
Bicine – Naoh 7,7 – 8,9
Glycine – Naoh 8,6 – 10,6

Kebanyakan buffer menunjukkan pH-ketergantungan dengan suhu. Hal ini terutama berlaku untuk Tris buffer. PKa berubah dari 8,06 pada 25 ° C ke 8,85 pada 0 ° C.
(PH dan pKa dari buffer: pH mengukur konsentrasi ion hidrogen dalam larutan berair pKa (= konstanta disosiasi asam) adalah ukuran terkait, tapi lebih spesifik, dalam hal ini membantu untuk memprediksi bagaimana molekul akan bertindak pada tertentu. nilai pH.)

Trizol

Trizol adalah larutan kimia yang digunakan untuk mengekstrak RNA / DNA / protein selama ekstraksi guanidinium tiosianat-fenol-kloroform. Penggunaan hasil ekstraksi Trizol ultrasonically dibantu dalam DNA tinggi, RNA, dan hasil protein dari sampel yang sama dan unggul metode ekstraksi sehingga lainnya.