Ultrasonik Lysis untuk Western Blotting

• Western Blot adalah prosedur untuk deteksi tertentu protein dalam sampel jaringan yang homogen atau ekstraksi dari sel.
• Untuk menjalankan Western blot atau untuk mengukur aktivitas enzim, banyak tes memerlukan akses ke bahan (misalnya protein, DNA, fragmen subselular) yang terperangkap di dalam sel.
• Sonikasi adalah metode yang andal dan mudah ditangani untuk gangguan dan lisis sel terkontrol.

Ultrasonik untuk Cell Disruption

Ekstraksi protein dari jaringan dan sel kultur merupakan langkah awal untuk banyak teknik biologi, biokimia dan analisis (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometri massa, dll.) Atau pemurnian protein. Untuk mendapatkan hasil protein tinggi, bahan dan jaringan sel harus terganggu / lisis secara efisien. Entah jaringan sel tumbuhan atau hewan, sonikasi adalah metode untuk mempersiapkan sel lysate Anda dengan mudah dan cepat.

Keuntungan dari Sonikasi

• Cepat & efisien
• mudah dioperasikan
• hasil protein yang tinggi
• direproduksi / berulang
• kontrol yang tepat
• dapat diukur

Immunoprecipitation Protokol untuk Western Immunoblotting

A. Reagents

Untuk persiapan larutan, gunakan air bersih seperti Milli-Q.

• 1 X Fosfat Buffered Saline (PBS)
• 1 x sel Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Bakpuder, 1 mM/β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Penting: Tambahkan 1 mM PMSF segera sebelum menggunakan.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G cukup untuk IP, namun mungkin bergantung pada antibodi primer dan volume sampel Anda. Anda juga dapat menggunakan protein agar-agar / campuran pra-campuran (misalnya Protein A untuk IgG kelinci yang ditarik ke bawah dan Protein G untuk IgG tikus ditarik ke bawah)
• 3 x SDS sampel Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 pada 25° C), 6% w/v SDS, gliserol 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v bromophenol blue

B. Persiapan untuk Lisat Sel

• Panen sel. Untuk memanen sel di bawah kondisi tak menyenangkan, lepaskan media dan bilas sel sekali dengan PBS yang dingin.
• Keluarkan PBS dan tambahkan 0,5 ml buffer lisis sel 1X dingin ke setiap piring (10 cm) dan inkubasi piring di atas es selama 5 menit.
• Scrape sel dari piring dan transfer ke tabung microcentrifuge. Tetap di atas es.
• Sonikasi dua kali selama 10 detik di buffer imunopresipitasi es dingin (buffer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 dan campuran protease inhibitor). Untuk sonikasi, VialTweeter atau ultrasonicator probe seperti UP100H atau UP200Ht yang paling cocok.
• Centrifuge lisat di 15.000 g selama 10 menit pada 4° C.
• Transfer supernatan ke tabung baru. (Jika perlu, lisat dapat disimpan pada suhu -80 ° C.)
• Tambahkan antibodi primer ke supernatan. Supernatan dengan antibodi primer diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4 ° C dengan agitasi ringan. Antibodi primer biasanya ditambahkan dalam jumlah 10x lebih banyak pekat daripada yang digunakan untuk western blotting. (Anda bisa mulai dengan 1μg per 100μL.)
• Supernatant adalah kemudian diinkubasi lebih lanjut dengan campuran jumlah yang sama Protein A-agarose (Invitrogen) dan agarose Protein G untuk lain 1 h.
• Cuci pelet agarose tiga kali dengan IP buffer. Setelah itu, ekstrak protein yang terikat dengan SDS-PAGE loading buffer oleh pemanasan pada 95° C selama 5 menit.

C. Imunopresipitasi

• Ambil 200 μl cell lysate dan tambahkan antibodi primer. Inkubasi dengan goyang lembut semalaman pada suhu 4 ° C.
• Tambahkan protein A atau G agarose beads (20 μl bubur beads 50%). Inkubasi dengan goyang lembut selama 1-3 jam pada suhu 4 ° C.
• Microcentrifuge selama 30 detik pada suhu 4 ° C. Cuci pellet lima kali dengan 500 μl buffer lisis sel 1X. Diamkan di atas es saat mencuci.
• Resuspend pelet dengan buffer sampel 200 μl 3X SDS. Vortex, lalu microcentrifuge selama 30 detik.
• Panaskan sampel sampai 95-100 ° C selama 2-5 menit dan mikrocentrifuge selama 3 menit pada 14.000 X g.
• Muat sampel (15-30 μl) pada gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analisis sampel dengan Western blotting.

Analisis Blot Barat dengan Ultrasonikator UP50H

Berikut protokol yang digunakan dalam studi Kriebisch et al. (2011):
Jumlah protein diisolasi dari sel MC3T3-E1 diobati dengan 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) atau kendaraan. Sel-sel segaris dengan buffer yang mengandung 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% sodium dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dan 0,5% natrium deoksikolat (Merck). The lisat sel disonikasi selama 2 × 10 s pada siklus 1 dan amplitudo 80 dengan Prosesor ultrasonik UP50H (Hielscher, Teknologi Ultrasound, Teltow, Jerman). Setelah itu bahan disentrifugasi selama 10 menit pada 14.000 rpm dan supernatan digunakan untuk Western blotting. Dua puluh lima μg protein direbus dalam buffer sampel dan agen pereduksi (Invitrogen) dan kemudian dipisahkan oleh SDS-PAGE menggunakan gel poliakrilamida 4-12% (Invitrogen) dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (perawatan kesehatan GE). Membran diblokir selama 1 jam dengan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) yang mengandung 1% kasein (Sigma-Aldrich) dan 1% Tris (1 M). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi dengan sedikit agitasi semalam pada suhu 4 ° C dengan antibodi primer (anti-manusia CBS 1/500 kelinci, dikembangkan di laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, AS). Inkubasi dengan antibodi sekunder terserang lobak peroksidase (HPR) dilakukan selama 1 jam pada suhu kamar. Semua noda dikembangkan dengan penambahan chemiluminescence (Perkin Elmer).

Literatur/referensi