Ultrasonik Lysis untuk Western Blotting
- Western Blot adalah prosedur untuk deteksi tertentu protein dalam sampel jaringan yang homogen atau ekstraksi dari sel.
- Untuk menjalankan Western blot atau untuk mengukur aktivitas enzim, banyak tes memerlukan akses ke bahan (misalnya protein, DNA, fragmen subselular) yang terperangkap di dalam sel.
- Sonikasi adalah metode yang andal dan mudah ditangani untuk gangguan dan lisis sel terkontrol.
Ultrasonik untuk Cell Disruption
Ekstraksi protein dari jaringan dan sel kultur merupakan langkah awal untuk banyak teknik biologi, biokimia dan analisis (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometri massa, dll.) Atau pemurnian protein. Untuk mendapatkan hasil protein tinggi, bahan dan jaringan sel harus terganggu / lisis secara efisien. Entah jaringan sel tumbuhan atau hewan, sonikasi adalah metode untuk mempersiapkan sel lysate Anda dengan mudah dan cepat.
Keuntungan dari Sonikasi
- Cepat & efisien
- mudah dioperasikan
- hasil protein yang tinggi
- direproduksi / berulang
- kontrol yang tepat
- dapat diukur

Sonikator VialTweeter untuk persiapan sampel ultrasonik seperti gangguan sel dan isolasi protein
Immunoprecipitation Protokol untuk Western Immunoblotting
A. Reagents
Untuk persiapan larutan, gunakan air bersih seperti Milli-Q.
- 1 X Fosfat Buffered Saline (PBS)
- 1 x sel Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Bakpuder, 1 mM/β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
Penting: Tambahkan 1 mM PMSF segera sebelum menggunakan. - 15 μl Protein A + 15 μl Protein G cukup untuk IP, namun mungkin bergantung pada antibodi primer dan volume sampel Anda. Anda juga dapat menggunakan protein agar-agar / campuran pra-campuran (misalnya Protein A untuk IgG kelinci yang ditarik ke bawah dan Protein G untuk IgG tikus ditarik ke bawah)
- 3 x SDS sampel Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 pada 25° C), 6% w/v SDS, gliserol 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v bromophenol blue
B. Persiapan untuk Lisat Sel
- Panen sel. Untuk memanen sel di bawah kondisi tak menyenangkan, lepaskan media dan bilas sel sekali dengan PBS yang dingin.
- Keluarkan PBS dan tambahkan 0,5 ml buffer lisis sel 1X dingin ke setiap piring (10 cm) dan inkubasi piring di atas es selama 5 menit.
- Scrape sel dari piring dan transfer ke tabung microcentrifuge. Tetap di atas es.
- Sonikasi dua kali selama 10 detik di buffer imunopresipitasi es dingin (buffer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 dan campuran protease inhibitor). Untuk sonikasi, VialTweeter atau ultrasonicator probe seperti UP100H atau UP200Ht yang paling cocok.
- Centrifuge lisat di 15.000 g selama 10 menit pada 4° C.
- Transfer supernatan ke tabung baru. (Jika perlu, lisat dapat disimpan pada suhu -80 ° C.)
- Tambahkan antibodi primer ke supernatan. Supernatan dengan antibodi primer diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4 ° C dengan agitasi ringan. Antibodi primer biasanya ditambahkan dalam jumlah 10x lebih banyak pekat daripada yang digunakan untuk western blotting. (Anda bisa mulai dengan 1μg per 100μL.)
- Supernatant adalah kemudian diinkubasi lebih lanjut dengan campuran jumlah yang sama Protein A-agarose (Invitrogen) dan agarose Protein G untuk lain 1 h.
- Cuci pelet agarose tiga kali dengan IP buffer. Setelah itu, ekstrak protein yang terikat dengan SDS-PAGE loading buffer oleh pemanasan pada 95° C selama 5 menit.
C. Imunopresipitasi
- Ambil 200 μl cell lysate dan tambahkan antibodi primer. Inkubasi dengan goyang lembut semalaman pada suhu 4 ° C.
- Tambahkan protein A atau G agarose beads (20 μl bubur beads 50%). Inkubasi dengan goyang lembut selama 1-3 jam pada suhu 4 ° C.
- Microcentrifuge selama 30 detik pada suhu 4 ° C. Cuci pellet lima kali dengan 500 μl buffer lisis sel 1X. Diamkan di atas es saat mencuci.
- Resuspend pelet dengan buffer sampel 200 μl 3X SDS. Vortex, lalu microcentrifuge selama 30 detik.
- Panaskan sampel sampai 95-100 ° C selama 2-5 menit dan mikrocentrifuge selama 3 menit pada 14.000 X g.
- Muat sampel (15-30 μl) pada gel SDS-PAGE (12-15%).
- Analisis sampel dengan Western blotting.
Analisis Western Blot dengan Sonicator UP50H
Protokol berikut menggunakan sonicator tipe probe UP50H digunakan dalam studi Kriebisch et al. (2011):
Total protein diisolasi dari sel MC3T3-E1 yang diobati dengan 1,25 (OH)2D3 (10−8 M) atau kendaraan. Sel dilisis dengan buffer yang mengandung 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrium dodecyl sulfate (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dan 0,5% natrium deoksikolat (Merck). Lisat sel disonicated selama 2 × 10 detik pada siklus 1 dan amplitudo 80 dengan Prosesor Ultrasonik UP50H (Hielscher, Teknologi Ultrasound, Teltow, Jerman). Setelah itu bahan disentrifugasi selama 10 menit pada 14.000 rpm dan supernatan digunakan untuk Western blotting. Dua puluh lima μg protein direbus dalam buffer sampel dan zat pereduksi (Invitrogen) dan kemudian dipisahkan oleh SDS-PAGE menggunakan gel poliakrilamida 4-12% (Invitrogen) dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (perawatan kesehatan GE). Membran diblokir selama 1 jam dengan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) yang mengandung 1% kasein (Sigma-Aldrich) dan 1% Tris (1 M). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi dengan sedikit agitasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi primer (CBS 1/500 anti-manusia kelinci, dikembangkan di laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, AS). Inkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi lobak peroksidase (HPR) dilakukan selama 1 jam pada suhu kamar. Semua noda dikembangkan dengan peningkatan chemiluminescence (Perkin Elmer).
Klik di sini untuk membaca lebih lanjut tentang praktik terbaik untuk lisis dan ekstraksi sel ultrasonik, persiapan lisat, dan rekomendasi untuk perbaikan proses!
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonicator ukuran lab kami:
Direkomendasikan perangkat | Batch Volume | Flow Rate |
---|---|---|
UIP400MTP Sonicator Pelat 96-Sumur | Pelat multi-sumur / mikrotiter | n.a. |
Ultrasonik CupHorn | CupHorn untuk botol atau gelas kimia | n.a. |
GDmini2 | reaktor aliran mikro ultrasonik | n.a. |
VialTweeter | 0.5 untuk 1.5mL | n.a. |
UP100H | 1 hingga 500mL | 10-200mL/min |
UP200Ht, UP200St | 10 hingga 1000mL | 20 hingga 200mL / mnt |
UP400St | 10-2000mL | 20 hingga 400mL/min |
Pengocok Saringan Ultrasonik | n.a. | n.a. |
Hubungi Kami! / Tanya Kami!

UIP400MTP pelat sonicator untuk sonikasi throughput tinggi dari pelat 96 sumur
Tentang Western Blotting
Blot adalah prosedur analitik dimana DNA, RNA dan protein dipindahkan ke carrier sehingga bisa dipisahkan.
Southern digunakan untuk mendeteksi DNA, Northern blotuntuk RNA dan Western blot untuk protein.
Western blotting juga disebut protein immunoblotting karena antibodi digunakan untuk mendeteksi antigen secara spesifik. Western Blotting adalah salah satu metode analisis yang paling penting untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Dalam Western blot, protein diimobilisasi pada membran untuk mendeteksi mereka menggunakan antibodi monoklonal atau poliklonal.
Dengan protein asli SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dipisahkan oleh struktur 3-D atau protein yang didenaturasi dengan panjang polipeptida. Protein kemudian dipindahkan ke membran (biasanya nitroselulosa atau PVDF), di mana mereka diwarnai dengan antibodi yang spesifik untuk protein target. Langkah elektroforesis gel disertakan dalam analisis western blot untuk mengatasi masalah reaktivitas silang antibodi.
Setelah itu, protein-protein yang terpisah tersebut di-blotted ke matriks (kebanyakan pada membran nitroselulosa atau PVDF), di mana mereka diwarnai dengan antibodi. Antibodi berfungsi sebagai probe dan dipilih secara spesifik untuk protein target. Analisis lokasi dan intensitas reaksi spesifik menunjukkan rincian ekspresi protein target pada sampel yang diberikan. Western blotting dapat mendeteksi protein target yang serendah 1ng karena resolusi tinggi dari elektroforesis gel dan spesifisitas yang kuat dan sensitivitas immunoassay yang tinggi. Metode Western blot digunakan dalam biologi molekuler, biokimia, imunogenetika dan bidang penelitian molekuler lainnya.
Teknik terkait lainnya meliputi analisis dot blot, imunohistokimia dan imunositokimia dimana antibodi digunakan untuk mendeteksi protein dalam jaringan dan sel dengan immunostaining, dan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Literatur / Referensi
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

Sonikator VialTweeter untuk persiapan sampel simultan dari beberapa botol