Ultrasonik Lysis untuk Western Blotting

  • Western Blot adalah prosedur untuk deteksi tertentu protein dalam sampel jaringan yang homogen atau ekstraksi dari sel.
  • Untuk menjalankan Western blot atau untuk mengukur aktivitas enzim, banyak tes memerlukan akses ke bahan (misalnya protein, DNA, fragmen subselular) yang terperangkap di dalam sel.
  • Sonikasi adalah metode yang andal dan mudah ditangani untuk gangguan dan lisis sel terkontrol.

Ultrasonik untuk Cell Disruption

Ekstraksi protein dari jaringan dan sel kultur merupakan langkah awal untuk banyak teknik biologi, biokimia dan analisis (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometri massa, dll.) Atau pemurnian protein. Untuk mendapatkan hasil protein tinggi, bahan dan jaringan sel harus terganggu / lisis secara efisien. Entah jaringan sel tumbuhan atau hewan, sonikasi adalah metode untuk mempersiapkan sel lysate Anda dengan mudah dan cepat.

Keuntungan dari Sonikasi

  • Cepat & efisien
  • mudah dioperasikan
  • hasil protein yang tinggi
  • direproduksi / berulang
  • kontrol yang tepat
  • dapat diukur

Immunoprecipitation Protokol untuk Western Immunoblotting

A. Reagents

Untuk persiapan larutan, gunakan air bersih seperti Milli-Q.

  • 1 X Fosfat Buffered Saline (PBS)
  • 1 x sel Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Bakpuder, 1 mM/β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    Penting: Tambahkan 1 mM PMSF segera sebelum menggunakan.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G cukup untuk IP, namun mungkin bergantung pada antibodi primer dan volume sampel Anda. Anda juga dapat menggunakan protein agar-agar / campuran pra-campuran (misalnya Protein A untuk IgG kelinci yang ditarik ke bawah dan Protein G untuk IgG tikus ditarik ke bawah)
  • 3 x SDS sampel Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 pada 25° C), 6% w/v SDS, gliserol 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v bromophenol blue

B. Persiapan untuk Lisat Sel

  • Panen sel. Untuk memanen sel di bawah kondisi tak menyenangkan, lepaskan media dan bilas sel sekali dengan PBS yang dingin.
  • Keluarkan PBS dan tambahkan 0,5 ml buffer lisis sel 1X dingin ke setiap piring (10 cm) dan inkubasi piring di atas es selama 5 menit.
  • Scrape sel dari piring dan transfer ke tabung microcentrifuge. Tetap di atas es.
  • Sonikasi dua kali selama 10 detik di buffer imunopresipitasi es dingin (buffer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 dan campuran protease inhibitor). Untuk sonikasi, VialTweeter atau ultrasonicator probe seperti UP100H atau UP200Ht yang paling cocok.
  • Centrifuge lisat di 15.000 g selama 10 menit pada 4° C.
  • Transfer supernatan ke tabung baru. (Jika perlu, lisat dapat disimpan pada suhu -80 ° C.)
  • Tambahkan antibodi primer ke supernatan. Supernatan dengan antibodi primer diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4 ° C dengan agitasi ringan. Antibodi primer biasanya ditambahkan dalam jumlah 10x lebih banyak pekat daripada yang digunakan untuk western blotting. (Anda bisa mulai dengan 1μg per 100μL.)
  • Supernatant adalah kemudian diinkubasi lebih lanjut dengan campuran jumlah yang sama Protein A-agarose (Invitrogen) dan agarose Protein G untuk lain 1 h.
  • Cuci pelet agarose tiga kali dengan IP buffer. Setelah itu, ekstrak protein yang terikat dengan SDS-PAGE loading buffer oleh pemanasan pada 95° C selama 5 menit.

C. Imunopresipitasi

  • Ambil 200 μl cell lysate dan tambahkan antibodi primer. Inkubasi dengan goyang lembut semalaman pada suhu 4 ° C.
  • Tambahkan protein A atau G agarose beads (20 μl bubur beads 50%). Inkubasi dengan goyang lembut selama 1-3 jam pada suhu 4 ° C.
  • Microcentrifuge selama 30 detik pada suhu 4 ° C. Cuci pellet lima kali dengan 500 μl buffer lisis sel 1X. Diamkan di atas es saat mencuci.
  • Resuspend pelet dengan buffer sampel 200 μl 3X SDS. Vortex, lalu microcentrifuge selama 30 detik.
  • Panaskan sampel sampai 95-100 ° C selama 2-5 menit dan mikrocentrifuge selama 3 menit pada 14.000 X g.
  • Muat sampel (15-30 μl) pada gel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analisis sampel dengan Western blotting.

Hubungi kami / informasi lebih lanjut

Hubungi kami mengenai kebutuhan pengolahan Anda. Kami akan merekomendasikan parameter setup dan pengolahan yang paling cocok untuk proyek Anda.





Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


Protokol Sonikasi Lainnya

Analisis Blot Barat dengan Ultrasonikator UP50H

Berikut protokol yang digunakan dalam studi Kriebisch et al. (2011):
Jumlah protein diisolasi dari sel MC3T3-E1 diobati dengan 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) atau kendaraan. Sel-sel segaris dengan buffer yang mengandung 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% sodium dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dan 0,5% natrium deoksikolat (Merck). The lisat sel disonikasi selama 2 × 10 s pada siklus 1 dan amplitudo 80 dengan Prosesor ultrasonik UP50H (Hielscher, Teknologi Ultrasound, Teltow, Jerman). Setelah itu bahan disentrifugasi selama 10 menit pada 14.000 rpm dan supernatan digunakan untuk Western blotting. Dua puluh lima μg protein direbus dalam buffer sampel dan agen pereduksi (Invitrogen) dan kemudian dipisahkan oleh SDS-PAGE menggunakan gel poliakrilamida 4-12% (Invitrogen) dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (perawatan kesehatan GE). Membran diblokir selama 1 jam dengan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) yang mengandung 1% kasein (Sigma-Aldrich) dan 1% Tris (1 M). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi dengan sedikit agitasi semalam pada suhu 4 ° C dengan antibodi primer (anti-manusia CBS 1/500 kelinci, dikembangkan di laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, AS). Inkubasi dengan antibodi sekunder terserang lobak peroksidase (HPR) dilakukan selama 1 jam pada suhu kamar. Semua noda dikembangkan dengan penambahan chemiluminescence (Perkin Elmer).

Literatur / Referensi



Tentang Western Blotting

Blot adalah prosedur analitik dimana DNA, RNA dan protein dipindahkan ke carrier sehingga bisa dipisahkan.
Southern digunakan untuk mendeteksi DNA, Northern blotuntuk RNA dan Western blot untuk protein.
Western blotting juga disebut protein immunoblotting karena antibodi digunakan untuk mendeteksi antigen secara spesifik. Western Blotting adalah salah satu metode analisis yang paling penting untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Dalam Western blot, protein diimobilisasi pada membran untuk mendeteksi mereka menggunakan antibodi monoklonal atau poliklonal.
Dengan protein asli SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dipisahkan oleh struktur 3-D atau protein yang didenaturasi dengan panjang polipeptida. Protein kemudian dipindahkan ke membran (biasanya nitroselulosa atau PVDF), di mana mereka diwarnai dengan antibodi yang spesifik untuk protein target. Langkah elektroforesis gel disertakan dalam analisis western blot untuk mengatasi masalah reaktivitas silang antibodi.
Setelah itu, protein-protein yang terpisah tersebut di-blotted ke matriks (kebanyakan pada membran nitroselulosa atau PVDF), di mana mereka diwarnai dengan antibodi. Antibodi berfungsi sebagai probe dan dipilih secara spesifik untuk protein target. Analisis lokasi dan intensitas reaksi spesifik menunjukkan rincian ekspresi protein target pada sampel yang diberikan. Western blotting dapat mendeteksi protein target yang serendah 1ng karena resolusi tinggi dari elektroforesis gel dan spesifisitas yang kuat dan sensitivitas immunoassay yang tinggi. Metode Western blot digunakan dalam biologi molekuler, biokimia, imunogenetika dan bidang penelitian molekuler lainnya.
Teknik terkait lainnya meliputi analisis dot blot, imunohistokimia dan imunositokimia dimana antibodi digunakan untuk mendeteksi protein dalam jaringan dan sel dengan immunostaining, dan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter untuk persiapan sampel ultrasonik

Hubungi Kami! / Tanya Kami!





Harap dicatat bahwa Kebijakan pribadi.


Sonikasi merupakan langkah penting selama preparasi sample

UP200St dengan mikro-tip untuk sampel sonikasi