Lisis Ultrasonik untuk Western Blotting

• Western blot adalah prosedur analitis untuk mendeteksi protein spesifik dalam sampel homogenat jaringan atau ekstrak sel.
• Untuk melakukan Western blot atau mengukur aktivitas enzim, banyak uji memerlukan akses ke bahan (misalnya protein, DNA, fragmen subseluler) yang terperangkap di dalam sel.
• Sonikasi merupakan metode yang andal dan mudah digunakan untuk disrupsi sel dan lisis yang terkendali.

Disrupsi Sel Ultrasonik

Ekstraksi protein dari jaringan dan sel yang dikultur merupakan langkah pertama dalam banyak teknik biologi, biokimia, dan analitis (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometri massa, dll.) atau pemurnian protein. Untuk memperoleh rendemen protein yang tinggi, bahan sel dan jaringan harus didisrupsi/dilisis secara efisien. Baik untuk sel tumbuhan maupun jaringan hewan, sonikasi merupakan metode untuk menyiapkan lisat sel Anda dengan mudah dan cepat.

Keunggulan Sonikasi

• cepat & efisien
• pengoperasian mudah
• rendemen protein tinggi
• dapat direproduksi/diulang
• dikendalikan secara presisi
• dapat ditingkatkan skalanya

Protokol Imunopresipitasi untuk Western Immunoblotting

A. Reagen

Untuk menyiapkan larutan, gunakan air yang dimurnikan seperti Milli-Q.

• Larutan Salin Berpenyangga Fosfat (PBS) 1X
• Bufer Lisis Sel 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrium pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Penting: Tambahkan 1 mM PMSF tepat sebelum digunakan.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G cukup untuk IP, tetapi hal ini dapat bergantung pada antibodi primer dan volume sampel Anda. Anda juga dapat menggunakan agarosa protein A/G yang sudah dicampur sebelumnya (misalnya Protein A untuk penangkapan IgG kelinci dan Protein G untuk penangkapan IgG mencit)
• Bufer Sampel SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pada 25°C), 6% w/v SDS, 30% gliserol, 150 mM DTT, 0,03% w/v biru bromofenol

B. Preparasi Lisat Sel

• Panen sel. Untuk memanen sel dalam kondisi nondenaturasi, buang medium dan bilas sel satu kali dengan PBS sedingin es.
• Buang PBS dan tambahkan 0,5 ml bufer lisis sel 1X sedingin es ke setiap cawan (10 cm), lalu inkubasi cawan di atas es selama 5 menit.
• Kerok sel dari cawan dan pindahkan ke tabung mikrosentrifugasi. Pertahankan di atas es.
• Lakukan sonikasi dua kali, masing-masing selama 10 detik, dalam bufer imunopresipitasi sedingin es (bufer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 dan campuran inhibitor protease). Untuk sonikasi, VialTweeter atau ultrasonikator tipe probe seperti UP100H atau UP200Ht merupakan pilihan yang paling sesuai.
• Sentrifugasi lisat pada 15.000 g selama 10 menit pada 4°C.
• Pindahkan supernatan ke tabung baru. (Jika perlu, lisat dapat disimpan pada –80°C.)
• Tambahkan antibodi primer ke supernatan. Supernatan yang mengandung antibodi primer diinkubasi selama 1 h pada 4°C dengan agitasi ringan. Antibodi primer biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 10x lebih tinggi daripada yang digunakan untuk western blotting. (Anda dapat memulai dengan 1μg per 100μL.)
• Supernatan kemudian diinkubasi lebih lanjut dengan campuran Protein A-agarosa (Invitrogen) dan agarosa Protein G dalam jumlah yang sama selama 1 h lagi.
• Cuci pelet agarosa tiga kali dengan bufer IP. Setelah itu, ekstrak protein yang terikat dengan bufer pemuatan SDS-PAGE melalui pemanasan pada 95°C selama 5 menit.

C. Imunopresipitasi

• Ambil 200 μl lisat sel dan tambahkan antibodi primer. Inkubasi dengan penggoyangan perlahan semalaman pada 4°C.
• Tambahkan manik agarosa protein A atau G (20 μl suspensi manik 50%). Inkubasi dengan penggoyangan perlahan selama 1–3 jam pada 4°C.
• Lakukan mikrosentrifugasi selama 30 detik pada 4°C. Cuci pelet lima kali dengan 500 µl bufer lisis sel 1X. Pertahankan di atas es selama pencucian.
• Suspensikan kembali pelet dengan 20 μl bufer sampel SDS 3X. Campur menggunakan vorteks, lalu lakukan mikrosentrifugasi selama 30 detik.
• Panaskan sampel hingga 95–100°C selama 2–5 menit dan lakukan mikrosentrifugasi selama 1 menit pada 14.000 X g.
• Muat sampel (15–30 μl) pada gel SDS-PAGE (12–15%).
• Analisis sampel dengan Western blotting.

Analisis Western Blot dengan Sonikator UP50H

Protokol berikut yang menggunakan sonikator tipe probe UP50H digunakan dalam penelitian Kriebisch et al. (2011):
Protein total diisolasi dari sel MC3T3-E1 yang diberi perlakuan dengan 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) atau vehikulum. Sel dilisis dengan bufer yang mengandung 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrium dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dan 0,5% natrium deoksikolat (Merck). Lisat sel disonikasi selama 2 × 10 s pada siklus 1 dan amplitudo 80 dengan Prosesor Ultrasonik UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Jerman). Selanjutnya, bahan disentrifugasi selama 10 min pada 14.000 rpm dan supernatan digunakan untuk Western blotting. Dua puluh lima μg protein dididihkan dalam bufer sampel dan agen pereduksi (Invitrogen), kemudian dipisahkan dengan SDS-PAGE menggunakan gel poliakrilamida 4–12% (Invitrogen) dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (GE health care). Membran diblokir selama 1 h dengan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) yang mengandung 1% kasein (Sigma-Aldrich) dan 1% Tris (1 M). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi dengan agitasi ringan semalaman pada 4°C bersama antibodi primer (antibodi kelinci anti-CBS manusia 1/500, dikembangkan di laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, AS). Inkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak pedas (HPR) (Dako) dilakukan selama 1 h pada suhu ruang. Semua blot divisualisasikan dengan kemiluminesensi yang ditingkatkan (Perkin Elmer).
 

Klik di sini untuk membaca lebih lanjut tentang praktik terbaik lisis dan ekstraksi sel ultrasonik, preparasi lisat, serta rekomendasi untuk perbaikan proses!
 
Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator skala laboratorium kami:

Literatur / Referensi

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.