Alur Kerja Proteomik dengan Digesti Protein Berkapasitas Pemrosesan Tinggi

Proteomik merupakan bidang penting untuk memahami proses dan sistem biologis, dengan digesti protein sebagai tahap kritis dalam alur kerjanya. Secara tradisional, digesti protein dilakukan dalam larutan menggunakan enzim proteolitik seperti tripsin, yang secara spesifik menghidrolisis ikatan peptida pada residu lisin dan arginin. Proses ini menghasilkan peptida yang sesuai untuk ionisasi dan fragmentasi dalam aplikasi spektrometri massa (MS). Namun, metode digesti konvensional memerlukan 12–24 jam hingga selesai, sehingga menimbulkan hambatan yang signifikan dalam alur kerja proteomik.
Sonikasi ultrasonik menawarkan alternatif yang efektif, dengan memangkas waktu digesti secara drastis dari hitungan jam menjadi hanya beberapa menit. Jika dikombinasikan dengan sonikator multisampel canggih seperti Hielscher CupHorn, VialTweeter, dan sonikator pelat 96 sumur UIP400MTP, sonikasi ultrasonik memungkinkan proteomik yang lebih cepat dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi. Teknologi ini menyederhanakan alur kerja, mengurangi waktu preparasi sampel, dan meningkatkan efisiensi tanpa mengorbankan reproduktibilitas atau kualitas data.

Peran Energi Ultrasonik dalam Digesti Protein

Sonikasi ultrasonik menggunakan gelombang ultrasonik terfokus untuk menghasilkan kavitasi – gelembung mikro setempat yang runtuh dan menghasilkan gaya geser yang kuat. Fenomena ini meningkatkan perpindahan massa, mendorong pencampuran enzim dengan substrat, dan membuka lipatan struktur protein, sehingga situs pemotongan dapat diakses oleh enzim proteolitik seperti tripsin.
Hasilnya? Pengurangan waktu digesti yang signifikan tanpa mengorbankan efisiensi atau reproduktibilitas.

Digesti Proteolitik yang Ditingkatkan dengan Ultrasonik: Metodologi dan Hasil

Protokol Digesti yang Dipercepat

Digesti berbantuan ultrasonik mengombinasikan enzim proteolitik dan energi ultrasonik untuk mempercepat alur kerja. Sebagai contoh, dengan menggunakan Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), alur kerja digesti berlangsung sebagai berikut:

1. Reduksi: Sampel protein (0,5 mg/mL, 20 µL) diberi perlakuan dengan DTT (2 µL, 110 mM) dalam larutan penyangga amonium bikarbonat (12,5 mM). Sonikasi diterapkan pada amplitudo 50% selama 5 menit.
2. Alkilasi: Setelah penambahan IAA (2 µL, 400 mM), sonikasi diulangi dengan kondisi yang sama.
3. Digesti: Sampel diencerkan dan diinkubasi dengan nanopartikel yang mengandung tripsin terimobilisasi. Putaran sonikasi terakhir (5 menit) menyelesaikan digesti. Peptida dipisahkan, dikeringkan, dan disimpan untuk analisis MS.

Metode ultrasonik ini mengurangi waktu preparasi total dari 12 jam menjadi kurang dari 30 menit. Meskipun prosesnya dipercepat, hasil dan kualitas peptida tetap konsisten dengan metode tradisional yang berlangsung semalaman.

Efisiensi Digesti Protein Ultrasonik

Dalam studi perbandingan menggunakan proteom E. coli:

• Identifikasi Protein: Sampel yang didigesti secara ultrasonik menghasilkan identifikasi 777 protein dalam 5 menit, dibandingkan dengan 817 dalam 12 jam. Protein yang teridentifikasi oleh kedua metode melebihi 70%.
• Reproduktibilitas: Analisis replikasi menunjukkan nilai korelasi di atas 98% dalam masing-masing metode, yang menunjukkan keandalan.
• Selektivitas: Protein tertentu lebih mudah didigesti oleh masing-masing metode, dengan digesti ultrasonik lebih mendukung digesti 65 protein dan digesti semalaman 54 protein. Perbedaan yang halus ini menegaskan potensi unik sonikasi ultrasonik untuk aplikasi tertentu.

Hasil kuantifikasi protein tanpa label terhadap tujuh protein yang ditambahkan ke dalam sampel E. coli
. Protein berikut ditambahkan pada dua tingkat berbeda sebagaimana tercantum dalam kolom
bernama “Theo Ratio”. Theo Ratio adalah rasio teoretis antara dua tingkat yang digunakan dalam
eksperimen ini. Albumin serum sapi (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), kasein α-S1 (CASA1),
kasein α-S2 (CASA2), sitokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL), dan karbonat anhidrase 2
(CAH2). Rasio dihitung menggunakan intensitas protein LFQ yang diperoleh dari analisis MaxQuant
. Uji t Student diterapkan untuk membandingkan nilai yang diperoleh dengan masing-masing metode (p>0,01, n=3, t-teoretis=4,6).
Studi dan grafik: © Martins et al., 2019)

Tripsin yang Diimobilisasi pada Nanopartikel

Integrasi nanopartikel yang mengandung tripsin terimobilisasi (misalnya, T-FMNPs) dengan sonikasi ultrasonik semakin meningkatkan alur kerja proteomik. Nanopartikel ini menyediakan luas permukaan yang besar untuk interaksi enzim dengan substrat, sehingga meningkatkan efisiensi. Ketika diterapkan pada proteom kompleks, seperti E. coli, metode gabungan ini menghasilkan:

• Kecepatan: Digesti lengkap dalam 5 menit.
• Akurasi: Kuantifikasi protein yang sebanding dengan metode tradisional (p > 0,01, n=3).
• Skalabilitas: Adaptasi ke platform multisumur seperti UIP400MTP memungkinkan pemrosesan dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi.

Klik di sini untuk protokol terperinci dengan petunjuk langkah demi langkah!
(bandingkan Martins et al., 2019)

Digesti proteolitik dengan kecepatan tinggi dan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi menggunakan sonikator Hielscher

Model Sonikator Terbaik untuk Proteomik

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai model sonikator untuk preparasi beberapa sampel secara bersamaan yang mendukung alur kerja dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi. Baik Anda bekerja dengan vial, tabung reaksi, pelat multisumur (misalnya pelat 6, 24, atau 96 sumur), maupun cawan Petri – kami menawarkan sonikator yang ideal untuk eksperimen Anda.

Sonikator Pelat Multisumur UIP400MTP

Untuk kapasitas pemrosesan sampel maksimal, UIP400MTP menyediakan kemampuan untuk memproses pelat 96 sumur secara ultrasonik. Kompatibel dengan semua mikropelat standar, UIP400MTP tidak memerlukan bahan habis pakai khusus produsen tertentu yang mahal dan memberi Anda kebebasan untuk memilih pelat multisumur terbaik bagi penelitian Anda. Dengan menyalurkan energi secara merata ke seluruh pelat, alat ini memungkinkan reduksi, alkilasi, dan digesti hingga 200 proteom kompleks secara cepat hanya dalam 1 jam. Tingkat otomatisasi dan efisiensi ini sangat penting untuk proteomik dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi dan aplikasi klinis. Pelajari lebih lanjut tentang sonikator pelat multisumur!

VialTweeter

VialTweeter dirancang khusus untuk laboratorium yang memerlukan sonikasi hingga 10 vial atau tabung reaksi secara bersamaan. Pendekatannya yang noninvasif menghilangkan risiko kontaminasi silang sekaligus memastikan digesti protein yang dapat direproduksi. Perangkat ini ideal bagi peneliti yang bekerja dengan volume sampel terbatas atau beragam jenis sampel.
Pelajari lebih lanjut tentang sonikator multitabung VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikator CupHorn merupakan perangkat berdaya tinggi yang dirancang untuk memproses beberapa sampel secara bersamaan dalam wadah tertutup rapat. Alat ini memastikan distribusi energi ultrasonik yang merata dan pengendalian suhu yang presisi. Kemampuan untuk memproses hingga lima sampel secara bersamaan, ditambah kompatibilitasnya dengan alur kerja yang mencakup reduksi, alkilasi, dan digesti, menjadikan CupHorn alat yang andal untuk proteomik berbasis MS.
Pelajari lebih lanjut tentang CupHorn SonoReactor!

Protokol Langkah demi Langkah untuk Digesti Proteolitik Berbantuan Sonikasi Ultrasonik Menggunakan Tripsin yang Diimobilisasi pada Nanopartikel

Protokol dari Martins et al. (2019) ini dioptimalkan untuk digesti protein secara cepat menggunakan energi ultrasonik dan tripsin yang diimobilisasi pada nanopartikel (T-FMNPs). Langkah-langkah yang diuraikan memastikan reduksi, alkilasi, dan proteolisis yang efisien dan sesuai untuk aplikasi spektrometri massa (MS).
Langkah-Langkah Protokol

1. Reduksi Ikatan Disulfida
   • Tambahkan 2 µL larutan DTT (110 mM) ke dalam sampel protein 20 µL (0,5 mg/mL) dalam larutan penyangga AmBic.
   • Tempatkan tabung sampel dalam sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonikasi sampel selama 2,5 menit pada amplitudo 50% (200 W, 26 kHz).
   • Berikan jeda singkat untuk pendinginan, lalu sonikasi selama 2,5 menit lagi dengan kondisi yang sama.
2. Alkilasi Residu Sistein yang Telah Direduksi
   • Tambahkan 2 µL larutan IAA (400 mM) ke dalam sampel protein yang telah direduksi.
   • Sonikasi selama 2,5 menit pada amplitudo 50% untuk memfasilitasi alkilasi.
   • Berikan jeda untuk pendinginan, lalu sonikasi selama 2,5 menit lagi.

   Catatan: Minimalkan paparan cahaya pada sampel yang telah dialkilasi untuk mencegah degradasi IAA.

3. Pengenceran Sampel
   • Encerkan sampel protein yang telah dialkilasi hingga volume akhir 100 µL menggunakan larutan penyangga AmBic 25 mM yang mengandung asetonitril 4% (v/v).
   • Campurkan hingga merata dengan pemipetan secara perlahan.
4. Digesti Proteolitik dengan Tripsin yang Diimobilisasi pada Nanopartikel
   • Tambahkan 20 µL larutan T-FMNP (3 mg/mL) ke dalam sampel protein yang telah diencerkan.
   • Sonikasi campuran dalam sonoreaktor selama 2,5 menit pada amplitudo 50%.
   • Berikan jeda untuk pendinginan, lalu sonikasi selama 2,5 menit lagi dengan kondisi yang sama.
5. Pemisahan Nanopartikel yang Mengandung Tripsin
   • Gunakan magnet untuk memisahkan T-FMNPs dari supernatan yang mengandung peptida hasil digesti.
   • Pindahkan supernatan ke tabung mikrosentrifugasi baru.
6. Preparasi Peptida untuk Analisis MS
   • Keringkan supernatan yang mengandung peptida dalam sentrifus vakum.
   • Simpan peptida yang telah dikeringkan pada -20°C hingga analisis lebih lanjut dengan spektrometri massa.