Alur Kerja Proteomik dengan Pencernaan Protein Throughput Tinggi

Proteomik adalah bidang penting untuk memahami proses dan sistem biologis, dengan pencernaan protein membentuk langkah penting dalam alur kerjanya. Secara tradisional, pencernaan protein dilakukan dalam larutan menggunakan enzim proteolitik seperti tripsin, yang secara khusus menghidrolisis ikatan peptida pada residu lisin dan arginin. Proses ini menghasilkan peptida yang sangat cocok untuk ionisasi dan fragmentasi dalam aplikasi spektrometri massa (MS). Namun, metode pencernaan konvensional membutuhkan 12–24 jam untuk mencapai penyelesaian, menciptakan kemacetan yang signifikan dalam alur kerja proteomik.
Ultrasonikasi menawarkan alternatif yang kuat, secara dramatis mempersingkat waktu pencernaan dari jam menjadi hanya beberapa menit. Ketika dikombinasikan dengan sonicator multi-sampel canggih seperti Hielscher CupHorn, VialTweeter, dan UIP400MTP sonicator pelat 96-sumur, ultrasonication memungkinkan proteomik throughput tinggi yang dipercepat. Teknologi ini menyederhanakan alur kerja, mengurangi waktu persiapan sampel, dan meningkatkan efisiensi tanpa mengorbankan reproduktifitas atau kualitas data.

Peran Energi Ultrasonik dalam Pencernaan Protein

Ultrasonikasi menggunakan gelombang ultrasound terfokus untuk menciptakan kavitasi - gelembung mikro lokal yang runtuh untuk menghasilkan gaya geser yang kuat. Fenomena ini meningkatkan perpindahan massa, mendorong pencampuran enzim dengan substrat, dan membuka struktur protein, mengekspos situs pembelahan ke enzim proteolitik seperti tripsin.
Hasilnya? Pengurangan waktu pencernaan yang signifikan tanpa mengorbankan efisiensi atau reproduktifitas.

Pencernaan Proteolitik yang Ditingkatkan Ultrasonik: Metodologi dan Hasil

Protokol Pencernaan yang Dipercepat

Pencernaan berbantuan ultrasonik menggabungkan enzim proteolitik dan energi ultrasonik untuk mempercepat alur kerja. Misalnya, menggunakan Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), alur kerja pencernaan berlangsung sebagai berikut:

1. Reduksi: Sampel protein (0,5 mg/mL, 20 μL) diolah dengan DTT (2 μL, 110 mM) dalam buffer amonium bikarbonat (12,5 mM). Sonikasi diterapkan pada amplitudo 50% selama 5 menit.
2. Alkilasi: Setelah menambahkan IAA (2 μL, 400 mM), sonikasi diulang dalam kondisi yang sama.
3. Pencernaan: Sampel diencerkan dan diinkubasi dengan nanopartikel tripsin yang tidak bergerak. Putaran terakhir sonikasi (5 menit) menyelesaikan pencernaan. Peptida dipisahkan, dikeringkan, dan disimpan untuk analisis MS.

Metode ultrasonik ini mengurangi total waktu persiapan dari 12 jam menjadi di bawah 30 menit. Terlepas dari proses yang dipercepat, hasil dan kualitas peptida tetap konsisten dengan metode semalam tradisional.

Efisiensi Pencernaan Protein Ultrasonik

Dalam studi komparatif menggunakan proteom E.:

• Identifikasi Protein: Sampel yang dicerna secara ultrasonik mengidentifikasi 777 protein dalam 5 menit, dibandingkan dengan 817 dalam 12 jam. Identifikasi protein bersama melebihi 70%.
• Reproduksibilitas: Analisis replikasi menunjukkan nilai korelasi di atas 98% dalam setiap metode, menunjukkan keandalan.
• Selektivitas: Protein tertentu dicerna secara istimewa dengan setiap metode, dengan pencernaan ultrasonik mendukung 65 protein dan pencernaan semalam 54 protein. Perbedaan bernuansa seperti itu menggarisbawahi potensi unik ultrasonikasi untuk aplikasi tertentu.

Hasil kuantifikasi protein bebas label dari tujuh protein berduri ke dalam E.
contoh. Protein berikut ditambahkan pada dua tingkat yang berbeda seperti yang tercantum dalam kolom
dinamai sebagai "Theo Ratio". Theo Ratio adalah rasio teoritis antara dua level yang digunakan dalam ini
percobaan. Albumin serum sapi (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), kasein α-S1 (CASA1),
Kasein α-S2 (CASA2), sitokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) dan karbonat anhidrase 2
(CAH2). Rasio dihitung menggunakan intensitas protein LFQ yang diperoleh dari MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studi dan grafik: © Martins et al., 2019)

Tripsin yang Tidak Bergerak Nanopartikel

Integrasi nanopartikel tripsin yang tidak bergerak (misalnya, T-FMNP) dengan ultrasonikasi semakin meningkatkan alur kerja proteomik. Nanopartikel ini menyediakan luas permukaan yang tinggi untuk interaksi enzim-substrat, meningkatkan efisiensi. Ketika diterapkan pada proteom kompleks, seperti E., metode gabungan mencapai:

• Kecepatan: Selesaikan pencernaan dalam waktu 5 menit.
• Ketepatan: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalabilitas: Adaptasi ke platform multi-sumur seperti UIP400MTP memungkinkan pemrosesan throughput tinggi.

Klik di sini untuk protokol terperinci dengan petunjuk langkah demi langkah!
(lih. Martins et al., 2019)

Pencernaan proteolitik pada kecepatan tinggi dan throughput tinggi dengan sonicators Hielscher

Model Sonicator Terbaik untuk Proteomik

Hielscher Ultrasonics menawarkan berbagai model sonicator untuk preparasi multi-sampel simultan yang memfasilitasi alur kerja throughput tinggi. Baik Anda bekerja dengan botol, tabung reaksi, pelat multi-sumur (misalnya pelat 6, 24, 96 sumur) atau cawan Petri – Kami menawarkan sonicator yang ideal untuk eksperimen Anda.

UIP400MTP sonicator pelat multi-sumur

Untuk throughput terbaik, UIP400MTP menyediakan kemampuan untuk memproses pelat 96 sumur secara ultrasonik. Kompatibel dengan pelat mikro standar apa pun, UIP400MTP ini tidak memerlukan sekali pakai yang mahal dan memberi Anda kebebasan untuk memilih pelat multi-sumur terbaik untuk penelitian Anda. Dengan memberikan energi yang seragam di seluruh pelat, ini memungkinkan reduksi, alkilasi, dan pencernaan cepat hingga 200 proteom kompleks hanya dalam 1 jam. Tingkat otomatisasi dan efisiensi ini sangat penting untuk proteomik throughput tinggi dan aplikasi klinis. Pelajari lebih lanjut tentang sonicator pelat multi-sumur!

VialTweeter

VialTweeter disesuaikan untuk laboratorium yang membutuhkan sonikasi simultan hingga 10 botol atau tabung reaksi. Pendekatan non-invasifnya menghilangkan risiko kontaminasi silang sekaligus memastikan pencernaan protein yang dapat direproduksi. Perangkat ini sangat ideal untuk peneliti yang bekerja dengan volume sampel terbatas atau jenis sampel yang beragam.
Pelajari lebih lanjut tentang sonicator multi-tabung VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonicator CupHorn adalah perangkat kuat yang dirancang untuk pemrosesan simultan beberapa sampel dalam wadah tertutup. Ini memastikan distribusi energi ultrasonik yang seragam dan kontrol suhu yang tepat. Kemampuan untuk memproses hingga lima sampel secara bersamaan, ditambah dengan kompatibilitasnya dengan alur kerja yang dikurangi, dialkilasi, dan dicerna, menjadikan CupHorn alat yang andal untuk proteomik berbasis MS.
Pelajari lebih lanjut tentang CupHorn SonoReactor!

Protokol Langkah demi Langkah untuk Pencernaan Proteolitik Berbantuan Ultrasonikasi Menggunakan Tripsin Imimobilisasi Nanopartikel

Protokol ini oleh Martins et al. (2019) dioptimalkan untuk pencernaan protein yang cepat menggunakan energi ultrasonik dan tripsin yang diimobilisasi partikel nano (T-FMNPs). Langkah-langkah yang diuraikan memastikan reduksi, alkilasi, dan proteolisis yang efisien yang cocok untuk aplikasi spektrometri massa (MS).
Langkah Protokol

1. Pengurangan Ikatan Disulfida
   • Tambahkan 2 μL larutan DTT (110 mM) ke sampel protein 20 μL (0.5 mg/mL) dalam buffer AmBic.
   • Tempatkan tabung sampel di sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonicasi sampel selama 2,5 menit pada amplitudo 50% (200 W, 26 kHz).
   • Jeda sebentar untuk memungkinkan pendinginan, lalu sonikasi selama 2.5 menit lagi dalam kondisi yang sama.
2. Alkilasi residu sistein yang tereduksi
   • Tambahkan 2 μL larutan IAA (400 mM) ke sampel protein yang direduksi.
   • Sonicate selama 2,5 menit pada amplitudo 50% untuk memfasilitasi alkilasi.
   • Jeda untuk pendinginan, lalu sonikasi selama 2,5 menit lagi.

   Catatan: Minimalkan paparan sampel alkilasi terhadap cahaya untuk mencegah degradasi IAA.

3. Pengenceran Sampel
   • Encerkan sampel protein alkilasi hingga volume akhir 100 μL menggunakan buffer AmBic 25 mM yang mengandung 4% asetonitril (v/v).
   • Aduk rata dengan pemipetan lembut.
4. Pencernaan Proteolitik dengan Tripsin Tak Bergerak Nanopartikel
   • Tambahkan 20 μL larutan T-FMNP (3 mg/mL) ke sampel protein encer.
   • Sonicasi campuran dalam sonoreaktor selama 2,5 menit pada amplitudo 50%.
   • Jeda untuk pendinginan, lalu sonikasi selama 2,5 menit lagi dalam kondisi yang sama.
5. Pemisahan Nanopartikel Tripsin
   • Gunakan magnet untuk memisahkan T-FMNP dari supernatan yang mengandung peptida yang dicerna.
   • Pindahkan supernatan ke tabung mikrosentrifugal baru.
6. Persiapan Peptida untuk Analisis MS
   • Keringkan supernatan yang mengandung peptida dalam centrifuge vakum.
   • Simpan peptida kering pada suhu -20°C sampai analisis lebih lanjut dengan spektrometri massa.