Nagy tisztaságú schizophyllan béta-glükánok ultrahangos előállítása

A schizophyllan immunmoduláló tulajdonságokkal rendelkező, gombaeredetű β-glükán. Az erőteljes gyógyhatás érdekében a schizophyllannak kis molekulatömegűnek kell lennie, hogy jobb biológiai hozzáférhetőséget mutasson. Az ultrahangos kezelés bizonyítottan csökkenti a schizophyllan molekulatömegét. Megbízható és hatékony módszerként az ultrahangos kezelés könnyen alkalmazható kis molekulatömegű schizophyllan előállítására.

Schizophyllum gombák és ultrahangos béta-glükán-extrakció

A Schizophyllum gombafajok a természetben korhadó fákon nőnek az esős évszakok után. A termőtesteket az ezt követő száraz évszakban gyűjtik be. A Schizophyllum fajok biokémiai vegyületekben, például glükánokban gazdagok, ezért különösen a trópusi országokban élelmiszerként és gyógyszerként fogyasztják őket. Immunmoduláló, gombaellenes, daganatellenes és vírusellenes tulajdonságai miatt a Schizophyllum commune, más néven hasadtlemezű gomba, felkeltette a biotechnológiai és gyógyszeripari vállalatok érdeklődését.
A schizophyllan poliszacharid, más néven sizofiran, sonifilan vagy sizofilan, a Schizophyllum gombákban található fő β-glükán; ezek a gombák a rendkívül hatékony, bioaktív schizophyllan β-glükánt biztosítják.
A Schizophyllum commune gombák a természetben fákon nőnek, a micélium fermentációs tápközegben is tenyészthető. Gyógyszerészeti és kozmetikai alkalmazásokban a kis molekulatömegű schizophyllan sokkal hatékonyabb, mint a nagy molekulatömegű schizophyllan. Ennek oka, hogy a kis molekulatömegű schizophyllan biológiai hozzáférhetősége és felszívódási aránya jelentősen jobb. Ezenkívül a nagy molekulatömegű schizophyllan alkalmazása gyakran problémás, mivel vizes oldatainak viszkozitása nagy.
Az ultrahangos méretcsökkentés rendkívül hatékony és megbízható eljárás a schizophyllan molekulatömegének csökkentésére, ezáltal javítva a β-glükán-molekula minőségét.

A kis molekulatömegű schizophyllan előállításának protokollja

Mivel a molekulatömegű schizophyllan lényegesen jobb biológiai hozzáférhetőséget és alkalmazási tulajdonságokat mutat, Smirnou kutatócsoportja megvizsgálta az ultrahangos kezelés alkalmazását a schizophyllan β-glükán-molekula hasítására és méretének csökkentésére.

A schizophyllan ultrahangos kezelése

A β-1.3(1.6)-glükán schizophyllant (SPG) az S. commune gomba bioreaktorban történő szubmerz tenyésztésével állították elő, szacharózt használva szubsztrátként.
A tenyésztés befejezése után a tenyészlevet ionmentesített vízzel 2 g/L schizophyllankoncentrációra hígították, és ultrahangos kezelésnek vetették alá a UIP2000hdT ultrahangos processzorral (Hielscher Ultrasonics GmbH, Németország), recirkulációs üzemmódban, a következő paraméterek és körülmények mellett: a közeg térfogatárama 50 mL/s, frekvencia 20 kHz, kimeneti teljesítmény 2000 W, szonotródatípus BS2d22, amplitúdóerősítő típusa B2-1.4 és amplitúdó 100%. A tenyészlé hőmérséklete az ultrahangos kezelés kezdetén 25°C volt. Az ultrahanggal kezelt tenyészlevet (fajlagos energiabevitel 100 Ws/mL) Seitz HS800 mélységi szűrőn szűrték át 1,5 bar nyomáson, 40°C-on. A kémiai jellemzéshez az ultrahanggal kezelt schizophyllant (uSPG) a szűrletből háromszoros mennyiségű izopropil-alkohollal csapták ki laboratóriumi hőmérsékleten, majd 60°C-on szárították 12h időtartamig. Az immunológiai vizsgálatokhoz az uSPG-oldatokat a következőképpen készítették elő: (1) az ultrahanggal kezelt tenyészlé szűrletét 0,1m2 felületű Pall Centramate T-series PES kazettán (100 kDa elválasztási határ) diafiltrálták 0,8 bar nyomáson, és a diafiltrációt addig folytatták, amíg a retentátum vezetőképessége 20 μS/cm lett; (2) az oldatot diafiltrációval 1 g/L uSPG-koncentrációra töményítették, majd 120°C/20 min körülmények között autoklávozással sterilizálták. A denaturált uSPG-t hasonló módon készítették elő, azzal a különbséggel, hogy a tenyészlé szűrletéhez 0,2 M koncentrációban NaOH-ot adtak, és a lúgosított oldatot a diafiltráció előtt 30 min időtartamig laboratóriumi hőmérsékleten inkubálták.

Analitikai módszerek

A micéliumhozamot gravimetriásan becsülték meg: a tenyészlevet vízzel 1:4 arányban hígították, 10 000 × g mellett, 25°C-on, 20 min időtartamig centrifugálták, a csapadékot háromszoros mennyiségű vízzel mosták, 60°C-on szárították, majd megmérték a tömegét. A schizophyllant a felülúszóból háromszoros mennyiségű izopropil-alkohollal csapták ki, 60°C-on szárították 24h időtartamig, és a hozamát gravimetriásan határozták meg. A tenyészlé pO2-értékét Hamilton-Visiferm DO 120 optikai szondával (Hamilton, Svájc) mérték.
A tenyészlé dinamikus viszkozitását HAAKE Visco Tester 6L készüléken mérték 1L és 2L mérőorsókkal, 4°C-on, 30 rpm fordulatszámon. A szűrési sebességet 500 mL tenyészlé 200 × 200 mm méretű Seitz HS800 (Pall, USA) mélységi szűrőn, 1,5 bar nyomáson és 40°C-on történő szűrésének idejéből számították ki.
Az uSPG molekulatömegét SEC-MALLS módszerrel mérték Alliance (Waters) HPLC-rendszeren, sorba kapcsolt PL aquagel OH60 és PL aquagel OH40 oszlopokkal, a miniDAWN TREOS (Wyatt) detektort pedig diafiltrációval 1 g/L uSPG-koncentrációra töményítették, és 120°C/20 min körülmények között autoklávozással sterilizálták. A denaturált uSPG-t hasonló módon készítették elő, azzal a különbséggel, hogy a tenyészlé szűrletéhez 0,2 M koncentrációban NaOH-ot adtak, és a lúgosított oldatot a diafiltráció előtt 30 min időtartamig laboratóriumi hőmérsékleten inkubálták.

Eredmények:
Az ultrahangos kezelést közvetlenül a micéliumot tartalmazó, 144-h tenyésztésből származó S. commune tenyészlére alkalmazták az SPG további feldolgozásának megkönnyítésére.
 
Az ultrahanggal kezelt schizophyllan jellemzői: Az ultrahanggal kezelt schizophyllant (uSPG) alkohollal csapták ki a tenyészlé szűrletéből, és jellemezték. A SEC-MALLS az uSPG Mw-értékét körülbelül 1 MDa-ra becsülte. A folyadékfázisú fermentációból származó schizophyllan átlagos molekulatömege megközelítőleg 5 MDa, míg szilárd fázisú tenyésztésben akár 10 MDa-t is elérhet. Az ultrahanggal kezelt schizophyllan molekulatömegét a natív, kezeletlen schizophyllan molekulatömegeivel összehasonlítva az ultrahangos kezelés következtében 5–10-szeres molekulatömeg-csökkenés figyelhető meg.
Az ultrahanggal kezelt uSPG poliszacharid 0,7%w/w fehérjét és 1,0%w/w izzítási maradékot tartalmazott. Az uSPG hidrolizátuma több mint 99%-ban glükózból állt. Az analitikai eredmények azt mutatják, hogy az ultrahangos kezelés véletlenszerűen hasítja a β-glükán fő láncát, az oldalláncok pedig épek maradnak, így csökken a schizophyllan mérete és molekulatömege. A lényegében fehérje- és endotoxinmentes uSPG-n végzett immunológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az ultrahanggal kezelt, kis Mw-értékű schizophyllan kifejezett immunmoduláló aktivitással rendelkezik.

 
Csökkent viszkozitás: Az ultrahangos kezelés a tenyészlé viszkozitásának jelentős csökkenését eredményezte. Az ultrahangos kezelés során a tenyészlé viszkozitása nemlineárisan változott: a viszkozitáscsökkenés az ultrahangos kezelés kezdetén gyors volt, később azonban lelassult. A 100 Ws/mL fajlagos energiabevitel elegendő volt a tenyészlé viszkozitásának közel 7-szeres csökkentéséhez.

Javított szűrés: Az ultrahanggal kezelt tenyészlé gyorsabban áramlott át a szűrőn, mint a nagy molekulatömegű SPG-t tartalmazó kezeletlen tenyészlé (fajlagos energiabevitel 0 Ws/mL). Ezenkívül az ultrahangos kezelés jelentősen csökkentette a szűrés során fellépő termékveszteséget. A nagy molekulatömegű SPG-t tartalmazó kezeletlen tenyészlé szűrlete (fajlagos energiabevitel 0 Ws/mL) 0,3 ± 0,07 g/L SPG-t tartalmazott, míg az SPG-koncentráció a mélységi szűrés előtt 2 g/L volt. Ezzel szemben a 100 Ws/mL energiabevitellel ultrahanggal kezelt tenyészlé szűrlete 2,2 ± 0,2 g/L koncentrációban tartalmazott SPG-t, ami közel nulla termékveszteségnek felel meg.

Következtetés: Következtetésében a kutatócsoport összegzi, hogy az ultrahangos feldolgozás hatékony technológia kis molekulatömegű schizophyllan előállítására, amely ezt követően kozmetikai és gyógyászati célokra használható. A teljes, micéliumot tartalmazó tenyészlére alkalmazott ultrahangos kezelés bizonyos előnyöket kínál a schizophyllan előállításában. Csökkenti a termékveszteséget a további feldolgozás során, és az ultraszűrés hatékony alkalmazásának köszönhetően lehetővé teszi nagy tisztaságú poliszacharid előállítását.
Ezenkívül a kutatók megállapították, hogy a schizophyllan ultrahangos feldolgozása könnyen léptéknövelhető. A kísérleti üzem UIP2000hdT ultrahangos dezintegrátorának egy egysége átfolyásos üzemmódban 1 liter tenyészlevet dolgozott fel 110 s alatt. A rendszer termelékenysége további ultrahangos egységek sorba kapcsolásával könnyen növelhető.

 
Tudjon meg többet a gombaextrakció egyszerű léptéknöveléséről!
 

Nagy teljesítményű ultrahangos berendezések gombaeredetű glükánok feldolgozásához

A poliszacharidok, például a glükánok, valamint más bioaktív vegyületek, például a kitin és a kitozán fragmentálása megbízhatóan végezhető a Hielscher nagy teljesítményű ultrahangos berendezéseivel. Ultrahangos készülékeink nagy amplitúdókra képesek, lehetővé teszik a folyamatparaméterek pontos szabályozását, és 24/7 üzemeltethetők nagy terhelés mellett és igényes környezetben. A Hielscher Ultrasonics berendezéskínálata megbízhatóan teljesíti ezeket a követelményeket. A kiemelkedő ultrahangos teljesítmény mellett a Hielscher ultrahangos készülékei nagy energiahatékonysággal rendelkeznek, ami jelentős gazdasági előny – különösen a kereskedelmi célú nagyüzemi termelésben.
A Hielscher ultrahangos készülékei nagy teljesítményű rendszerek, amelyek olyan tartozékokkal szerelhetők fel, mint a szonotródák, amplitúdóerősítők, reaktorok vagy átfolyó cellák, hogy optimálisan megfeleljenek az Ön folyamatigényeinek.
A digitális színes kijelző, az ultrahangos kezelési ciklusok előzetes beállításának lehetősége, a beépített SD-kártyára történő automatikus adatrögzítés, a böngészőn keresztüli távoli vezérlés és számos további funkció biztosítja a legmagasabb szintű folyamatszabályozást és felhasználóbarát kezelést. Robusztus felépítésüknek és nagy terhelhetőségüknek köszönhetően a Hielscher ultrahangos rendszerei megbízható igáslovai a termelésnek.
A β-glükánok, például a schizophyllan molekulatömegének csökkentéséhez nagy teljesítményű ultrahang szükséges a célzott hasítás és egy olyan kiváló minőségű schizophyllan végtermék eléréséhez, amely gyógyszerészeti alkalmazásokban használható.
 
Itt további információkat talál a béta-glükánok gombákból történő ultrahangos extrakciójáról, lépésről lépésre követhető útmutatóval együtt!
 
Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról: