Nagy tisztaságú Schizophyllan béta-glükánok ultrahangos előállítása

A Schizophyallan egy gombás β-glükán, immunmoduláló tulajdonságokkal. A nagyon aktív gyógyhatások érdekében a schizophyllannak alacsony molekulatömegűnek kell lennie ahhoz, hogy jobb biológiai hozzáférhetőséget mutasson. Az ultrahangos kezelés bizonyítottan csökkenti a schizofillan molekulatömegét. Megbízható és hatékony módszerként az ultrahangos kezelés könnyen alkalmazható kis molekulatömegű schizofillan előállítására.

Schizophyllum gombák és ultrahangos béta-glükán extrakció

A Schizophyllum gomba fajai esős évszakok után a pusztuló fákon nőnek a természetben. A gyümölcstesteket a következő száraz évszakban gyűjtik. A Schizophyllum fajok biokémiai vegyületekben, például glükánokban gazdagok, ezért különösen a trópusi országokban fogyasztják élelmiszerként és gyógyszerként. Immunmoduláló, gombaellenes, daganatellenes és vírusellenes tulajdonságai miatt a Schizophyllum commune, más néven Splitgill gomba, vonzza a biotechnológiai és gyógyszeripari vállalatokat.
A poliszacharid schizophyllan, más néven sizofiran, sonifilan vagy sizofilan, a Schizophyllum gombákban található fő β-glükán, amely rendkívül hatékony bioaktív β-glükán schizophyllan.
A Schizophyllum commune gombák a természetben fákon nőnek, a micelliumot erjesztéslevesben is tenyészthetjük. Gyógyszerészeti és kozmetikai alkalmazásokban az alacsony molekulatömegű skizofillán sokkal hatékonyabb, mint a nagy molekulatömegű schizophyllan. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az alacsony molekulatömegű schizophyllan szignifikánsan jobb biológiai hozzáférhetőséget és abszorpciós sebességet mutat. Aditionálisan a nagy molekulatömegű schizophyllan gyakran problémás az alkalmazásokban, mivel vizes oldatainak nagy viszkozitását eredményezi.
Az ultrahangos méretcsökkentés rendkívül hatékony és megbízható technika a schizofillan molekulatömegének csökkentésére, ezáltal növelve a β-glükán molekula minőségét.

Protokoll kis molekulatömegű Schizophyllan előállításához

Mivel a molekulatömeg schizophyllan drasztikusan jobb biológiai hozzáférhetőséget és alkalmazási tulajdonságokat mutat, a Smirnou kutatócsoportja ultrahangosítva vizsgálta a β-glükán molekula schizophyllan hasítását és méretének csökkentését.

Schizophyllan ultrahangos kezelése

β-1.3(1.6)-A glükán skizofillánt (SPG) az S. commune gomba bioreaktorban történő víz alatti tenyésztésével állították elő, szacharóz szubsztrátumként.
A tenyésztés befejezése után a tenyészlevest ioncserélt vízzel hígítottuk 2 g / l skizofillán koncentrációra, és ultrahanggal ultrahangosítottuk a ultrahangos processzor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Németország) újrahasznosítási módban a következő paraméterekkel és feltételekkel: közepes áramlás 50 ml / s, frekvencia 20 kHz, kimenet 2000 W, BS2d22 típusú szonotród, B2-1.4 típusú erősítő és amplitúdó 100%. A tenyészetleves hőmérséklete az ultrahangos kezelés kezdetén 25 ° C volt. Az ultrahangos tenyészetlevest (fajlagos energiabevitel 100 W / ml) szűrtük át Seitz HS800 mélységszűrőn 1,5 bar nyomás alatt 40 ° C-on. Az ultrahangos schizophyllan (uSPG) kémiai jellemzéshez a szűrletből háromszoros mennyiségű izopropil-alkohollal laboratóriumi hőmérsékleten kicsapódott, és 60 ° C-on szárítottuk 12 órás uSPG oldatokat készítettünk immunológiai vizsgálatokhoz az alábbiak szerint: (1) az ultrahangos tenyészetleves szűrletet 0,1m2 Pall Centramate T-sorozatú PES kazettán (100 kDa cut-off) diafiltráltuk 0,8 bar nyomáson, és a diafiltrációt addig folytattuk, amíg a retenciós vezetőképesség 20 μS / cm volt; (2) az oldatot diafiltrációval 1 g/l uSPG-koncentrációig sűrítettük, majd autoklávozással 120 °C/20 percen sterilizáltuk. A denaturált uSPG-t hasonló módon állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy 0,2 M koncentrációban NaOH-t adtunk a táptalaj-szűrlethez, és a lúgosított oldatot 30 percig inkubáltuk laboratóriumi hőmérsékleten a diafiltráció előtt.

Analitikai módszerek

A micéliumhozamot gravimetriásan becsültük meg: a táptalajt vízzel 1:4 arányban hígítottuk, 10000 × g-ot centrifugáltunk 25 °C-on 20 percig, a csapadékot háromszoros mennyiségű vízzel átmostuk, 60 °C-on szárítottuk és súlyoztuk. A schizophyllánt a felülúszóból háromszoros mennyiségű izopropil-alkohollal csapták ki, 60 °C-on 24 órán át szárították, és termését gravimetriásan meghatározták. A táptalajban lévő pO2-t Hamilton-Visiferm DO 120 optikai szondával mértük (Hamilton, Svájc).
A táptalaj dinamikus viszkozitását a HAAKE Visco Tester 6L készülékkel mértük 1L és 2L orsókkal 4 ° C-on és 30 fordulat / perc fordulatszámon. A szűrési sebességet 500 ml tenyészetleves szűrési idejétől számítottuk ki 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) mélységszűrőn keresztül 1,5 bar nyomáson és 40 ° C-on.
Az uSPG molekulatömegét SEC-MALLS mérte az Alliance (Waters) HPLC rendszeren sorba kapcsolt PL aquagel OH60 és PL aquagel OH40 oszlopokkal, a miniDAWN TREOS (Wyatt) detektort pedig diafiltrációval 1 g/l uSPG koncentrációra koncentráltuk, és autoklávozással sterilizáltuk 120 °C/20 percen. A denaturált uSPG-t hasonló módon állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy 0,2 M koncentrációban NaOH-t adtunk a táptalaj-szűrlethez, és a lúgosított oldatot 30 percig inkubáltuk laboratóriumi hőmérsékleten a diafiltráció előtt.

Eredmények:
Az ultrahangos kezelést közvetlenül az S. commune 144-h tenyészetlevesre alkalmazták micéliummal, hogy megkönnyítsék az SPG downstream feldolgozását.
 
Az ultrahangos schizophyllan jellemzői: Az ultrahangos schizophyllan (uSPG) alkohollal szűrt tenyészetből kicsapódott és jellemezhető. A SEC-MALLS becslése szerint az uSPG MW-ja körülbelül 1 MDa. A folyékony fermentációból származó schizophyllan átlagos molekulatömege körülbelül 5 MDa, míg szilárdtest-tenyésztésben akár 10 MDa-t is elérhet. Összehasonlítva az ultrahangos schizophyllan molekulatömegét a natív kezeletlen schizophyllan molekulatömegével, az ultrahangos kezelés miatt 5-10-szeres csökkent molekulatömeg figyelhető meg.
Az ultrahangos poliszacharid uSPG 0,7 tömeg / tömeg fehérjét és 1,0 tömeg % maradékot tartalmazott a gyújtás után. Az uSPG hidrolizátum több mint 99% -os glükózból állt. Az analitikai eredmények azt mutatják, hogy az ultrahangos kezelés véletlenszerűen hasítja a β-glükán gerincét, és az oldalágak érintetlenek maradnak, ezáltal csökkentve a skizofillán méretét és molekulatömegét. A lényegében fehérje- és endotoxinmentes uSPG immunológiai vizsgálatai azt mutatták, hogy az ultrahangos alacsony Mw schizophyllan kifejezett immunmoduláló aktivitással rendelkezik.

 
Csökkent viszkozitás: Az ultrahangos kezelés a tenyészetleves viszkozitásának jelentős csökkenését eredményezte. Az ultrahangos kezelés során a tenyészetleves viszkozitása nem lineárisan változott: a viszkozitás csökkenése gyors volt az ultrahangos kezelés elején, de később lelassult. A fajlagos energiabevitel 100 Ws/ml elegendő volt ahhoz, hogy közel 7-szeresére csökkentse a táptalaj viszkozitását.

Továbbfejlesztett szűrés: Az ultrahanggal kezelt táptalaj gyorsabban áramlott át a szűrőn, mint a kezeletlen táptalaj (fajlagos energiabevitel 0 Ws / ml) nagy molekulatömegű SPG-vel. Ezen kívül, ultrahangos kezelés jelentősen csökkentette a termékveszteséget a szűrés során. A nagy molekulatömegű SPG-vel (fajlagos energiabevitel 0 Ws/ml) rendelkező kezeletlen táptalaj szűrlete 0,3 ± 0,07 g/l SPG-t tartalmazott, míg a mélységi szűrés előtti SPG-koncentráció 2 g/l volt. Ezzel szemben a 100 Ws / ml ultrahangos tenyészet szűrlete egyaránt tartalmazott SPG-t 2.2 ± 0.2 g / L koncentrációban, ami szinte nulla termékveszteségnek felel meg.

Következtetés: Következtetésükben a kutatócsoport folytatja, hogy az ultrahangos feldolgozás hatékony technológia a kis molekulatömegű skizofillán gyártására, amelyet ezután kozmetikumokban és gyógyászatban lehet használni. Az ultrahangos kezelés, ha micéliummal teljes tenyészetlevesre alkalmazzák, bizonyos előnyökkel jár a skizofillán termelésében. Csökkenti a termékveszteséget a későbbi feldolgozás során, és lehetővé teszi a nagy tisztaságú poliszacharid előállítását az ultraszűrés hatékony alkalmazásának köszönhetően.
Ezenkívül a kutatók azt találták, hogy a schizophyllan ultrahangos feldolgozása könnyen méretezhető. Az UIP2000hdT kísérleti üzem ultrahangos szétesésű egyik egysége 1 liter tenyészlevest dolgozott fel 110 másodperc alatt áramlási módban. A rendszer termelékenysége könnyen növelhető további ultrahangos egységek egymás utáni csatlakoztatásával.

 
Tudjon meg többet a gombakivonás egyszerű felfuttatásáról!
 

Nagy teljesítményű ultrahangos berendezés gombás glükán feldolgozásához

A poliszacharidok, például a glükánok, valamint más bioaktív vegyületek, például a kitin és a kitozán töredezettsége megbízhatóan feldolgozható Hielscher nagy teljesítményű ultrahangos berendezéssel. Ultrahangos készülékeink nagy amplitúdókat tudnak biztosítani, pontos szabályozhatóságot kínálnak a folyamatparaméterek felett, és 24/7 működtethetők nagy terhelés alatt és igényes környezetben. A Hielscher Ultrasonics berendezések megbízhatóan teljesítik ezeket a követelményeket. A kiemelkedő ultrahang teljesítmény mellett a Hielscher ultrasonicators nagy energiahatékonysággal büszkélkedhet, ami jelentős gazdasági előny – különösen akkor, ha nagyüzemi kereskedelemben alkalmazzák.
A Hielscher ultrasonicators nagy teljesítményű rendszerek, amelyek felszerelhetők olyan tartozékokkal, mint a sonotrodes, boosterek, reaktorok vagy áramlási cellák annak érdekében, hogy optimális módon megfeleljenek a folyamat igényeinek. A digitális színes kijelzővel lehetőség van előre beállított szonikációs futtatásokra, automatikus adatrögzítésre integrált SD-kártyán, távoli böngészővezérlés és még sok más funkció, legmagasabb folyamatvezérlés és felhasználóbarát. A robusztussággal és a nagy teherbírással párosítva a Hielscher ultrahangos rendszerek a megbízható munka ló a termelésben. A β-glükánok, például a skizofillán molekulatömegének csökkentése erőteljes ultrahangot igényel a célzott hasítás és a kiváló minőségű végső skizofillán termék eléréséhez, amely gyógyszerészeti alkalmazásokhoz használható.
 
További információ az ultrahangos béta-glükán kivonásáról a gombákból, beleértve a lépésről lépésre szóló utasításokat itt!
 
Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását: