Genetikai transzformáció növényi sejtekben ultrahanggal

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) hatékony módszer a növényi sejtek megfertőzésére idegen génekkel Agrobacterium mint transzporter. Az ultrahangos kavitáció sonoporációt okoz, amelyet a növényi szövet célzott mikro-sebzéseként lehet leírni. Ezeken keresztül ultrahanggal létrehoz mikro-sebeket, DNS és DNS vektorok hatékonyan szállíthatók a sejtmátrixba.

szonoporáció – Ultrahanggal fokozott sejttranszformáció

Amikor alacsony frekvenciájú ultrahangot (kb. 20 kHz) alkalmazunk a sejtszuszpenziókra, az akusztikus kavitáció hatása átmeneti membrán permeabilizációt okoz a sejtszövetekben. Ezt az ultrahangos hatást sonoporációnak nevezik, és a sejtekbe vagy szövetekbe történő génátvitelre használják.
Az ultrahangos kezelés előnyei a nem termikus mechanikai működési elvén alapulnak, ami az ultrahangos kezelést gyakran sokoldalúbbá és kevésbé függ a sejttípusoktól. A sonoporation sokoldalú alkalmazása megnyitja a lehetőséget a transzgenikus növények felhasználására, amelyek jelentős potenciállal rendelkeznek a komplex emberi terápiás fehérjék biotermelésében. Az ilyen növényi alapú bioreaktorok könnyen genetikailag manipulálhatók, megakadályozzák az emberi kórokozókkal való esetleges szennyeződést, nem károsítják a transzformációt közvetítő baktériumokat (pl. Agrobacterium), és olcsó, hatékony bioszintézist jelentenek.

Ultrahangos segített sejttranszformáció

A szonikálás olyan technika, amely alacsony frekvenciájú ultrahanghullámokat alkalmaz az oldatban lévő részecskék keverésére, az oldatok keverésére, ezáltal növelve a tömegátadás és az oldódás sebességét. Ezzel egyidejűleg az szonikálás eltávolíthatja az oldott gázokat a folyadékokból. A növényi átalakulás során az ultrahangozás mikrosebek kialakulását okozza a növényi szöveteken, és fokozza a meztelen DNS szállítását a növényi protoplasztba.

A genetikai transzformációhoz a szonikációval segített agrobaktérium által közvetített transzformáció (SAAT) az előnyben részesített módszer, és lényegesen nagyobb hatékonysággal rendelkezik, mint az ultrahangos kezelés, amelyet meztelen DNS és DNS-vektorok közvetlenül a protoplasztba történő átvitelére használnak. Számos tanulmány kimutatta, hogy az ultrahangos segített Agrobacterium-közvetített transzformáció (SAAT) felhasználható mechanikai zavarok és sebek kialakulása a növényi sejteken ultrahanghullámok és az ebből eredő akusztikus kavitáció. A rövid ultrahangos kezelés mikro-sebeket hoz létre az explantátumok felületén. Mivel a sebesült sejtek lehetővé teszik az Agrobacterium behatolását a növényi szövetek mélyebb részébe, ezáltal növelve a növényi sejtek fertőzésének valószínűségét. Ezenkívül a szekretált fenolos vegyületek fokozzák az átalakulást. Az ultrahanggal generált mikro-sebek teszik a baktériumok behatolását is megvalósíthatóbbá teszi. A SAAT-ot sikeresen alkalmazták genetikai transzformációra olyan növényfajokban, amelyeket különösen ellenállónak tartanak az Agrobacteriummal szemben.
A SAAT fő előnyei a nagyon egyszerű és olcsó módszer, valamint az Agrobacterium által közvetített géntranszfer jelentős fokozása. A SAAT sikeres alkalmazása mellett a Chenopodium rubrum L. és a Beta vulgaris L. transzformációjában ezt a megközelítést alkalmazták a rekombináns Escherichia coli vad típusú hőlabilis holotoxin és Escherichia coli mutáns LT vakcina adjuvánsok előállításánál is Nicotiana tabacumban, amelyekben a legmagasabb szisztémás LT-B-specifikus IgG titereket mutatták ki madarakban.
(vö. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka és R. Baranski, 2014)

A növényi sejtekben szonoporáció útján történő génátvitel általános eljárása

1. Genetikai anyag előállítása: Kezdje azzal, hogy előkészíti a növényi sejtekbe bevinni kívánt genetikai anyagot. Ez lehet plazmid DNS, RNS vagy más nukleinsav.
2. Növényi sejtek izolálása: Izolálja a megcélozni kívánt növényi sejteket. A kísérlettől függően ezeket a sejteket növényi szövetekből vagy tenyészetekből izolálhatjuk.
3. Sejt szuszpenzió: Szuszpendáljuk a növényi sejteket megfelelő táptalajban vagy pufferben. Ez elengedhetetlen annak biztosításához, hogy a sejtek egészségesek legyenek, és olyan állapotban legyenek, amely elősegíti a génfelvételt.
4. A Sonicator beállítása: Készítse elő a szonda típusú szonikátort szonikációs előre beállított paraméterekkel, például amplitúdóval, idővel, energiával és hőmérséklettel. Merítse az ultrahangos szondát a cellaszuszpenzióba.
5. Szonikálás: Indítsa el az ultrahangos eljárást. A szonda hegyének gyors oszcillációja kavitációs buborékokat generál a folyadékban. Ezek a buborékok az ultrahangos hullámok miatt kitágulnak és összeomlanak, mechanikai erőket és mikrostreaminget hozva létre a felfüggesztésben.
6. Szoptatás: A kavitáció által generált mechanikai erők és mikroáramlás ideiglenesen pórusokat és lyukakat hoz létre a növényi sejtek membránjaiban. A szuszpenzióban lévő genetikai anyag ezeken a pórusokon keresztül léphet be a növényi sejtekbe.
7. Lappangás: A sonoporációs kezelés után inkubálja a növényi sejteket, hogy lehetővé tegye számukra, hogy visszanyerjék és stabilizálják membránjaikat. Ez döntő lépés a sejtek túlélésének és a sikeres génátvitelnek a biztosításához.

Génátvitel agrobaktériumon vagy liposzómákon keresztül

A növényi sejtek transzfektálásának két gyakori formája van. A genetikai anyag hordozójaként agrobaktériumot, Gram-negatív baktériumok nemzetségét vagy liposzómákat használnak.

• Agrobaktérium által közvetített sonoporáció: Az Agrobacterium tumefaciens egy olyan baktérium, amelyet gyakran használnak a növényi génsebészetben. Ebben a módszerben a kívánt gént tartalmazó plazmid DNS-t bejuttatjuk az Agrobacteriumba, amelyet ezután növényi sejtekkel keverünk. A sejtszuszpenziót szonoporációnak vetjük alá szonda típusú szonda szondával. Az ultrahangos energia fokozza a genetikai anyag átadását az Agrobacteriumból a növényi sejtekbe. Ezt a módszert széles körben használják a növények genetikai módosítására.
• Liposzóma-mediált sonoporáció: A liposzómák lipid alapú vezikulumok, amelyek genetikai anyagot hordozhatnak. Ebben a módszerben plazmid DNS-sel vagy más nukleinsavakkal töltött liposzómákat összekeverünk növényi sejtekkel. A szonda típusú szondával történő szonda-szondás szonikátorral történő szondakezelést alkalmazzák a liposzómák növényi sejtek általi felvételének megkönnyítésére. Az ultrahang megzavarja a liposzómák lipid kettősrétegeit, felszabadítva a genetikai anyagot a növényi sejtekbe. Ez a megközelítés hasznos a növényi sejteken végzett átmeneti génexpressziós vizsgálatokhoz.

Tudományosan bizonyított előnyei szonikációval segített agrobaktérium által közvetített transzformáció (SAAT)

Szonikációval segített agrobaktérium-közvetített transzformációt (SAAT) számos növényfajra alkalmazták. A növényi sejtkultúrák rövid és viszonylag enyhe ultrahangos kezelése szonoporációt okoz, amely ezt követően lehetővé teszi az Agrobacterium mély behatolását géntranszporterként. Az alábbiakban példaértékű tanulmányokat olvashat, amelyek bemutatják a SAAT jótékony hatásait.

Az ashwagandha ultrahanggal segített átalakítása

A W. somnifera (ashwagandha vagy téli cseresznye néven ismert) transzformációs hatékonyságának javítása érdekében Dehdashti és munkatársai (2016) megvizsgálták az acetosyringone (AS) és az ultrahangos kezelés alkalmazását.
Az acetosziringont (AS) három lépésben adták hozzá: Agrobacterium folyékony tenyészet, Agrobacterium fertőzés és explantátumok Agrobacteriummal való kokultúrája. A 75 μM AS hozzáadása az Agrobacterium folyadéktenyészethez optimálisnak bizonyult a vir gének indukciójához.
A szonikáció (SAAT) további alkalmazása a legmagasabb génexpressziót eredményezte. A szőrös gyökerekben a gusA génexpressziót akkor találták a legjobbnak, amikor a leveleket és a hajtáscsúcsokat 10, illetve 20 másodpercig ultrahanggal kezelték. A továbbfejlesztett protokoll transzformációs hatékonyságát 66,5%-os, illetve 59,5%-os transzformációs hatékonyságot regisztrálták a levél- és hajtáscsúcs-explantátumok esetében. Más protokollokkal összehasonlítva ennek a továbbfejlesztett protokollnak a transzformációs hatékonysága 2,5-szer nagyobb volt a levelek és 3,7-szer nagyobb a hajtáscsúcsok esetében. A déli blotanalízisek megerősítették a gusA transzgén 1-2 kópiáját a W1-W4 vonalakban, míg 1-4 transzgén kópiát a továbbfejlesztett protokoll által generált W5 vonalban.

Az ultrahangos kezeléssel segített Agrobacterium-közvetített transzformáció (SAAT) időtartamának hatása a W. somnifera levél (a) és a hajtáscsúcs (b) explantátumok transzformációs gyakoriságára
(tanulmány és grafika: © Dehdashti et al., 2016)

A pamut ultrahanggal segített átalakítása

Hussain et al. (2007) bemutatja az szonikációval segített pamut átalakítás jótékony hatásait. Az alacsony frekvenciájú ultrahang által okozott akusztikus kavitáció mikro-sebeket hoz létre a növényi szövetek felszínén és alatt (sonoporáció), és lehetővé teszi az Agrobacterium számára, hogy mélyebben és teljesen utazzon a növényi szövetben. Ez a sebzési mód növeli annak valószínűségét, hogy a szövetekben mélyebben fekvő növényi sejteket megfertőzzék. A SAAT transzformációs hatékonyságának értékeléséhez GUS génexpressziót mértünk. A GUS riporter rendszer egy riporter génrendszer, amely különösen hasznos a növényi molekuláris biológiában és mikrobiológiában. A különböző SAAT paraméterek beállításával jelentősen javult a GUS tranziens expressziója érett embriók explantátumként történő felhasználásával a gyapotban. A GUST-t először 24 órával az explantátumok inkubálása után észlelték, és 48 óráig a GUS expressziója nagyon intenzív volt, ami hasznos mutatóként szolgált a gyapot explantátum sikeres átalakulásához szonikálással segített Agrobacterium közvetített transzformáció (SAAT) után. A különböző transzformációs technikák (nevezetesen biolisztikus, Agro, BAAT, SAAT), szonikációval segített Agrobacterium-közvetített transzformáció (SAAT) összehasonlítása messze a legjobb transzformációs eredményeket mutatta.

A transzformációs eljárás megválasztása a GUS tranziens expressziója alapján. A szonikációval segített Agrobacterium-közvetített transzformáció (SAAT) szignifikánsan magasabb átmeneti expressziót mutat.
(tanulmány és grafika: © Hussain et al., 2007)

Nagy teljesítményű ultrahangos megoldások szonoporációhoz és SAAT-hoz

A Hielscher Ultrasonics már régóta tapasztalattal rendelkezik a nagy teljesítményű ultrahangos készülékek fejlesztésében és gyártásában laboratóriumok, kutatási létesítmények, valamint ipari termelés nagyon nagy teljesítményű. A mikrobiológia és az élettudomány számára a Hielscher különböző megoldásokat kínál az egyes szövetekhez és kezelésükhöz szükséges különböző követelmények kielégítésére. Számos minta egyidejű ultrahangos kezeléséhez Hielscher a UIP400MTP kínál többlyukú lemezekhez, a VialTweeter ultrahangos kezeléshez legfeljebb 10 injekciós üveg (pl. Eppendorf csövek) vagy az ultrahangos CupHorn. A szonda típusú ultrahangos készülékek 50 és 400 watt között kaphatók laboratóriumi homogenizátorként, míg az ipari rendszerek az 500 watt és 16kW közötti teljesítménytartományt fedik le.
Kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot, és tudassa velünk jelentkezési és folyamatkövetelményeit. Jól tapasztalt munkatársaink örömmel ajánlják a legmegfelelőbb ultrahangos készüléket a biológiai folyamathoz.
Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását: