A szonikációval segített agrobaktérium-mediált transzformáció (SAAT) hatékony módszer a növényi sejtek idegen génekkel való megfertőzésére agrobakterium transzporterként történő felhasználásával. Az ultrahangos kavitáció sonoporációt okoz, amely a növényi szövet célzott mikrosebzéseként írható le. Ezeken keresztül ultrahangosan mikro-sebeket hoz létre, a DNS és a DNS vektorok hatékonyan szállíthatók a sejtmátrixba.

sonoporáció – Ultrahanggal fokozott sejttranszformáció

Ha alacsony frekvenciájú ultrahangot (kb. 20 kHz) alkalmazunk a sejtszuszpenziókra, az akusztikus kavitáció hatása átmeneti membránpermeabilizációt okoz a sejtszöveteken. Ezt az ultrahangos hatást sonoporációnak nevezik, és a sejtekbe vagy szövetekbe történő génátvitelre használják.
Az ultrahangos kezelés előnyei a nem termikus mechanikai működési elvén alapulnak, amely az ultrahangos kezelést gyakran sokoldalúbbá teszi, és kevésbé függ a sejttípusoktól. A sonoporáció sokoldalú alkalmazása megnyitja a lehetőséget a transzgenikus növények hasznosítására, amelyek jelentős potenciállal rendelkeznek a komplex humán terápiás fehérjék biotermelésében. Az ilyen növényi alapú bioreaktorok könnyen genetikailag manipulálhatók, megakadályozhatják az emberi kórokozókkal való esetleges szennyeződést, nem károsítják a transzformációs közvetítő baktériumokat (pl. Agrobacterium), és olcsó, hatékony bioszintézis-módszert jelentenek.

Ultrahangos-asszisztált sejt transzformáció

Az ultrahangos kezelés olyan technika, amely alacsony frekvenciájú ultrahanghullámokat alkalmaz az oldatban lévő részecskék keverésére, az oldatok keverésére, ezáltal növelve a tömegátadás és az oldódás sebességét. Ezzel egyidejűleg az ultrahangos kezelés eltávolíthatja az oldott gázokat a folyadékokból. A növényi átalakulás során az ultrahangos kezelés mikrohullámok képződését okozza a növényi szöveteken, és fokozza a meztelen DNS szállítását a növényi protoplasztba.

A genetikai transzformációhoz a Sonication-Assisted Agrobacterium-meditált transzformáció (SAAT) az előnyben részesített módszer, és lényegesen nagyobb hatékonysággal rendelkezik, mint a meztelen DNS- és DNS-vektorok közvetlenül a protoplasztba történő átvitelére használt szonikáció. Számos tanulmány kimutatta, hogy az ultrahangos kezelés segítette az Agrobacterium által közvetített transzformációt (SAAT) ultrahanghullámok és az ebből eredő akusztikus kavitáció mechanikai megzavarására és sebképződésére a növényi sejteken. A rövid ultrahangos kezelés mikro-sebeket hoz létre az explánsok felületén. Mivel a sebesült sejtek lehetővé teszik az Agrobacterium behatolását a növényi szövetek mélyebb részébe, ezáltal növelve a növényi sejtek fertőzésének valószínűségét. Ezenkívül a szekretált fenolos vegyületek fokozzák az átalakulást. Az ultrahanggal generált mikro-sebek a baktériumok explant behatolását is megvalósíthatóbbá teszik. A SAAT-ot sikeresen alkalmazták genetikai átalakulásra olyan növényfajokban, amelyeket különösen az Agrobacteriummal szemben rezisztensnek tartanak.
A SAAT fő előnyei egy nagyon egyszerű és olcsó módszer, valamint az Agrobacterium által közvetített géntranszfer jelentős javulása. A SAAT sikeres alkalmazása mellett a Chenopodium rubrum L. és a Beta vulgaris L. átalakításában ezt a megközelítést alkalmazták a rekombináns Escherichia coli vad típusú hő-labilis holotoxin és escherichia coli mutáns LT vakcina adjuvánsok Előállításában Nicotiana tabacumban, amelyben a legmagasabb szisztémás LT-B-specifikus IgG titereket mutatták ki madarakban.
(vö. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka és R. Baranski, 2014)

A növényi sejtekben szonoporáció útján történő génátvitel általános eljárása

1. Genetikai anyag előállítása: Kezdje azzal, hogy előkészíti a növényi sejtekbe bevinni kívánt genetikai anyagot. Ez lehet plazmid DNS, RNS vagy más nukleinsav.
2. Növényi sejtek izolálása: Izolálja a megcélozni kívánt növényi sejteket. A kísérlettől függően ezeket a sejteket növényi szövetekből vagy tenyészetekből izolálhatjuk.
3. Sejt szuszpenzió: Szuszpendáljuk a növényi sejteket megfelelő táptalajban vagy pufferben. Ez elengedhetetlen annak biztosításához, hogy a sejtek egészségesek legyenek, és olyan állapotban legyenek, amely elősegíti a génfelvételt.
4. A Sonicator beállítása: Készítse elő a szonda típusú szonikátort szonikációs előre beállított paraméterekkel, például amplitúdóval, idővel, energiával és hőmérséklettel. Merítse az ultrahangos szondát a cellaszuszpenzióba.
5. Az ultrahangos kezelés: Indítsa el az ultrahangos eljárást. A szonda hegyének gyors oszcillációja kavitációs buborékokat generál a folyadékban. Ezek a buborékok az ultrahangos hullámok miatt kitágulnak és összeomlanak, mechanikai erőket és mikrostreaminget hozva létre a felfüggesztésben.
6. Szoptatás: A kavitáció által generált mechanikai erők és mikroáramlás ideiglenesen pórusokat és lyukakat hoz létre a növényi sejtek membránjaiban. A szuszpenzióban lévő genetikai anyag ezeken a pórusokon keresztül léphet be a növényi sejtekbe.
7. Lappangás: A sonoporációs kezelés után inkubálja a növényi sejteket, hogy lehetővé tegye számukra, hogy visszanyerjék és stabilizálják membránjaikat. Ez döntő lépés a sejtek túlélésének és a sikeres génátvitelnek a biztosításához.

Génátvitel agrobaktériumon vagy liposzómákon keresztül

A növényi sejtek transzfektálásának két gyakori formája van. A genetikai anyag hordozójaként agrobaktériumot, Gram-negatív baktériumok nemzetségét vagy liposzómákat használnak.

• Agrobaktérium által közvetített sonoporáció: Az Agrobacterium tumefaciens egy baktérium, amelyet általában a növényi génsebészetben használnak. Ebben a módszerben a kívánt gént tartalmazó plazmid DNS-t bejuttatjuk az Agrobacteriumba, amelyet ezután növényi sejtekkel keverünk. A sejtszuszpenziót szonoporációnak vetjük alá szonda típusú szonda szondával. Az ultrahangos energia fokozza a genetikai anyag átadását az Agrobacteriumból a növényi sejtekbe. Ezt a módszert széles körben használják a növények genetikai módosítására.
• Liposzóma-mediált sonoporáció: A liposzómák lipid alapú vezikulumok, amelyek genetikai anyagot hordozhatnak. Ebben a módszerben plazmid DNS-sel vagy más nukleinsavakkal töltött liposzómákat keverünk növényi sejtekkel. A szonda típusú szondával történő szonda-szondás szonikátorral történő szondakezelést alkalmazzák a liposzómák növényi sejtek általi felvételének megkönnyítésére. Az ultrahang megzavarja a liposzómák lipid kettősrétegeit, felszabadítva a genetikai anyagot a növényi sejtekbe. Ez a megközelítés hasznos a növényi sejteken végzett átmeneti génexpressziós vizsgálatokhoz.

A szonikáció által segített agrobaktérium-közvetített transzformáció (SAAT) tudományosan bizonyított előnyei

Az ultrahangos-asszisztált agrobaktérium-közvetített transzformációt (SAAT) számos növényfajra alkalmazták. A növényi sejttenyészetek rövid és viszonylag enyhe ultrahangos kezelése sonoporációt okoz, ami később lehetővé teszi az Agrobacterium, mint géntranszporter mély behatolását. Az alábbiakban példaértékű tanulmányokat olvashat, amelyek bemutatják a SAAT jótékony hatásait.

Ashwagandha ultrahanggal segített átalakulása

A W. somnifera (ashwagandha vagy téli cseresznye) transzformációs hatékonyságának javítása érdekében Dehdashti és kollégái (2016) megvizsgálták az acetosyringon (AS) és az ultrahangos kezelés alkalmazását.
Az acetosyringont (AS) három szakaszban adtuk hozzá: Agrobacterium folyékony tenyészet, Agrobacterium fertőzés és explánsok együtttenyésztése az Agrobacteriummal. A 75 μM AS hozzáadása az Agrobacterium folyékony tenyészethez optimálisnak bizonyult a vir gének indukciójához.
Az ultrahangos kezelés (SAAT) további alkalmazása a legmagasabb génexpressziót eredményezte. A gusA génexpressziót szőrös gyökerekben akkor találták a legjobbnak, amikor a leveleket és a lőcsúcsokat 10, illetve 20 másodpercig szonikálták. A továbbfejlesztett protokoll átalakítási hatékonyságát 66,5%-kal, illetve 59,5%-kal rögzítették a levél- és hajtáscsúcs-explánsok esetében. Más protokollokhoz képest ennek a továbbfejlesztett protokollnak az átalakítási hatékonysága 2,5-szer magasabbnak bizonyult a leveleknél és 3,7-szer nagyobb a hajtási tippeknél. A déli blot elemzések megerősítették a gusA transzgén 1–2 példányát a W1-W4 sorokban, míg 1–4 transzgén másolatot a továbbfejlesztett protokoll által generált W5 sorban.

A szonikációval támogatott Agrobacterium- közvetített transzformáció (SAAT) időtartamának hatása a W. somnifera levél (a) és a hajtáscsúcs (b) explánsok transzformációs gyakoriságára
(tanulmány és grafika: © Dehdashti et al., 2016)

A pamut ultrahanggal segített átalakítása

Hussain et al. (2007) bemutatja a szonikációval támogatott pamut átalakulás jótékony hatásait. Az alacsony frekvenciájú ultrahang által okozott akusztikus kavitáció mikrosebeket hoz létre a növényi szövet felszínén és alatt (sonoporáció), és lehetővé teszi az Agrobacterium számára, hogy mélyebben és teljesen utazzon a növényi szövetben. Ez a sebesítő divat növeli annak valószínűségét, hogy megfertőzik a szövetekben mélyebben fekvő növényi sejteket. A SAAT transzformációs hatékonyságának értékeléséhez a GUS génexpressziót megmérték. A GUS riporteri rendszer egy riporteri génrendszer, amely különösen hasznos a növény molekuláris biológiájában és mikrobiológiájában. Különböző SAAT paramétereket kiigazítva jelentősen javult a GUS átmeneti expressziója a gyapotban érett embriók explantátumként történő felhasználásával. A GUS-t először 24 órával az explánsok inkubálása után észlelték, és 48 órával a GUS expressziója nagyon intenzív volt, ami hasznos mutatója volt a pamut explantáció sikeres átalakulásának az ultrahangosítással segített Agrobacterium által közvetített transzformációt (SAAT) követően. A különböző transzformációs technikák (nevezetesen biolisztika, Agro, BAAT, SAAT), szonikációval támogatott Agrobacterium által közvetített transzformáció (SAAT) összehasonlítása messze a legjobb transzformációs eredményeket mutatta.

Az átalakítási eljárás megválasztása a GUS átmeneti kifejezése alapján. A szonikációval támogatott Agrobacterium-mediált transzformáció (SAAT) szignifikánsan magasabb tranziens expressziót mutat.
(tanulmány és grafika: © Hussain et al., 2007)

Nagy teljesítményű ultrahangos megoldások a sonoporációhoz és a SAAT-hoz

Hielscher Ultrasonics régóta tapasztalt a fejlesztésben és gyártásban nagy teljesítményű ultrasonicatorok laboratóriumok, kutatási létesítmények, valamint ipari termelés nagyon nagy áteresztőképességgel. A mikrobiológia és az élettudomány számára a Hielscher különféle megoldásokat kínál az egyes szövetekhez és azok kezeléséhez szükséges különböző követelmények kielégítésére. Számos minta egyidejű ultrahangos kezelésére a Hielscher felajánlja az UIP400MTP-t többlakású lemezekhez, a VialTweeter-t akár 10 injekciós üveg (pl. Eppendorf csövek) vagy az ultrahangos CupHorn ultrahangos ultrahangos adagolásához. A szonda típusú ultrahangos készülékek 50 és 400 watt között kaphatók laboratóriumi homogenizátorként, míg az ipari rendszerek lefedik az 500 watttól 16 kW-ig terjedő teljesítménytartományt.
Kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot, és tudassa velünk jelentkezési és folyamatkövetelményeit. Jól tapasztalt munkatársaink örömmel ajánlják a legmegfelelőbb ultrasonicatort a biológiai folyamathoz.
Az alábbi táblázat az ultrahangos készülékek hozzávetőleges feldolgozási kapacitását jelzi: