Növényi sejtek genetikai transzformációja ultrahanggal

Az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) hatékony módszer a növényi sejtek idegen génekkel történő fertőzésére, amelyben az Agrobacterium szállítóként működik. Az ultrahangos kavitáció szonoporációt okoz, amely a növényi szövet célzott mikrosérüléseinek létrehozásaként írható le. Ezeken az ultrahanggal létrehozott mikrosérüléseken keresztül a DNS és a DNS-vektorok hatékonyan juttathatók a sejtmátrixba.

Szonoporáció – Ultrahanggal fokozott sejttranszformáció

Amikor alacsony frekvenciájú ultrahangot (kb. 20kHz) alkalmaznak sejtszuszpenziókon, az akusztikus kavitáció hatásai a sejtszövetekben átmenetileg fokozzák a membránok áteresztőképességét. Ezt az ultrahangos hatást szonoporációnak nevezik, és gének sejtekbe vagy szövetekbe történő bevitelére használják.
Az ultrahangos kezelés előnyei a nem termikus, mechanikai működési elvén alapulnak, amely az ultrahangos kezelést gyakran sokoldalúbbá és a sejttípusoktól kevésbé függővé teszi. A szonoporáció sokoldalú alkalmazása lehetőséget nyit a transzgénikus növények hasznosítására, amelyek jelentős potenciállal rendelkeznek összetett humán terápiás fehérjék biológiai előállításában. Az ilyen növényi alapú bioreaktorok genetikailag könnyen módosíthatók, megakadályozzák a humán kórokozókkal való esetleges szennyeződést, nem károsítják a transzformációt közvetítő baktériumokat (pl. Agrobacterium), és a bioszintézis olcsó, hatékony módszerét jelentik.

Ultrahanggal segített sejttranszformáció

Az ultrahangos kezelés olyan technika, amely alacsony frekvenciájú ultrahanghullámokkal mozgatja az oldatban lévő részecskéket és keveri az oldatokat, ezáltal növelve az anyagátadás és az oldódás sebességét. Ezzel egyidejűleg az ultrahangos kezelés eltávolíthatja az oldott gázokat a folyadékokból. A növényi transzformáció során az ultrahangos kezelés mikrosérüléseket hoz létre a növényi szöveten, és elősegíti a csupasz DNS bejuttatását a növényi protoplasztba.

A genetikai transzformációhoz az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) az előnyben részesített módszer, és hatékonysága jelentősen nagyobb, mint a csupasz DNS és a DNS-vektorok közvetlenül a protoplasztba történő bejuttatására alkalmazott ultrahangos kezelésé. Számos tanulmány kimutatta, hogy az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) alkalmazható a növényi sejtek mechanikai roncsolásának és sérüléseinek előidézésére az ultrahanghullámok és az általuk kiváltott akusztikus kavitáció révén. A rövid ultrahangos kezelés mikrosérüléseket hoz létre az explantátumok felszínén. A sérült sejtek lehetővé teszik, hogy az Agrobacterium behatoljon a növényi szövetek mélyebb részeibe, ezáltal növelve a növényi sejtek megfertőződésének valószínűségét. Emellett a kiválasztott fenolos vegyületek fokozzák a transzformációt. Az ultrahanggal létrehozott mikrosérülések a baktériumok explantátumokba történő behatolását is megkönnyítik. A SAAT módszert sikeresen alkalmazták olyan növényfajok genetikai transzformációjára, amelyeket különösen ellenállónak tartanak az Agrobacteriummal szemben.
A SAAT fő előnyei, hogy nagyon egyszerű és olcsó módszer, valamint jelentősen fokozza az Agrobacterium közvetítette génátvitelt. A SAAT sikeres alkalmazása mellett a Chenopodium rubrum L. és a Beta vulgaris L. transzformációjában ezt a megközelítést rekombináns, vad típusú Escherichia coli hőlabilis holotoxin és mutáns Escherichia coli LT vakcinaadjuvánsok Nicotiana tabacumban történő előállítására is alkalmazták, amelynek során madarakban a legmagasabb szisztémás LT-B-specifikus IgG-titereket mutatták ki.
(vö. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka és R. Baranski, 2014)

A növényi sejtekbe szonoporációval történő génbevitel általános eljárása

1. A genetikai anyag előkészítése: Kezdje a növényi sejtekbe bejuttatni kívánt genetikai anyag előkészítésével. Ez lehet plazmid-DNS, RNS vagy más nukleinsav.
2. A növényi sejtek izolálása: Izolálja a megcélzott növényi sejteket. A kísérlettől függően ezek a sejtek növényi szövetekből vagy kultúrákból izolálhatók.
3. Sejtszuszpenzió: Szuszpendálja a növényi sejteket megfelelő tápközegben vagy pufferben. Ez elengedhetetlen ahhoz, hogy a sejtek egészségesek és a génfelvételnek kedvező állapotban legyenek.
4. Az ultrahangos készülék beállítása: Készítse elő a szondás ultrahangos készüléket az ultrahangos kezelés paramétereinek, például az amplitúdónak, az időnek, az energiának és a hőmérsékletnek az előzetes beállításával. Merítse az ultrahangos szondát a sejtszuszpenzióba.
5. Ultrahangos kezelés: Indítsa el az ultrahangos kezelést. A szondacsúcs gyors rezgése kavitációs buborékokat hoz létre a folyadékban. Ezek a buborékok az ultrahanghullámok hatására kitágulnak és összeomlanak, mechanikai erőket és mikroáramlást hozva létre a szuszpenzióban.
6. Szonoporáció: A kavitáció által létrehozott mechanikai erők és mikroáramlás átmeneti pórusokat és nyílásokat hoznak létre a növényi sejtek membránjaiban. A szuszpenzióban jelen lévő genetikai anyag ezeken a pórusokon keresztül juthat be a növényi sejtekbe.
7. Inkubálás: A szonoporációs kezelés után inkubálja a növényi sejteket, hogy regenerálódhassanak és stabilizálhassák membránjaikat. Ez döntő fontosságú lépés a sejtek túlélésének és a sikeres génátvitelnek a biztosításához.

Génátvitel Agrobacterium vagy liposzómák segítségével

A növényi sejtek transzfekciójának két elterjedt módja van. Ezek a genetikai anyag hordozójaként vagy az Agrobacteriumot, a Gram-negatív baktériumok egyik nemzetségét, vagy liposzómákat használnak.

• Agrobacterium közvetítette szonoporáció: Az Agrobacterium tumefaciens a növényi géntechnológiában gyakran alkalmazott baktérium. Ennél a módszernél a kívánt gént tartalmazó plazmid-DNS-t bejuttatják az Agrobacteriumba, amelyet ezután növényi sejtekkel kevernek össze. A sejtszuszpenziót szondás ultrahangos készülékkel szonoporációnak vetik alá. Az ultrahangos energia fokozza a genetikai anyag átvitelét az Agrobacteriumból a növényi sejtekbe. Ezt a módszert széles körben alkalmazzák a növények genetikai módosítására.
• Liposzómák közvetítette szonoporáció: A liposzómák lipidalapú vezikulák, amelyek genetikai anyagot hordozhatnak. Ennél a módszernél plazmid-DNS-sel vagy más nukleinsavakkal töltött liposzómákat kevernek össze növényi sejtekkel. Szondás ultrahangos készülékkel végzett szonoporációval segítik elő a liposzómák felvételét a növényi sejtekbe. Az ultrahang megbontja a liposzómák lipid kettősrétegeit, így a genetikai anyag felszabadul a növényi sejtekben. Ez a megközelítés hasznos a növényi sejtekben végzett átmeneti génexpressziós vizsgálatokhoz.

Az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) tudományosan igazolt előnyei

Az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformációt (SAAT) számos növényfajnál alkalmazták. A növényi sejtkultúrák rövid és viszonylag enyhe ultrahangos kezelése szonoporációt okoz, amely ezt követően lehetővé teszi a génszállítóként működő Agrobacterium mély behatolását. Az alábbiakban a SAAT kedvező hatásait bemutató tanulmányokról olvashat példákat.

Az ashwagandha ultrahanggal segített transzformációja

A W. somnifera (ashwagandha vagy téli cseresznye néven ismert növény) transzformációs hatékonyságának javítása érdekében Dehdashti és munkatársai (2016) az acetosziringon (AS) és az ultrahangos kezelés alkalmazását vizsgálták.
Az acetosziringont (AS) három szakaszban adták hozzá: az Agrobacterium folyadékkultúrájához, az Agrobacteriummal történő fertőzés során, valamint az explantátumok Agrobacteriummal közös tenyésztésekor. A vir gének indukciójához optimálisnak találták 75 μM AS hozzáadását az Agrobacterium folyadékkultúrájához.
Az ultrahangos kezelés (SAAT) kiegészítő alkalmazása eredményezte a legmagasabb génexpressziót. A hajszálgyökerekben a gusA gén expressziója akkor bizonyult a legjobbnak, amikor a leveleket és a hajtáscsúcsokat rendre 10 és 20s ideig kezelték ultrahanggal. A továbbfejlesztett protokoll transzformációs hatékonysága a levél- és hajtáscsúcs-explantátumok esetében rendre 66,5 és 59,5% volt. Más protokollokhoz képest e továbbfejlesztett protokoll transzformációs hatékonysága a leveleknél 2,5-szer, a hajtáscsúcsoknál 3,7-szer nagyobbnak bizonyult. A Southern-blot-elemzések a gusA transzgén 1–2 kópiáját igazolták a W1-W4 vonalakban, míg a továbbfejlesztett protokollal létrehozott W5 vonalban 1–4 transzgénkópiát mutattak ki.

Az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) időtartamának hatása a W. somnifera levél- (a) és hajtáscsúcs-explantátumainak (b) transzformációs gyakoriságára
(tanulmány és ábra: © Dehdashti et al., 2016)

A gyapot ultrahanggal segített transzformációja

Hussain et al. (2007) bemutatják az ultrahangos kezeléssel segített gyapottranszformáció kedvező hatásait. Az alacsony frekvenciájú ultrahang által kiváltott akusztikus kavitáció mikrosérüléseket hoz létre a növényi szövet felszínén és a felszín alatt (szonoporáció), és lehetővé teszi, hogy az Agrobacterium mélyebbre jusson, és teljesen átjárja a növényi szövetet. A sérülések ilyen módon történő létrehozása növeli a szövet mélyebb rétegeiben elhelyezkedő növényi sejtek megfertőzésének valószínűségét. A SAAT transzformációs hatékonyságának értékeléséhez a GUS gén expresszióját mérték. A GUS riporterrendszer olyan riportergénrendszer, amely különösen hasznos a növényi molekuláris biológiában és a mikrobiológiában. A SAAT különböző paramétereinek beállításával, érett embriókat használva explantátumként, jelentősen fokozták a GUS átmeneti expresszióját gyapotban. A GUS-t először az explantátumok inkubálását követő 24h elteltével mutatták ki, és 48h elteltével a GUS expressziója már nagyon intenzív volt, ami az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformációt (SAAT) követően a gyapotexplantátum sikeres transzformációjának hasznos jelzőjeként szolgált. A különböző transzformációs technikák (nevezetesen a biolisztikus, az Agro, a BAAT és a SAAT) összehasonlításakor az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) messze a legjobb transzformációs eredményeket mutatta.

A transzformációs eljárás kiválasztása a GUS átmeneti expressziója alapján. Az ultrahangos kezeléssel segített, Agrobacterium közvetítette transzformáció (SAAT) jelentősen magasabb átmeneti expressziót mutat.
(tanulmány és ábra: © Hussain et al., 2007)

Nagy teljesítményű ultrahangos megoldások szonoporációhoz és SAAT-hoz

A Hielscher Ultrasonics nagy múltra visszatekintő tapasztalattal rendelkezik a laboratóriumok, kutatóintézetek és a nagyon nagy feldolgozási kapacitású ipari termelés számára készülő, nagy teljesítményű ultrahangos készülékek fejlesztésében és gyártásában. A mikrobiológia és az élettudományok területén a Hielscher különféle megoldásokat kínál az egyes szövetek és kezeléseik sajátos követelményeinek kielégítésére. Számos minta egyidejű ultrahangos kezeléséhez a Hielscher a többlyukú lemezekhez használható UIP400MTP készüléket, az akár 10 fiola (pl. Eppendorf-csövek) ultrahangos kezelésére szolgáló VialTweeter készüléket vagy az ultrahangos CupHorn készüléket kínálja. A szondás ultrahangos készülékek 50–400 watt teljesítményű laboratóriumi homogenizátorként, illetve 500 watttól 16kW-ig terjedő teljesítményű ipari rendszerként kaphatók.
Kérjük, lépjen kapcsolatba velünk, és tájékoztasson minket az alkalmazásáról és a folyamat követelményeiről. Tapasztalt munkatársaink örömmel ajánlják az Ön biológiai folyamatához legmegfelelőbb ultrahangos készüléket.
Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról: