બેક્ટેરિયાના નમૂનાઓમાં અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિસમૂહન

બેક્ટેરિયાના નમૂનાઓ ભાગ્યે જ ખરેખર એકલ કોષોના નિલંબન સ્વરૂપે મળે છે. સંવર્ધનો શૃંખલાઓ અને ગૂચ્છોમાં વધે છે, પર્યાવરણીય વિયોજિત જાતો કોષબાહ્ય પોલિમરી પદાર્થોથી બંધાયેલા સમૂહો બનાવે છે, અને સેન્ટ્રિફ્યુગેશનથી બનેલા કોષ અવસાદો ઘણી વાર સારી રીતે વોર્ટેક્સિંગ કર્યા છતાં ફરીથી નિલંબિત થતા નથી. જીવંત કોષોની ગણતરી, પ્રકાશીય ઘનતા, ફ્લો સાઇટોમેટ્રી અને માઇક્રોબાયોમ પ્રોફાઇલિંગ – આ બધાંમાં એવું માનવામાં આવે છે કે એક કણ એટલે એક કોષ. અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિસમૂહન આ વિસંગતિ દૂર કરે છે: સોનિકેશનના ટૂંકા, નિયંત્રિત સ્પંદનો કોષલયન કર્યા વિના સમૂહોને એકલ કોષોમાં અલગ કરે છે.

કોષોનું સમૂહીકરણ તમારાં પરિણામોને શા માટે અસર કરે છે

સમૂહીકરણ એક જૈવિક લક્ષણ છે, નમૂનો તૈયાર કરવામાં થયેલી ભૂલ નથી. સ્ટેફિલોકોકસ, સ્ટ્રેપ્ટોકોકસ, લેક્ટોબેસિલસ, એક્ટિનોમાઇસિસ અને ઘણી પર્યાવરણીય પ્રજાતિઓ શૃંખલાઓ, સમૂહો અથવા બાયોફિલ્મના ખંડોમાં વધે છે, અને કોષબાહ્ય DNA તથા પોલિસેકેરાઇડ્સ કોષ અવસાદો અને સ્વેબમાંથી ધોઈને મેળવેલા પ્રવાહીમાં કોષોને એકબીજા સાથે ચોંટાડી રાખે છે. તેના વિશ્લેષણાત્મક પરિણામોમાં વ્યવસ્થિત પક્ષપાત જોવા મળે છે:

• કોલોનીની ગણતરી વાસ્તવિક કરતાં ઓછી થાય છે, કારણ કે એક ગઠ્ઠામાં ગમે તેટલા કોષો હોય, તેમાંથી એક જ કોલોની બને છે.
• પ્રકાશીય ઘનતાના માપન અને કણ ગણકો કોષોને બદલે સમૂહોને નોંધે છે, જેથી વૃદ્ધિ વક્રોમાં પક્ષપાત આવે છે.
• ફ્લો સાઇટોમેટ્રી અને કોષ છટણીમાં ગઠ્ઠારૂપ કોષો સંબંધિત ઘટનાઓની ખોટી ગણતરી થાય છે અને તેમને વિશ્લેષણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવે છે.
• DNA અને પ્રોટીનના નિષ્કર્ષણો માત્ર સમૂહની સપાટી પરના કોષોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જેથી માઇક્રોબાયોમ અને ઓમિક્સ ડેટામાં પક્ષપાત આવે છે.

પરંપરાગત ઉપાયો ધીમા, અધૂરા અથવા રાસાયણિક ફેરફાર કરનારા હોય છે. જોરશોરથી પિપેટિંગ અને વોર્ટેક્સિંગ કરવા છતાં સૂક્ષ્મ સમૂહો બાકી રહી જાય છે. ઉત્સેચક અથવા કીલેટર આધારિત વિખેરણ કોષની એ સપાટીમાં ફેરફાર કરે છે જેનું તમે વિશ્લેષણ કરવા માગતા હોઈ શકો છો. નિયંત્રિત કેવિટેશન દ્વારા થતું યાંત્રિક વિસમૂહન સેકન્ડોમાં કાર્ય કરે છે અને તેમાં કોઈ ઉમેરકની જરૂર પડતી નથી.

સોનિકેશન કોષલયન કર્યા વિના કોષોને કેવી રીતે અલગ કરે છે

અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિસમૂહન યાંત્રિક મજબૂતાઈના તફાવતનો ઉપયોગ કરે છે. બેક્ટેરિયાના સમૂહો પ્રમાણમાં નબળા આંતરકોષીય બંધો અને કોષબાહ્ય મેટ્રિક્સથી જોડાયેલા હોય છે, જ્યારે અખંડ કોષ આવરણ નોંધપાત્ર રીતે વધુ કર્તન બળ સહન કરે છે. અંશાંકિત અલ્ટ્રાસાઉન્ડ નિલંબનમાં પ્રવેશે ત્યારે ધ્વનિક કેવિટેશન સૂક્ષ્મ પ્રવાહો, દબાણના સ્પંદનો અને કર્તન બળો ઉત્પન્ન કરે છે, જે સૌપ્રથમ સમૂહોની આંતરસપાટીઓ પર કાર્ય કરે છે. પટલો ફાટી જાય તે ઊર્જા સ્તરે પહોંચતાં પહેલાં જ ગઠ્ઠા, શૃંખલાઓ અને બાયોફિલ્મના ખંડો કર્તનથી અલગ પડી જાય છે (વિસમૂહન); પટલો ફાટવાની પ્રક્રિયા કોષલયન છે.

બેક્ટેરિયાના કોષોના ગઠ્ઠાનું અલ્ટ્રાસોનિક વિસમૂહન

વિસમૂહન કે કોષલયન – સોનિકેશનનાં પરિમાણો કેવી રીતે અસર કરે છે

તેનું વ્યવહારુ પરિણામ એ છે કે એક જ સાધનને જુદાં પરિમાણો પર ચલાવીને વિસમૂહન અને કોષલયન કરવામાં આવે છે. મધ્યમ કંપનવિસ્તાર, ટૂંકાં સ્પંદિત ચક્રો અને નિયંત્રિત તાપમાને તમને જીવંત એકલ કોષોનું નિલંબન મળે છે. કંપનવિસ્તાર, સોનિકેશનનો સમય અથવા નમૂનાનું તાપમાન વધારવાથી પ્રક્રિયા કોષાંતર્ગત લક્ષ્ય પદાર્થો મેળવવા માટેના સંપૂર્ણ કોષ વિઘટન તરફ વળે છે. Hielscher જનરેટરો તમને કંપનવિસ્તાર, શક્તિ, સ્પંદન અને ઊર્જા ઇનપુટ ચોકસાઈથી સેટ કરવા તથા પદ્ધતિ સાચવવા દે છે, જેથી જુદા નમૂનાઓ, સંચાલકો અને પ્રક્રિયા ચક્રોમાં વિસમૂહનનું પગલું પુનરુત્પાદિત કરી શકાય છે.

કાર્યક્ષમ બિનસંપર્ક સોનિકેશન

બાથ સોનિકેશન આ સ્તરના નિયંત્રણની બરાબરી કરી શકતું નથી. અલ્ટ્રાસોનિક સફાઈ બાથ અને ટાંકીઓ માત્ર ઓછી અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા પૂરી પાડે છે, જેના પરિણામે નમૂનાની તૈયારી અધૂરી રહે છે, અને કેવિટેશન અસમાન રીતે થાય છે, તેથી દરેક ટ્યૂબની પ્રક્રિયા બાથમાં તેના સ્થાન અનુસાર થાય છે. VialTweeter તીવ્ર, કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસોનિક બળોને પાત્રની દીવાલ મારફતે સીધાં એકસાથે 10 સુધીના સીલબંધ નમૂનાઓમાં પ્રસારિત કરે છે. બાથમાં લાંબા અને બદલાતા અવધિના સંપર્કની જરૂર પડતી પ્રક્રિયાઓ પ્રમાણિત સ્પંદન પદ્ધતિમાં પૂર્ણ થાય છે.
Hielscher બિનસંપર્ક સોનિકેટરો બંધ વાયલોની દીવાલો મારફતે તીવ્ર, કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસાઉન્ડ લાગુ કરે છે. VialTweeter એકસાથે 10 સુધીની વાયલોની સમાન તીવ્રતાએ પ્રક્રિયા કરે છે, જેમાં નમૂનામાં કોઈ પ્રોબ હોતો નથી, પરસ્પર દૂષણ થતું નથી અને એરોસોલ બહાર નીકળતા નથી. જ્યાં નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાની જરૂરિયાત હોય છે, ત્યાં UIP400MTP અને UIP550MTP માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટરો આ જ નિયંત્રિત ઊર્જા સ્થાનાંતરણને મલ્ટી-વેલ પ્લેટો સુધી વિસ્તારે છે.

સંપર્કરહિત અલ્ટ્રાસોનિક કોષસમૂહ વિઘટનના ફાયદા

• શૂન્ય પરસ્પર દૂષણ: વાયલ સતત બંધ રહે છે અને નમૂનામાં કોઈ પ્રોબ ડુબાડવામાં આવતો નથી, તેથી પરસ્પર દૂષણ અને નમૂનાની હાનિ સંપૂર્ણપણે ટળે છે. એક નમૂના પછી બીજા નમૂનાની પ્રક્રિયા કરતાં પહેલાં કંઈ પણ નિર્જીવાણુકૃત કરવાની જરૂર રહેતી નથી, અને એક પ્રક્રિયાચક્ર પછીના પ્રક્રિયાચક્રને અસર કરી શકતું નથી.
• એરોસોલથી રક્ષણ: ખુલ્લા પ્રોબ વડે સોનિકેશન કરવાથી ચેપી એરોસોલ ઉત્પન્ન થાય છે અને સાધનની સપાટીઓ દૂષિત થાય છે. સીલબંધ વાયલમાં સોનિકેશન કરવાથી નમૂનો તેની પોતાની ટ્યુબની અંદર જ સીમિત રહે છે, જે Mycobacterium tuberculosis જેવા રોગકારક બેક્ટેરિયા અને અન્ય BSL-2 અથવા BSL-3 જૈવિક કારકો સાથે કામ કરતી વખતે મહત્વનું છે.
• પ્રોબની ટોચનું ઘસાવું નહીં: કાર્ય દરમિયાન ટાઇટેનિયમ પ્રોબમાંથી સૂક્ષ્મકણોની થોડી માત્રા નમૂનામાં છૂટી શકે છે. આ કણો ત્યારબાદના વિશ્લેષણમાં પ્રકાશીય ઘનતા અને કણોની ગણતરી બદલી નાખે છે. પાત્રની દીવાલ મારફતે પરોક્ષ સોનિકેશન કરવાથી ઘન પદાર્થોના આ સ્રોતને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવામાં આવે છે.
• સમાન નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતા: VialTweeter 10 જેટલી વાયલમાંથી દરેકને સમાન અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તીવ્રતા પૂરી પાડે છે, તેથી સોનિકેશનના પરિણામો એકસરખાં અને પુનરુત્પાદનક્ષમ હોય છે. બાથ અને એક સમયે એક નમૂનામાં પ્રોબના ઉપયોગને અસર કરતી સ્થાનસંબંધિત અસરો દૂર થાય છે, અને પુનરાવર્તિત નમૂનાઓમાં તમારા આધારરેખા મૂલ્યો તુલનાયોગ્ય રહે છે.
• નમૂનાની અખંડિતતા: સમગ્ર પ્રક્રિયા દરમિયાન ટ્યુબ બંધ રહે છે, તેથી નમૂનો દૂષિત થઈ શકતો નથી, બગડી શકતો નથી કે બાષ્પીભવન દ્વારા ઊડી જઈ શકતો નથી. નાની માત્રાના નમૂનાઓનું મંદન કર્યા વિના પ્રક્રિયાકરણ કરી શકાય છે, જેમાં એવા મૂલ્યવાન ક્લિનિકલ પેલેટ પણ સામેલ છે, જેમના માટે વધારાનું સ્થાનાંતરણ પગલું પોસાય તેમ નથી.
• પ્રક્રિયાનું નિયંત્રણ: કંપનવિસ્તાર 20 થી 100% સુધી અને પલ્સ મોડ 0 થી 100% સુધી સમાયોજિત કરી શકાય છે, અને સિસ્ટમોમાં તાપમાનની દેખરેખની સુવિધા છે, જેથી તાપસંવેદનશીલ સૂક્ષ્મજીવ પ્રભેદો અને પ્રોટીન નુકસાનકારક મર્યાદાઓથી નીચે રહે છે.

સામાન્ય ઉપયોગો

• માઇક્રોબાયોમ અને આંતરડાની સામગ્રીનું વિશ્લેષણ: પ્લેટિંગ અથવા સિક્વેન્સિંગ પહેલાં Lactobacillus, Bifidobacterium અને મળના નમૂનાઓને વિખેરવામાં આવે છે, જેથી કોષોના ગઠ્ઠાઓને કારણે ગણતરી ઓછી ન આવે.
• ખાદ્ય અને જળ સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન: કોલોનીની સંખ્યા અને જીવંતતા ચોક્કસ રીતે નક્કી કરવા માટે સ્વેબ, ધોવાણ પ્રવાહી અને સંવર્ધન બ્રોથમાં રહેલા ફ્લોક્સને વિખેરવામાં આવે છે.
• બાયોફિલ્મ સંશોધન: સપાટીના પ્રોટીન દૂર કરી નાખે તેવી એન્ઝાઇમ આધારિત પ્રક્રિયા વિના, વાહકો અને સપાટીઓ પરથી કોષોને એકલ-કોષ નિલંબનના સ્વરૂપમાં પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવે છે.
• ક્લિનિકલ નિદાન: જૈવિક સામગ્રીને નિયંત્રિત પરિસરમાં સીમિત રાખતી પરિસ્થિતિઓ હેઠળ ગળફા, પરુ અને સ્વેબમાંથી પ્રક્ષાલિત પ્રવાહીમાં રહેલી સામગ્રીને ફરી નિલંબિત કરવામાં આવે છે.
• કોષ સંવર્ધન: ગણતરી અને પાસેજિંગ પહેલાં ગઠ્ઠા થયેલા સસ્તન પ્રાણીઓના, કીટકોના અને CHO કોષસમૂહોને અલગ કરવામાં આવે છે.
• સમગ્ર કાર્યપ્રવાહની તૈયારી: ઓછા કંપનવિસ્તારે કોષસમૂહોને વિખેરતું એ જ સાધન વધુ ઊંચી સેટિંગ્સ પર સંપૂર્ણ કોષભંજન કરે છે, તેથી ટ્યુબ વચ્ચે નમૂનાનું સ્થાનાંતરણ કર્યા વિના ત્યારબાદ કોષલયન, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને DNA ખંડન કરી શકાય છે.

સાહિત્ય / સંદર્ભો

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.