બાયોફિલ્મ અને પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણમાં Hielscher મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સનો ઉપયોગ કરતો પ્રોટોકોલ

VialTweeter Multi-Tube Sonicator અને UIP400MTP Microplate Sonicator જેવા મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સનો ઉપયોગ વધુ સંખ્યામાં નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરવાની જરૂરિયાત ધરાવતા અનુપ્રયોગો માટે પ્રયોગશાળાની કાર્યપ્રણાલીઓને સુવ્યવસ્થિત બનાવે છે. બંને ઉપકરણો અનેક નમૂનાઓમાં ચોક્કસ અને એકસમાન અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયા કરવાની સુવિધા આપે છે, જેથી પરિવર્તનશીલતા ઘટે છે અને પુનરુત્પાદકતા વધે છે. આ ખાસ કરીને એવા પ્રયોગોમાં લાભદાયી છે જેમાં નમૂનાઓનું સુસંગત કોષલયન, બાયોફિલ્મનું વિયોજન, પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ અથવા પ્રોટીનવિઘટક પાચન જરૂરી હોય છે અને જ્યાં હસ્તચાલિત અથવા એક સમયે એક નમૂનાની પ્રક્રિયા કરતી પદ્ધતિઓ ઓછી કાર્યક્ષમ હોય છે અને અસંગતતા થવાની સંભાવના ધરાવે છે.

મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સ વડે કાર્યપ્રણાલીઓને સુવ્યવસ્થિત બનાવો

ઉદાહરણ તરીકે, UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટના વેલ્સમાં એકસાથે અલ્ટ્રાસોનિક ઉપચાર કરવાનું શક્ય બનાવે છે, જેથી બાયોફિલ્મ અથવા કોષીય પદાર્થનું એકસમાન વિયોજન સુનિશ્ચિત થાય છે. તે જ સમયે, VialTweeter અનેક ટ્યુબમાં રહેલા નમૂનાઓનું પરસ્પર દૂષણ વિના ચોક્કસ કોષલયન અને સમાનાંગીકરણ કરવાની સુવિધા આપે છે. આ સોનિકેટર્સ પ્રક્રિયાનો સમય નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડે છે, પ્રયોગોની પુનરુત્પાદકતા સુધારે છે અને નમૂનાઓની ઉચ્ચ અખંડિતતા જાળવે છે, જેથી તેઓ સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન, પ્રોટિઓમિક્સ અને આણ્વિક જીવવિજ્ઞાનના સંશોધનમાં અનિવાર્ય સાધનો બને છે.
નીચે E. coli બાયોફિલ્મની રચના અને ત્યારબાદના પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણને લગતા અભ્યાસમાં Hielscher મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર મોડેલો VialTweeter Multi-Tube Sonicator અને Microplate Sonicator UIP400MTP નો ઉપયોગ દર્શાવતો વિગતવાર પ્રોટોકોલ આપેલો છે.

પ્રોટોકોલ: Hielscher મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સનો ઉપયોગ કરીને બાયોફિલ્મની રચના, વિયોજન અને પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણ

1. બેક્ટેરિયલ સંવર્ધનની તૈયારી

• E. coli બેક્ટેરિયા (સ્ટ્રેન W3110)નું સંવર્ધન 30°C પર કરો, જે E. coli બાયોફિલ્મની રચના માટે અનુકૂળ તાપમાન છે. આ માટે નીચેના ઘટકો ધરાવતું ટ્રિપ્ટોન બ્રોથ (TB) માધ્યમ વાપરો:
  – 10 g/L ટ્રિપ્ટોન
  – 5 g/L NaCl
• પ્લાઝ્મિડ જળવાઈ રહે તે સુનિશ્ચિત કરવા માટે જરૂર મુજબ એન્ટિબાયોટિક્સ ઉમેરો.
• સૂક્ષ્મદર્શકીય અને પ્રમોટર પ્રવૃત્તિના અભ્યાસો માટે, rplL પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ જીનોમિક એન્હાન્સ્ડ GFP (eGFP) રિપોર્ટર ધરાવતી W3110 E. coli સ્ટ્રેનનો ઉપયોગ કરો.
• વિવિધ પ્રમોટરો (દા.ત., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD )ની પ્રવૃત્તિઓ માપવા માટે તેમના GFP રિપોર્ટર પ્લાઝ્મિડોનો ઉપયોગ કરો.

2. બાયોફિલ્મનું સંવર્ધન અને વિયોજન

• 12-વેલ પ્લેટમાં (CellStar 12-well plates, Greiner Bio-One) દરેક વેલ દીઠ મંદ કરેલું 1.5 mL બેક્ટેરિયલ સંવર્ધન ઉમેરો.
• બાયોફિલ્મની રચના થવા દેવા માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• પ્લવકીય (ન ચોંટેલું) સંવર્ધન કાળજીપૂર્વક દૂર કરો.

– દરેક વેલને 500 µL PBS વડે ધુઓ.
– UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટરમાં 12-વેલ પ્લેટનું સોનિકેશન કરીને ચોંટેલા કોષોને અલગ કરો. UIP400MTP બધા વેલ્સમાં સુસંગત અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા પહોંચાડીને એકસમાન વિયોજન સુનિશ્ચિત કરે છે.
– સોનિકેશન સેટિંગ્સ: 60% કંપવિસ્તાર, ચક્ર મોડ: 60 sec ચાલુ / 30 sec બંધ.

3. કોષોનું એકત્રીકરણ અને કોષલયન

• અલગ કરેલા બાયોફિલ્મ કોષોને 4,500 g પર 5 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
• પેલેટ સ્વરૂપે એકત્ર થયેલા કોષોને PBS વડે ધુઓ.
• કોષોને 2% સોડિયમ લૌરોઇલ સાર્કોસિનેટ (SLS)ના 100 µLમાં ફરી નિલંબિત કરો અને 95°C પર 15 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• સંપૂર્ણ કોષલયન સુનિશ્ચિત કરવા માટે VialTweeter Multi-Tube Sonicator વડે સોનિકેશન કરો.
  – સોનિકેશન સેટિંગ્સ: 100% કંપવિસ્તાર, કુલ 10 minના સંચાલન સમય માટે 50 s ચાલુ / 10 s બંધ; નમૂનાઓને બરફ પર રાખો.

4. અપચયન અને આલ્કિલેશન

• ડાઇસલ્ફાઇડ બંધોનું અપચયન કરવા માટે 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ઉમેરો અને 95°C પર 15 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• 25°C પર 30 મિનિટ માટે 10 mM આયોડોએસિટામાઇડ વડે પ્રોટીનોનું આલ્કિલેશન કરો.

5. પ્રોટીનનું જથ્થાત્મક નિર્ધારણ અને પાચન

• અવશેષો દૂર કરવા માટે કોષલયનથી મળેલા દ્રાવણોને સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
• Pierce BCA Protein Assay Kit વડે પ્રોટીનના કુલ જથ્થાનું નિર્ધારણ કરો.
• 2% SLS અને 100 mM એમોનિયમ બાઇકાર્બોનેટ ધરાવતા દ્રાવણમાં 1 µg ટ્રિપ્સિન વડે કુલ 50 µg પ્રોટીનનું પાચન કરો.
• પાચન પ્રતિક્રિયાને 30°C પર આખી રાત ઇન્ક્યુબેટ કરો.

6. પેપ્ટાઇડનું શુદ્ધીકરણ

• 1.5% ટ્રાઇફ્લોરોએસિટિક એસિડ (TFA) ઉમેરીને SLSનું અવક્ષેપન કરો, ત્યારબાદ સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
• C18 માઇક્રોસ્પિન કૉલમો વડે પેપ્ટાઇડોનું શુદ્ધીકરણ કરો.
• શુદ્ધ કરેલા પેપ્ટાઇડોને સૂકવો અને 0.1% TFAમાં ફરી નિલંબિત કરો.

7. પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી–દળ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC nano સિસ્ટમ સાથે જોડાયેલા Q-Exactive Plus દળ સ્પેક્ટ્રોમીટર પર પેપ્ટાઇડોનું વિશ્લેષણ કરો.
• C18 રેઝિન (2.4 µm) ભરેલી રિવર્સ-ફેઝ HPLC કૉલમ (75 µm × 42 cm) વડે પેપ્ટાઇડોને અલગ કરો.
• 140 મિનિટ દરમિયાન દ્રાવક B (0.15% ફોર્મિક એસિડ ધરાવતું એસિટોનાઇટ્રાઇલ)નું પ્રમાણ 2%થી 35% સુધી ક્રમશઃ વધારો.
• ઉચ્ચ વિભેદનક્ષમતાવાળા MS સ્કેન અને ત્યારબાદ સૌથી વધુ તીવ્રતા ધરાવતા 10 આયનોના ટેન્ડમ MS/MS સ્કેન વડે ડેટા મેળવો.

8. ડેટાનું વિશ્લેષણ

• Progenesis સૉફ્ટવેર વડે કાચા LC-MS ડેટાની પ્રક્રિયા કરો.
• .mgf ફાઇલો નિકાસ કરો અને MASCOT વડે તેમનું વિશ્લેષણ કરો.
• ગુણવત્તા નિયંત્રણ અને ખોટી શોધો માટેના સમાયોજન માટે SafeQuant વડે પેપ્ટાઇડોનું જથ્થાત્મક નિર્ધારણ કરો.
• પુનરુત્પાદકતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે બધા પ્રયોગો બે અથવા ત્રણ પુનરાવર્તનોમાં કરો.

વધુ સંખ્યામાં નમૂનાઓની તૈયારી માટે મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સ

મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર મોડેલો VialTweeter અને UIP400MTP પ્રાયોગિક કાર્યપ્રણાલીઓની ચોકસાઈ અને કાર્યક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરે છે, ખાસ કરીને બાયોફિલ્મ સંશોધન અને પ્રોટિઓમિક્સમાં. અનેક નમૂનાઓની એકસમાન પ્રક્રિયા કરવાની તેમની ક્ષમતા ડેટાની ગુણવત્તા સાથે સમાધાન કર્યા વિના વધુ સંખ્યામાં નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરવાની ક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરે છે. આ લાભો, ઉપર દર્શાવેલી સુવ્યવસ્થિત કાર્યપ્રણાલીઓ સાથે મળીને, Hielscher મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સને આધુનિક જૈવિક સંશોધન માટે આવશ્યક સાધનો બનાવે છે.

ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને પરામર્શ – જર્મનીમાં નિર્મિત ગુણવત્તા

Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ તેમની સર્વોચ્ચ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇનનાં ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ સંચાલનને કારણે અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સને ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં સરળતાથી સંકલિત કરી શકાય છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ કઠોર પરિસ્થિતિઓ અને પડકારજનક વાતાવરણમાં સરળતાથી કાર્ય કરે છે.

Hielscher Ultrasonics એક ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી તથા વપરાશકર્તા-મૈત્રીપૂર્ણ સુવિધાઓ ધરાવતા ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA તથા RoHsની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરે છે.