FFPEમાંથી પેરાફિન દૂર કરવું અને પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ

VialTweeter મલ્ટી-ટ્યુબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર વડે પેરાફિન દૂર કરવાની, દ્રાવ્ય બનાવવાની અને સોનિકેશનની પ્રક્રિયાઓના સુનિયોજિત સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને ફોર્માલિનથી સ્થિરીકૃત અને પેરાફિનમાં સમાવિષ્ટ (FFPE) પેશીના છેદોમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ સરળ બનાવો. આ પ્રોટોકોલ અનુવર્તી માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી આધારિત પ્રોટીઓમિક્સને સમર્થન આપે છે અને SP3 શુદ્ધીકરણ તથા ઉત્સેચકીય પાચનની કાર્યપ્રણાલીઓ સાથે સુસંગત છે.

આ માનક કાર્યપદ્ધતિ (SOP) ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને FFPE પેશીના નમૂનાઓનું પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ કરતા પ્રયોગશાળાના કર્મચારીઓ માટે છે. તેને VialTweeter Multi-Tube Sonicator વડે સમાંતર પ્રક્રિયા કરાતા દસ સુધીના FFPE નમૂનાઓ માટે અનુકૂળ બનાવવામાં આવી છે.

પ્રોટોકોલ: VialTweeter વડે FFPE નમૂનાઓમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ

સામગ્રી અને અભિકર્મકો

અભિકર્મકો

• ઝાયલીન (હિસ્ટોલોજી ગ્રેડ)
• ઇથેનોલ (નિરપેક્ષ 96%)
• લાયસિસ બફર:

6 M ગ્વાનિડિન હાઇડ્રોક્લોરાઇડ
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (ટ્રિસ(2-કાર્બોક્સીઇથાઇલ)ફોસ્ફીન)
40 mM CAA (2-ક્લોરોએસિટામાઇડ)

• પ્રોટીએઝ અવરોધક (વૈકલ્પિક; દા.ત., cOmplete™ mini EDTA-free)

ઉપકરણો

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1.5 mL અથવા 2.0 mLની ઓછી બંધનક્ષમતાવાળી માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબો
• હીટ બ્લોક અથવા ઇન્ક્યુબેટર (95°C અને 80°C સેટિંગ્સ)
• માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ
• થર્મોમિક્સર (વૈકલ્પિક, પરંતુ ભલામણ કરાયેલ)

પ્રારંભિક નમૂનાની માત્રા

• દરેક નમૂના દીઠ (એટલે કે, દરેક વાયલ દીઠ) 10 µm જાડાઈની FFPE પેશીના 1–2 છેદ

અથવા

• દરેક નમૂના દીઠ (એટલે કે, દરેક વાયલ દીઠ) કુલ ~100 µg પેશી

નોંધ: પેરાફિનના કચરાથી થતું દૂષણ ઓછામાં ઓછું રાખવા માટે માઇક્રોટોમીમાં નવી બ્લેડનો ઉપયોગ કરો.

પ્રક્રિયા

1. પેરાફિન દૂર કરવું
   1. FFPE છેદોને ઓછી બંધનક્ષમતાવાળી માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબોમાં સ્થાનાંતરિત કરો.
   2. 1 mL ઝાયલીન ઉમેરો અને થોડા સમય માટે વોર્ટેક્સ કરો.
   3. ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
   4. 14,000 × g પર 2 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો; ઉપરનું પ્રવાહી કાઢી નાખો.
   5. ઝાયલીનથી ધોવાની પ્રક્રિયા વધુ એક વાર કરો (પગલાં 2–4).
   6. તળિયે જમા થયેલા અવક્ષેપને 1 mL 96% ઇથેનોલથી ધુઓ, વોર્ટેક્સ કરો અને ત્યારબાદ 14,000 × g પર 2 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો. ઉપરનું પ્રવાહી કાઢી નાખો.
   7. ઇથેનોલથી ધોવાની પ્રક્રિયા વધુ એક વાર કરો (ઇથેનોલથી કુલ 2 વાર ધોવું).
   8. અવશેષ ઇથેનોલનું બાષ્પીભવન કરવા માટે ઢાંકણાં ખુલ્લાં રાખીને અવક્ષેપને ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે હવામાં સૂકવો.
2. પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ અને સોનિકેશન
   1. દરેક સૂકા અવક્ષેપમાં 200 µL લાયસિસ બફર ઉમેરો.

      નોંધ: સોનિકેટરમાં 1 mL સુધીનું આયતન સમાવી શકાય છે, છતાં અનુવર્તી પ્રક્રિયા માટે 200 µL શ્રેષ્ઠ છે.

   2. વોર્ટેક્સ કરીને અથવા હળવેથી પિપેટિંગ કરીને મિશ્રિત કરો.
3. પ્રથમ ઉષ્મીય ઇન્ક્યુબેશન
   1. થર્મોમિક્સર અથવા હીટ બ્લોકનો ઉપયોગ કરીને 400 rpm પર હલાવતા રહીને ટ્યુબોને 95 °C પર 30 min માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
   2. નમૂનાઓને ઓરડાના તાપમાને 5 min માટે ઠંડા થવા દો.
4. VialTweeter વડે પ્રથમ સોનિકેશન
   1. ટ્યુબોને VialTweeter માં મૂકો.
   2. VialTweeter UP200St માટે નીચે આપેલાં મૂલ્યો સેટ કરો અને સોનિકેશન કરો.
સોનિકેટરનાં સેટિંગ્સ
• કંપનવિસ્તાર (A) 100% પર સેટ કરો
• સ્પંદન મોડ (C) 100% પર સેટ કરો
• આવર્તન ઘડિયાળ: ચાલુ
• ચાલુ રહેવાનો સમય: 60s
• બંધ રહેવાનો સમય: 30s
• મર્યાદા મૂલ્ય: 15 min (10 ચક્રને અનુરૂપ)
(ગણતરીની નોંધ: (60 s ચાલુ + 30 s બંધ) × 10 ચક્ર = 900 s = 15 min)
5. બીજું ઉષ્મીય ઇન્ક્યુબેશન
   ટ્યુબોને બહાર કાઢો અને ફરીથી 95 °C પર 15 min માટે, 400 rpm પર ઇન્ક્યુબેટ કરો.
6. બીજું સોનિકેશન
   એ જ સેટિંગ્સનો (ઉપર મુજબ) ઉપયોગ કરીને VialTweeter પર વધુ 10 ચક્ર માટે (કુલ 15 min) સોનિકેશન ફરીથી કરો.
7. લાયસેટનું સ્પષ્ટીકરણ
   1. નમૂનાઓને 23°C (ઓરડાના તાપમાન) પર 13,000 × g પર 10 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
   2. ઉપરનું પ્રવાહી કાળજીપૂર્વક નવી 2.0 mL Safe-lock Eppendorf ટ્યુબમાં એકત્રિત કરો. અવક્ષેપ ખલેલ ન પામે તેનું ધ્યાન રાખો.
8. અનુવર્તી પ્રક્રિયા
   લાયસેટ હવે SP3 શુદ્ધીકરણ અને ઉત્સેચકીય પાચન માટે તૈયાર છે.

નોંધો અને શ્રેષ્ઠ કાર્યપદ્ધતિઓ

1. પ્રોગ્રામ કરેલા ચાલુ/બંધ ચક્રો દ્વારા સોનિકેશન દરમિયાન અતિશય ગરમ થવાનું જોખમ ઘટાડવામાં આવે છે.
2. પ્રોટીનનું એકત્રીકરણ અટકાવવા માટે સોનિકેશન પછી વોર્ટેક્સ કરવાનું ટાળો.

કચરાનો નિકાલ અને સલામતી

નીચેનું કોષ્ટક અમારા પ્રયોગશાળાના કદના અલ્ટ્રાસોનિકેટરોની અંદાજિત પ્રક્રિયા ક્ષમતાનો ખ્યાલ આપે છે: