FFPE માંથી ડિપેરાફિનાઇઝેશન અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

VialTweeter મલ્ટી-ટ્યુબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર સાથે ડિપેરાફિનાઇઝેશન, સોલ્યુબિલાઇઝેશન અને સોનિકેશનના ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને ફોર્મેલિન-ફિક્સ્ડ પેરાફિન-એમ્બેડેડ (FFPE) ટીશ્યુ સેક્શનમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની સુવિધા આપો. આ પ્રોટોકોલ ડાઉનસ્ટ્રીમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી-આધારિત પ્રોટીઓમિક્સનું સમર્થન કરે છે અને SP3 સફાઈ અને એન્ઝાઇમેટિક પાચન વર્કફ્લો સાથે સુસંગત છે.

આ SOP ઉચ્ચ-પ્રદર્શન સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને FFPE પેશીના નમૂનાઓના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાં સામેલ પ્રયોગશાળા કર્મચારીઓ માટે બનાવાયેલ છે. તે VialTweeter મલ્ટી-ટ્યુબ સોનિકેટરનો ઉપયોગ કરીને સમાંતર પ્રક્રિયા કરાયેલા દસ FFPE નમૂનાઓ માટે ઑપ્ટિમાઇઝ થયેલ છે.

પ્રોટોકોલ: VialTweeter નો ઉપયોગ કરીને FFPE નમૂનાઓમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

સામગ્રી અને રીએજન્ટ્સ

રીએજન્ટ

• ઝાયલીન (હિસ્ટોલોજી ગ્રેડ)
• ઇથેનોલ (સંપૂર્ણ 96%)
• લિસિસ બફર:

6 એમ ગુઆનીડાઇન હાઇડ્રોક્લોરાઇડ
૫૦ મીમી ટ્રિસ-એચસીએલ, પીએચ ૮.૫
૧૦ મીમી ટીસીઇપી (ટ્રિસ(૨-કાર્બોક્સિથાઇલ)ફોસ્ફાઇન)
40 મીમી CAA (2-ક્લોરોએસેટામાઇડ)

• પ્રોટીઝ અવરોધક (વૈકલ્પિક; દા.ત., cOmplete™ મીની EDTA-મુક્ત)

સાધનસામગ્રી

• વાયલટ્વીટર મલ્ટી-ટ્યુબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર
• ૧.૫ મિલી અથવા ૨.૦ મિલી ઓછી બંધનકર્તા માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ
• હીટ બ્લોક અથવા ઇન્ક્યુબેટર (95°C અને 80°C સેટિંગ્સ)
• માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ
• થર્મોમિક્સર (વૈકલ્પિક પણ ભલામણ કરેલ)

નમૂના ઇનપુટ

• પ્રતિ નમૂના (એટલે કે, પ્રતિ શીશી) 10 µm જાડા FFPE પેશીઓના 1-2 ભાગો

અથવા

• પ્રતિ નમૂના (એટલે કે, પ્રતિ શીશી) કુલ ~100 µg પેશી

નોંધ: પેરાફિન કાટમાળના દૂષણને ઓછું કરવા માટે માઇક્રોટોમી માટે તાજા બ્લેડનો ઉપયોગ કરો.

પ્રક્રિયા

1. ડિપેરાફિનાઇઝેશન
   1. FFPE વિભાગોને લો-બાઇન્ડિંગ માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં ટ્રાન્સફર કરો.
   2. ૧ મિલી ઝાયલીન ઉમેરો, થોડા સમય માટે વમળ ફેરવો.
   3. ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઉકાળો.
   4. 2 મિનિટ માટે 14,000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ; સુપરનેટન્ટ કાઢી નાખો.
   5. ઝાયલીન ધોવાનું ફરી એક વાર પુનરાવર્તન કરો (પગલાં 2-4).
   6. 96% ઇથેનોલ, વમળના 1 મિલી સાથે પેલેટ ધોવા, પછી 14,000 × g પર 2 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ. સુપરનેટન્ટ કાઢી નાખો.
   7. ફરી એકવાર ઇથેનોલ ધોવાનું પુનરાવર્તન કરો (કુલ 2 ઇથેનોલ ધોવા).
   8. શેષ ઇથેનોલનું બાષ્પીભવન કરવા માટે ખુલ્લા ઢાંકણા સાથે ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે હવામાં સૂકવવા માટે પેલેટ.
2. પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને સોનિકેશન
   1. દરેક સૂકા પેલેટમાં 200 µL લિસિસ બફર ઉમેરો.
      નોંધ: જોકે સોનિકેટર 1 મિલી સુધી સમાવી શકે છે, 200 µL ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ માટે શ્રેષ્ઠ છે.

   2. વમળ ફેરવીને અથવા હળવા પાઇપિંગ દ્વારા મિક્સ કરો.
3. પ્રથમ થર્મલ ઇન્ક્યુબેશન
   1. થર્મોમિક્સર અથવા હીટ બ્લોકનો ઉપયોગ કરીને 400 rpm પર આંદોલન સાથે 30 મિનિટ માટે 95 °C પર ટ્યુબને ઇન્ક્યુબ કરો.
   2. નમૂનાઓને ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે ઠંડુ થવા દો.
4. વાયલટ્વીટર સાથે પ્રથમ સોનિકેશન
   1. ટ્યુબ્સને VialTweeter માં મૂકો.
   2. VialTweeter UP200St ને નીચેના મૂલ્યો પર સેટ કરો અને સોનિકેટ કરો.
સોનિકેટર સેટિંગ્સ
• કંપનવિસ્તાર (A) ને 100% પર સેટ કરો
• પલ્સેશન મોડ (C) ને 100% પર સેટ કરો
• પીરિયડ ક્લોક: ચાલુ
• સમયસર: 60
• બંધ સમય: ૩૦ સેકન્ડ
• મર્યાદા મૂલ્ય: ૧૫ મિનિટ (૧૦ ચક્રને અનુરૂપ)
(ગણતરી નોંધ: (60 સેકન્ડ ચાલુ + 30 સેકન્ડ બંધ) × 10 ચક્ર = 900 સેકન્ડ = 15 મિનિટ)
5. બીજું થર્મલ ઇન્ક્યુબેશન
   નળીઓ દૂર કરો અને 95 °C પર 15 મિનિટ, 400 rpm માટે ફરીથી ઇન્ક્યુબેટ કરો.
6. બીજું સોનિકેશન
   વધારાના 10 ચક્ર (કુલ 15 મિનિટ) માટે સમાન સેટિંગ્સ (ઉપર મુજબ) નો ઉપયોગ કરીને VialTweeter પર સોનિકેશનનું પુનરાવર્તન કરો.
7. લાયસેટની સ્પષ્ટતા
   1. નમૂનાઓને 13,000 × g તાપમાને 23°C (રૂમના તાપમાન) પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
   2. સુપરનેટન્ટને કાળજીપૂર્વક એક નવી 2.0 મિલી સેફ-લોક એપેન્ડોર્ફ ટ્યુબમાં એકત્રિત કરો. પેલેટને ખલેલ પહોંચાડવાનું ટાળો.
8. ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ
   લાયસેટ હવે SP3 સફાઈ અને એન્ઝાઇમેટિક પાચન માટે તૈયાર છે.

નોંધો અને શ્રેષ્ઠ પ્રથાઓ

1. સોનિકેશન દરમિયાન ઓવરહિટીંગનું જોખમ પ્રોગ્રામ કરેલ ઓન/ઓફ સાયકલિંગ દ્વારા ઘટાડવામાં આવે છે.
2. પ્રોટીન એકત્રીકરણ અટકાવવા માટે સોનિકેશન પછી વમળ ટાળો.

કચરાનો નિકાલ અને સલામતી

નીચે આપેલ કોષ્ટક તમને અમારા લેબ-સાઇઝ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની અંદાજિત પ્રોસેસિંગ ક્ષમતાનો સંકેત આપે છે: