FFPE હાઇ-થ્રુપુટ નમૂના તૈયારી: પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને ન્યુક્લિક એસિડ શીયરિંગ

FAQ
નીચે, અમે વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નોના જવાબ આપીએ છીએ, જે FFPE પેશીની તૈયારી અને FFPE નમૂનાઓના અલ્ટ્રાસોનિકેશન માટે સંબંધિત છે.

FFPE પેશી કેવી રીતે તૈયાર થાય છે?

FFPE પેશીની તૈયારી માટેનાં પગલાં: તાજા પેશીની ઝીણવટભરી હેન્ડલિંગ અને પ્રોસેસિંગ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા FFPE નમૂનાઓ બનાવવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે. સચોટ ડાઉનસ્ટ્રીમ વિશ્લેષણ માટે સેલ્યુલર આર્કિટેક્ચર, ન્યુક્લિક એસિડ અને પ્રોટીનની જાળવણીની ખાતરી કરવી જરૂરી છે. દરેક પગલું — સંગ્રહથી લઈને એમ્બેડિંગ સુધી — હિસ્ટોલોજીકલ પરીક્ષા, ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને મોલેક્યુલર અભ્યાસ સહિત વિવિધ વિશ્લેષણો માટે નમૂનાની અખંડિતતા જાળવવા માટે ચોકસાઈની જરૂર છે. યોગ્ય રીતે ચલાવવામાં આવે છે, આ ફિક્સેશન અને એમ્બેડિંગ પ્રક્રિયા એ સુનિશ્ચિત કરે છે કે સચવાયેલી પેશીઓ વિવો સ્થિતિમાં ચોક્કસ પ્રતિબિંબિત કરે છે, વિશ્વસનીય નિદાન અને સંશોધન પરિણામોને સક્ષમ કરે છે.
અમે તમને FFPE ટીશ્યુ સેમ્પલની એમ્બેડિંગ પ્રક્રિયાના 6 મુખ્ય પગલાઓમાંથી પસાર કરીએ છીએ.

• પેશી સંગ્રહ
  જીવંત સસ્તન પ્રાણીઓની બાયોપ્સી અને ટીશ્યુ કલ્ચર એ FFPE નમૂનાની તૈયારી માટે તાજા પેશી મેળવવા માટે બંને સક્ષમ સ્ત્રોત છે.
  એસેપ્ટિક તકનીકનો ઉપયોગ કરવો મહત્વપૂર્ણ છે: દૂષણ ટાળવા માટે જંતુરહિત સાધનો અને મોજાઓનો ઉપયોગ કરો. આદર્શરીતે, જંતુરહિત વાતાવરણમાં પેશીઓ એકત્રિત કરો, જેમ કે સર્જિકલ સ્યુટ અથવા લેમિનર ફ્લો હૂડ.
  નમૂનો ખૂબ જ નાજુક હોવાથી, તેનું સંવેદનશીલ હેન્ડલિંગ આવશ્યક છે: પ્રક્રિયામાં વિલંબ ઓછો કરો અને કાપ્યા પછી તરત જ પેશીની પ્રક્રિયા શરૂ કરો. ઑટોલિસિસ અને અધોગતિને રોકવા માટે આ મહત્વપૂર્ણ છે. ઓરડાના તાપમાને પેશી રાખો; ઠંડું ટાળો કારણ કે તે બરફના સ્ફટિકની રચના અને પેશીઓને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે.
• ટીશ્યુ ફિક્સેશન
  સૌપ્રથમ, પેશીને ફિક્સેટિવ સોલ્યુશન વડે સારવાર આપવામાં આવે છે: 10% ન્યુટ્રલ-બફર્ડ ફોર્મેલિન (NBF) નો ઉપયોગ કરો, જે પાણીમાં 4% ફોર્માલ્ડિહાઈડની સમકક્ષ હોય છે, જે તટસ્થ pH પર બફર થાય છે.
  પેશીને સંપૂર્ણપણે ફોર્મેલિનમાં ડૂબી દો. ઓછામાં ઓછા 10:1 ના ફિક્સેટિવ-ટુ-ટિશ્યુ વોલ્યુમ રેશિયોની ખાતરી કરો. પેશીના પ્રકાર અને કદના આધારે ફિક્સેશનનો સમય સામાન્ય રીતે 6 થી 24 કલાકનો હોય છે. તે મહત્વનું છે કે ફિક્સેટિવ પેશીઓમાં સંપૂર્ણ રીતે પ્રવેશ કરી શકે છે. જો કે, ઓવર-ફિક્સેશન ક્રોસ-લિંકિંગ તરફ દોરી શકે છે જે એન્ટિજેન પુનઃપ્રાપ્તિને જટિલ બનાવે છે, જ્યારે અંડર-ફિક્સેશન નબળા પેશીઓની જાળવણીમાં પરિણમી શકે છે.
• ટીશ્યુ ટ્રિમિંગ
  બીજું, ફિક્સેટિવના પર્યાપ્ત ઘૂંસપેંઠને મંજૂરી આપવા માટે લગભગ 3-5 મીમીની જાડાઈમાં પેશીઓને ટ્રિમ કરો. સંબંધિત હિસ્ટોલોજિકલ સ્ટ્રક્ચર્સ મેળવવા માટે પેશીઓના યોગ્ય અભિગમની ખાતરી કરો. આ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયાને સરળ બનાવે છે જ્યારે પેશીનો પાછળથી વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.
• નિશ્ચિત નમૂનાની પ્રક્રિયા
  હવે, નિશ્ચિત પેશી નિર્જલીકૃત હોવી જોઈએ: ફિક્સેશન પછી, પેરાફિન મીણ દ્વારા સંપૂર્ણ પ્રવેશની ખાતરી કરવા માટે પેશીને નિર્જલીકૃત કરવાની જરૂર છે. પાણીને દૂર કરવા માટે ઇથેનોલ (70%, 80%, 90% અને 100%) ની શ્રેણીબદ્ધ શ્રેણીમાંથી પેશી પસાર કરો.
  ઝાયલીન સાથે ક્લિયરિંગ: પેરાફિન મીણ પાણીમાં અદ્રાવ્ય છે, પરંતુ ઝાયલીનમાં દ્રાવ્ય છે. તેથી, પેશીઓમાં રહેલા પાણીને ઝાયલીનથી બદલવું આવશ્યક છે. જો કે, ઝાયલીન પોતે પાણીમાં અદ્રાવ્ય છે પરંતુ આલ્કોહોલમાં દ્રાવ્ય છે, એક મધ્યવર્તી પગલાની જરૂર છે જ્યાં પાણીને પ્રથમ આલ્કોહોલ સાથે બદલવામાં આવે છે. ઇથેનોલને દૂર કરવા અને પેરાફિન ઘૂસણખોરી માટે પેશી તૈયાર કરવા માટે ઝાયલીન અથવા ઝાયલીન વિકલ્પમાં પેશીઓને નિમજ્જન કરો.
  પેરાફિનનો ઉપયોગ કરીને ઘૂસણખોરી: પીગળેલા પેરાફિન મીણમાં પેશીઓને એમ્બેડ કરો, સંપૂર્ણ ઘૂસણખોરીની ખાતરી કરો. સંપૂર્ણ ગર્ભાધાન સુનિશ્ચિત કરવા માટે આ પગલામાં સામાન્ય રીતે પેરાફિનમાં કેટલાક ફેરફારોનો સમાવેશ થાય છે.
• પેશી એમ્બેડિંગ
  આ પગલામાં, પેશીને ટીશ્યુ બ્લોકમાં મોલ્ડ કરવામાં આવે છે: પેશીને ઇચ્છિત ઓરિએન્ટેશન સાથે બીબામાં મૂકો અને તેના પર પીગળેલું પેરાફિન રેડો. ઓરડાના તાપમાને અથવા ઠંડા પ્લેટ પર ઠંડુ કરીને પેરાફિનને મજબૂત થવા દો.
• વિભાગીકરણ અને માઉન્ટિંગ
  માઇક્રોટોમી: એમ્બેડેડ પેશીના ટુકડા કરવા માટે, પેરાફિન બ્લોકમાંથી પાતળા ભાગો (સામાન્ય રીતે 4-5 માઇક્રોમીટર) કાપવા માટે માઇક્રોટોમનો ઉપયોગ કરો. પછી નમૂનાને માઉન્ટ કરવામાં આવે છે, અનુગામી સ્ટેનિંગ અને માઇક્રોસ્કોપિક વિશ્લેષણ માટે કાચની સ્લાઇડ્સ પર વિભાગો મૂકીને.
  છેલ્લે, હિસ્ટોલોજીની ગુણવત્તા તપાસો: યોગ્ય ફિક્સેશન અને પ્રોસેસિંગની ખાતરી કરવા માટે માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ પ્રથમ વિભાગોનું મૂલ્યાંકન કરો. પેશીના પ્રકાર અને અવલોકન કરેલ ગુણવત્તાના આધારે પ્રોટોકોલને જરૂર મુજબ સમાયોજિત કરો.

 
FFPE પેશીઓનો ઉપયોગ RNA, DNA અને પ્રોટીનને પુનઃપ્રાપ્ત કરવા તેમજ કેન્સર અથવા અન્ય રોગના ચિહ્નો શોધવા માટે કરી શકાય છે. તેઓને વર્ષો સુધી સંગ્રહિત કરી શકાય છે, અને સંશોધકો અને ડોકટરો નિદાન અને સંશોધન માટે પેશીના નમૂનાઓનો લાભ કેવી રીતે લે છે તેનો આવશ્યક ભાગ છે.

FFPE પેશીઓ સાથે સામાન્ય સમસ્યાઓ અને પડકારો શું છે?

ફોર્મેલિન-ફિક્સ્ડ, પેરાફિન-એમ્બેડેડ (FFPE) પેશીના નમૂનાઓનો વ્યાપકપણે સંશોધન અને નિદાનમાં ઉપયોગ થાય છે, પરંતુ તેઓ અનેક પડકારો અને સામાન્ય સમસ્યાઓ રજૂ કરે છે:

• બાયોમોલેક્યુલ્સનું અધોગતિ: લાંબા સમય સુધી ફિક્સેશન ડીએનએ, આરએનએ અને પ્રોટીનના અધોગતિ તરફ દોરી શકે છે, જે ડાઉનસ્ટ્રીમ એપ્લિકેશન્સ માટે ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા ન્યુક્લિક એસિડ અથવા પ્રોટીનને કાઢવાનું મુશ્કેલ બનાવે છે. પેશીઓની જાળવણી માટે યોગ્ય ફિક્સેશન (અંડર- અને ઓવર-ફિક્સેશન ટાળવું) જરૂરી છે.

ક્રોસ-લિંકિંગ: ફોર્મેલિન ફિક્સેશન પ્રોટીન અને ન્યુક્લિક એસિડના ક્રોસ-લિંકિંગનું કારણ બને છે, જે પરમાણુ વિશ્લેષણને અવરોધે છે અને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને અન્ય પરીક્ષણોની ચોકસાઈને અસર કરી શકે છે.

• એન્ટિજેન માસ્કિંગ: ફિક્સેશન પ્રક્રિયા એન્ટિજેનિક સાઇટ્સને માસ્ક કરી શકે છે, જે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને અન્ય રોગપ્રતિકારક પરીક્ષણોમાં એન્ટિબોડી બંધનકર્તાની અસરકારકતા ઘટાડે છે. આને વારંવાર એન્ટિજેન પુનઃપ્રાપ્તિની જરૂર પડે છે, એક પ્રક્રિયા જેના દ્વારા એપિટોપનું માસ્કિંગ ઉલટાવી દેવામાં આવે છે અને એપિટોપ-એન્ટિબોડી બંધન પુનઃસ્થાપિત થાય છે. જો કે, સંપૂર્ણ એન્ટિજેનિસિટી હંમેશા પુનઃસ્થાપિત કરી શકાતી નથી.
• વેરિયેબલ ફિક્સેશન ગુણવત્તા: ફિક્સેશન સમય અને પરિસ્થિતિઓમાં તફાવતો અસંગત નમૂનાની ગુણવત્તા તરફ દોરી શકે છે, જે પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા અને પરિણામોની તુલનાત્મકતાને અસર કરે છે. વિશ્વસનીય ફિક્સેશન પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરો અને અંડર- અને ઓવર-ફિક્સેશન ટાળો.
• ડીએનએ નુકસાન અને ફ્રેગમેન્ટેશન: FFPE નમૂનાઓનું ફોર્મેલિન ફિક્સેશન વિવિધ પ્રકારના DNA નુકસાનનું કારણ બની શકે છે, જેમાં સાયટોસિન ડિમિનેશન (C to T પરિવર્તન), ઓક્સિડેટીવ નુકસાન (દા.ત., 8-oxo-guanine જે G to T મ્યુટેશન તરફ દોરી જાય છે), તેમજ શારીરિક વિક્ષેપ જેમ કે નિક, ગાબડા, અને એબેસિક સાઇટ્સ જે ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિને અવરોધે છે. ફોર્મેલિન ફિક્સેશન પ્રક્રિયા ડીએનએના વિભાજનનું કારણ બની શકે છે, આનુવંશિક અને જીનોમિક વિશ્લેષણ જેમ કે પીસીઆર અને સિક્વન્સિંગને જટિલ બનાવી શકે છે.
• આરએનએ ગુણવત્તા: FFPE પેશીઓમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ ઘણીવાર ખંડિત અને રાસાયણિક રીતે સંશોધિત કરવામાં આવે છે, જે તેને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક વિશ્લેષણ કરવા માટે પડકારરૂપ બનાવે છે.
• પ્રોટીન ફેરફારો: ફોર્મેલિન પ્રોટીનમાં રાસાયણિક ફેરફારોને પ્રેરિત કરી શકે છે, તેમની રચના અને કાર્યને અસર કરે છે, જે પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાં દખલ કરી શકે છે.
• નમૂના પ્રક્રિયા કલાકૃતિઓ: એમ્બેડિંગ અને સેક્શનિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, યાંત્રિક તાણ અને ગરમી કલાકૃતિઓને રજૂ કરી શકે છે અને પેશીઓને વધુ નુકસાન પહોંચાડે છે.
• બેચ-ટુ-બેચ વેરીએબિલિટી: વિવિધ બેચ વચ્ચેના ફિક્સેશન અને એમ્બેડિંગ પ્રોટોકોલમાં ભિન્નતા પરિણામોમાં નોંધપાત્ર પરિવર્તનશીલતા તરફ દોરી શકે છે, જે અભ્યાસ વચ્ચેની તુલનાને જટિલ બનાવે છે.
• સ્ટોરેજ સમસ્યાઓ: FFPE બ્લોક્સનો લાંબા ગાળાનો સંગ્રહ સમય જતાં વધારાના અધોગતિ અને ન્યુક્લીક એસિડ અખંડિતતાના નુકશાન તરફ દોરી શકે છે, જે પૂર્વવર્તી અભ્યાસ માટે આર્કાઇવલ નમૂનાઓની કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે.

ઑપ્ટિમાઇઝ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને, સાવચેતીપૂર્વક નમૂનાનું સંચાલન કરવું અને અદ્યતન તકનીકોનો ઉપયોગ FFPE પેશીઓમાંથી મેળવેલા ડેટાની ગુણવત્તા અને વિશ્વસનીયતાને સુધારવામાં મદદ કરે છે.

FFPE અને સ્થિર પેશી વચ્ચે શું તફાવત છે?

એફએફપીઇ (ફોર્માલિન-ફિક્સ્ડ, પેરાફિન-એમ્બેડેડ) પેશીને પેશીને ઠીક કરવા માટે ફોર્મેલિનનો ઉપયોગ કરીને સાચવવામાં આવે છે અને પછી પેરાફિન મીણમાં એમ્બેડ કરવામાં આવે છે, જે ટીશ્યુ મોર્ફોલોજી જાળવી રાખીને ઓરડાના તાપમાને લાંબા ગાળાના સંગ્રહ માટે પરવાનગી આપે છે. તેનાથી વિપરિત, સ્થિર પેશી ઝડપથી ઠંડક દ્વારા સાચવવામાં આવે છે, જે ન્યુક્લીક એસિડ અને પ્રોટીનની અખંડિતતાને વધુ સારી રીતે જાળવી રાખે છે પરંતુ તેને ખૂબ ઓછા તાપમાને સંગ્રહની જરૂર પડે છે.

FFPE એમ્બેડિંગ માટે કયા રસાયણોનો ઉપયોગ થાય છે?

FFPE એમ્બેડિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા રસાયણોમાં સામાન્ય રીતે ફિક્સેશન માટે ફોર્મલિન અને એમ્બેડિંગ માટે પેરાફિન વેક્સનો સમાવેશ થાય છે. FFPE એમ્બેડિંગ માટે, પેશીઓને સામાન્ય રીતે ક્યાં તો 10% (v/v) ન્યુટ્રલ બફરડ ફોર્મલિન (FA) અથવા પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ પાવડરમાંથી બનાવેલ તાજી રીતે તૈયાર 4% (w/v) ફોર્માલ્ડિહાઇડ સોલ્યુશન (PFA) નો ઉપયોગ કરીને નિશ્ચિત કરવામાં આવે છે. ફોર્માલિન, જે પાણીમાં ફોર્માલ્ડિહાઇડનું દ્રાવણ છે, તેને પેશીના આકારવિજ્ઞાનને જાળવવા અને વધુ પડતા ક્રોસ-લિંકિંગને રોકવા માટે તટસ્થ pH પર બફર કરવામાં આવે છે. પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ આધારિત સોલ્યુશન ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રોટીન દ્વારા અસરકારક ફિક્સેશન પણ પ્રદાન કરે છે, જેનાથી પેરાફિન મીણમાં અનુગામી એમ્બેડિંગ માટે પેશીઓનું માળખું સ્થિર થાય છે. આ રસાયણો ફિક્સેશન અને એમ્બેડિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન પેશીઓની અખંડિતતા અને મોર્ફોલોજી જાળવવા માટે જરૂરી છે.

FFPE નમૂનાઓમાંથી પેરાફિન કેવી રીતે દૂર કરવામાં આવે છે?

FFPE નમૂનાઓમાંથી પેરાફિનને દૂર કરવા માટે, પેશીના વિભાગોને સામાન્ય રીતે ઝાયલીન ધોવાની શ્રેણીને આધિન કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ આલ્કોહોલની શ્રેણીબદ્ધ શ્રેણી અને અંતે પાણી દ્વારા રિહાઈડ્રેશન કરવામાં આવે છે. ઝાયલીન અત્યંત ઝેરી હોવાથી, શ્વસન સંબંધી સમસ્યાઓ, ત્વચાની બળતરા અને વારંવાર સંપર્કમાં આવવાથી સંભવિત લાંબા ગાળાની અસરો જેવા સ્વાસ્થ્ય માટે જોખમો ઉભી કરે છે, ઘણી પ્રયોગશાળાઓમાં અલ્ટ્રાસોનિક પેરાફિન દૂર કરવું એ આશાસ્પદ વિકલ્પ તરીકે ઉભરી રહ્યું છે. આ પદ્ધતિ ઝાયલીન જેવા ઝેરી દ્રાવકની જરૂરિયાત વિના પેરાફિનને અસરકારક રીતે અને સુરક્ષિત રીતે દૂર કરવા માટે તીવ્ર અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોનો ઉપયોગ કરે છે, જેનાથી પ્રયોગશાળાના કર્મચારીઓ માટે જોખમ ઓછું થાય છે અને સલામત કાર્યકારી વાતાવરણ ઊભું થાય છે.

સારા FFPE નમૂનાની ગુણવત્તા માટે મારે મારા પેશીઓને કેટલા સમય સુધી ઠીક કરવા જોઈએ?

ફિક્સેશન અવધિ માટે સામાન્ય ભલામણો સામાન્ય રીતે 24 થી 48 કલાક માટે ફોર્મેલિનમાં પેશીના નમૂનાઓ ફિક્સ કરવાનું સૂચન કરે છે. આ સમયગાળો સામાન્ય રીતે ટીશ્યુ મોર્ફોલોજી અને સેલ્યુલર સ્ટ્રક્ચર્સને જાળવવા માટે પૂરતો હોય છે જ્યારે ઓવર-ફિક્સેશનને ઘટાડે છે, જે ન્યુક્લીક એસિડ અને પ્રોટીનના અતિશય ક્રોસ-લિંકિંગ અને અધોગતિ તરફ દોરી શકે છે. જો કે, શ્રેષ્ઠ ફિક્સેશન સમય પેશીના કદ અને પ્રકારને આધારે બદલાઈ શકે છે, નાના અથવા વધુ નાજુક નમૂનાઓ માટે ટૂંકા ફિક્સેશન સમયની જરૂર પડે છે. ડાઉનસ્ટ્રીમ મોલેક્યુલર પૃથ્થકરણને જટિલ બનાવી શકે તેવા લાંબા સમય સુધી ફિક્સેશનને ટાળીને પેશી ઓટોલિસિસ અને ડિગ્રેડેશનને રોકવા માટે પર્યાપ્ત ફિક્સેશનને સંતુલિત કરવું મહત્વપૂર્ણ છે.