FFPE નમૂનાઓની હાઇ-થ્રુપુટ તૈયારી: પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને ન્યુક્લિક એસિડનું શિયરિંગ

વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નો
નીચે, અમે FFPE પેશીની તૈયારી અને FFPE નમૂનાઓના અલ્ટ્રાસોનિકેશનને લગતા વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નોના જવાબ આપીએ છીએ.

FFPE પેશી કેવી રીતે તૈયાર કરવામાં આવે છે?

FFPE ઊતક તૈયાર કરવાનાં પગલાં: ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા FFPE નમૂનાઓ બનાવવા માટે તાજા ઊતકનું અત્યંત કાળજીપૂર્વક સંચાલન અને પ્રક્રિયાકરણ કરવું નિર્ણાયક છે. ત્યારપછીનાં સચોટ વિશ્લેષણ માટે કોષીય સંરચના, ન્યુક્લિક ઍસિડ અને પ્રોટીનનું સંરક્ષણ સુનિશ્ચિત કરવું આવશ્યક છે. ઊતકવૈજ્ઞાનિક પરીક્ષણ, ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને આણ્વિક અભ્યાસો સહિતનાં વિવિધ વિશ્લેષણો માટે નમૂનાની અખંડિતતા જાળવવા દરેક પગલામાં – સંગ્રહથી લઈને એમ્બેડિંગ સુધી – ચોકસાઈ જરૂરી છે. યોગ્ય રીતે કરવામાં આવે ત્યારે, સ્થિરીકરણ અને એમ્બેડિંગની આ પ્રક્રિયા સંરક્ષિત ઊતક સજીવ શરીરમાંની સ્થિતિને સચોટ રીતે પ્રતિબિંબિત કરે તે સુનિશ્ચિત કરે છે, જેનાથી નિદાન અને સંશોધનનાં વિશ્વસનીય પરિણામો મેળવી શકાય છે.
અમે તમને FFPE ઊતકના નમૂનાઓની એમ્બેડિંગ પ્રક્રિયાનાં 6 મુખ્ય પગલાં સમજાવીએ છીએ.

• ઊતકનો સંગ્રહ
  જીવંત સસ્તન પ્રાણીઓમાંથી લેવાયેલી બાયોપ્સીઓ અને ઊતક સંવર્ધનો, બંને FFPE નમૂના તૈયાર કરવા માટે તાજા ઊતક મેળવવાના ઉપયોગી સ્રોતો છે.
  અસેપ્ટિક પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવો મહત્વપૂર્ણ છે: દૂષણ ટાળવા માટે જંતુરહિત સાધનો અને મોજાંનો ઉપયોગ કરો. આદર્શ રીતે, શસ્ત્રક્રિયા કક્ષ અથવા લેમિનાર ફ્લો હૂડ જેવા જંતુરહિત વાતાવરણમાં ઊતકો એકત્રિત કરો.
  નમૂનો ખૂબ નાજુક હોવાથી તેને અત્યંત કાળજીપૂર્વક સંભાળવો આવશ્યક છે: પ્રક્રિયાકરણમાં વિલંબ ઓછામાં ઓછો રાખો અને ઊતકને કાપીને કાઢ્યા પછી તરત જ તેની અનુગામી પ્રક્રિયા શરૂ કરો. સ્વલયન અને વિઘટન અટકાવવા માટે આ નિર્ણાયક છે. ઊતકને ઓરડાના તાપમાને રાખો; તેને થીજાવવાનું ટાળો, કારણ કે તેનાથી બરફના સ્ફટિકો બની શકે છે અને ઊતકને નુકસાન થઈ શકે છે.
• ઊતકનું સ્થિરીકરણ
  સૌપ્રથમ, ઊતકને સ્થિરીકારક દ્રાવણથી ઉપચારિત કરવામાં આવે છે: 10% તટસ્થ-બફરવાળા ફોર્માલિન (NBF)નો ઉપયોગ કરો, જે પાણીમાંના 4% ફોર્માલ્ડિહાઇડની સમકક્ષ હોય છે અને તટસ્થ pH સુધી બફર કરેલું હોય છે.
  ઊતકને ફોર્માલિનમાં સંપૂર્ણપણે ડુબાડો. સ્થિરીકારક અને ઊતકના ઘનફળનો ગુણોત્તર ઓછામાં ઓછો 10:1 હોય તે સુનિશ્ચિત કરો. ઊતકના પ્રકાર અને કદના આધારે સ્થિરીકરણનો સમય સામાન્ય રીતે 6 થી 24 કલાકનો હોય છે. સ્થિરીકારક ઊતકમાં સંપૂર્ણપણે પ્રવેશી શકે તે મહત્વપૂર્ણ છે. જોકે, અતિશય સ્થિરીકરણથી ક્રોસ-લિંકિંગ થઈ શકે છે, જે એન્ટિજનની પુનઃપ્રાપ્તિ મુશ્કેલ બનાવે છે, જ્યારે અપૂરતું સ્થિરીકરણ ઊતકના નબળા સંરક્ષણમાં પરિણમી શકે છે.
• ઊતકની કાપછાંટ
  બીજું, સ્થિરીકારક પૂરતા પ્રમાણમાં પ્રવેશી શકે તે માટે ઊતકની કાપછાંટ કરીને તેની જાડાઈ આશરે 3–5 mm રાખો. સંબંધિત ઊતકવૈજ્ઞાનિક સંરચનાઓ સમાવી શકાય તે માટે ઊતકનું યોગ્ય દિશામાં ગોઠવણ સુનિશ્ચિત કરો. પછીથી ઊતકનો વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગ કરવામાં આવે ત્યારે આ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયાને સરળ બનાવે છે.
• સ્થિરીકૃત નમૂનાનું પ્રક્રિયાકરણ
  હવે, સ્થિરીકૃત ઊતકનું નિર્જલીકરણ કરવું જરૂરી છે: સ્થિરીકરણ પછી, પેરાફિન મીણ સંપૂર્ણપણે પ્રવેશી શકે તે સુનિશ્ચિત કરવા માટે ઊતકમાંથી પાણી દૂર કરવું જરૂરી છે. પાણી દૂર કરવા માટે ઊતકને ઇથેનોલની ક્રમશઃ વધતી સાંદ્રતાવાળી શ્રેણીમાંથી (70%, 80%, 90% અને 100%) પસાર કરો.
  ઝાયલિન વડે ક્લિયરિંગ: પેરાફિન મીણ પાણીમાં અદ્રાવ્ય છે, પરંતુ ઝાયલિનમાં દ્રાવ્ય છે. તેથી, ઊતકમાં રહેલા પાણીનું સ્થાન ઝાયલિનથી લેવું જરૂરી છે. જોકે, ઝાયલિન પોતે પાણીમાં અદ્રાવ્ય છે પરંતુ આલ્કોહોલમાં દ્રાવ્ય છે, તેથી એક મધ્યવર્તી પગલું જરૂરી છે જેમાં પહેલાં પાણીનું સ્થાન આલ્કોહોલથી લેવામાં આવે છે. ઇથેનોલ દૂર કરવા અને ઊતકને પેરાફિનના અંતઃપ્રવેશ માટે તૈયાર કરવા માટે ઊતકને ઝાયલિન અથવા ઝાયલિનના વિકલ્પમાં ડુબાડો.
  પેરાફિનનો ઉપયોગ કરીને અંતઃપ્રવેશ: સંપૂર્ણ અંતઃપ્રવેશ સુનિશ્ચિત કરીને ઊતકને પીગળેલા પેરાફિન મીણમાં એમ્બેડ કરો. આ પગલામાં સામાન્ય રીતે ઊતક પેરાફિનથી સંપૂર્ણપણે વ્યાપ્ત થાય તે સુનિશ્ચિત કરવા માટે પેરાફિનને ઘણી વાર બદલવામાં આવે છે.
• ઊતકનું એમ્બેડિંગ
  આ પગલામાં, ઊતકને ઢાળીને ઊતકનો બ્લોક બનાવવામાં આવે છે: ઊતકને ઇચ્છિત દિશામાં ગોઠવીને બીબામાં મૂકો અને તેના પર પીગળેલું પેરાફિન રેડો. ઓરડાના તાપમાને અથવા ઠંડી પ્લેટ પર ઠંડું કરીને પેરાફિનને ઘન બનવા દો.
• પાતળા છેદ કાપવા અને સ્લાઇડ પર ગોઠવવા
  માઇક્રોટોમી: એમ્બેડ કરેલા ઊતકના પાતળા છેદ કાપવા માટે, માઇક્રોટોમનો ઉપયોગ કરીને પેરાફિન બ્લોકમાંથી પાતળા છેદ (સામાન્ય રીતે 4–5 માઇક્રોમીટર) કાપો. ત્યારબાદ, અનુગામી અભિરંજન અને સૂક્ષ્મદર્શકીય વિશ્લેષણ માટે છેદોને કાચની સ્લાઇડ પર મૂકીને નમૂનાનું માઉન્ટિંગ કરવામાં આવે છે.
  છેલ્લે, ઊતકવૈજ્ઞાનિક ગુણવત્તા તપાસો: યોગ્ય સ્થિરીકરણ અને પ્રક્રિયાકરણ સુનિશ્ચિત કરવા માટે શરૂઆતના છેદોનું સૂક્ષ્મદર્શક હેઠળ મૂલ્યાંકન કરો. ઊતકના પ્રકાર અને અવલોકિત ગુણવત્તાના આધારે જરૂરિયાત મુજબ કાર્યવિધિઓમાં ફેરફાર કરો.

 
FFPE ઊતકોનો ઉપયોગ RNA, DNA અને પ્રોટીન પુનઃપ્રાપ્ત કરવા તેમજ કેન્સર અથવા અન્ય રોગનાં ચિહ્નો શોધવા માટે થઈ શકે છે. તેમનો વર્ષો સુધી સંગ્રહ કરી શકાય છે, અને સંશોધકો તથા ડૉક્ટરો નિદાન અને સંશોધન માટે ઊતકના નમૂનાઓનો જે રીતે ઉપયોગ કરે છે તેમાં તેઓ આવશ્યક ભાગ ભજવે છે.

FFPE ઊતક સાથે સંકળાયેલી સામાન્ય સમસ્યાઓ અને પડકારો કયા છે?

ફોર્માલિનથી સ્થિરીકૃત, પેરાફિનમાં અંતઃસ્થાપિત (FFPE) ઊતકના નમૂનાઓનો સંશોધન અને નિદાનમાં વ્યાપક ઉપયોગ થાય છે, પરંતુ તેમની સાથે અનેક પડકારો અને સામાન્ય સમસ્યાઓ સંકળાયેલાં છે:

• જૈવઅણુઓનું વિઘટન: લાંબા સમય સુધી સ્થિરીકરણ કરવાથી DNA, RNA અને પ્રોટીનનું વિઘટન થઈ શકે છે, જેના કારણે અનુવર્તી ઉપયોગો માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા ન્યુક્લિક એસિડ અથવા પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરવું મુશ્કેલ બને છે. ઊતકની જાળવણી માટે યોગ્ય સ્થિરીકરણ (અપૂરતું અને અતિશય સ્થિરીકરણ ટાળવું) આવશ્યક છે.

ક્રોસ-લિંકિંગ: ફોર્માલિન દ્વારા સ્થિરીકરણ પ્રોટીન અને ન્યુક્લિક એસિડનું ક્રોસ-લિંકિંગ કરે છે, જે આણ્વિક વિશ્લેષણમાં અવરોધ ઊભો કરી શકે છે અને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી તથા અન્ય પરીક્ષણોની ચોકસાઈને અસર કરી શકે છે.

• પ્રતિજનનું આવરણ: સ્થિરીકરણની પ્રક્રિયા પ્રતિજનીય સ્થાનોને ઢાંકી શકે છે, જેના કારણે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને અન્ય રોગપ્રતિકારકવિજ્ઞાન સંબંધિત પરીક્ષણોમાં પ્રતિદ્રવ્ય બંધનની અસરકારકતા ઘટે છે. આ માટે ઘણી વાર પ્રતિજન પુનઃઅનાવરણની જરૂર પડે છે, જે એવી પ્રક્રિયા છે જેમાં એપિટોપનું આવરણ દૂર કરવામાં આવે છે અને એપિટોપ તથા પ્રતિદ્રવ્ય વચ્ચેનું બંધન પુનઃસ્થાપિત કરવામાં આવે છે. જોકે, સંપૂર્ણ પ્રતિજનતા હંમેશાં પુનઃસ્થાપિત થઈ શકે એવું નથી.
• સ્થિરીકરણની ગુણવત્તામાં પરિવર્તનશીલતા: સ્થિરીકરણના સમય અને પરિસ્થિતિઓમાં તફાવતથી નમૂનાની ગુણવત્તામાં અસંગતતા ઊભી થઈ શકે છે, જે પરિણામોની પુનરુત્પાદકતા અને તુલનાક્ષમતાને અસર કરે છે. સ્થિરીકરણ માટે વિશ્વસનીય કાર્યપદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરો અને અપૂરતું તથા અતિશય સ્થિરીકરણ ટાળો.
• DNAને નુકસાન અને તેનું ખંડન: FFPE નમૂનાઓનું ફોર્માલિન દ્વારા સ્થિરીકરણ DNAને વિવિધ પ્રકારનું નુકસાન પહોંચાડી શકે છે, જેમાં સાયટોસિનનું ડિએમિનેશન (C થી T ઉત્પરિવર્તનો), ઓક્સિડેટિવ નુકસાન (દા.ત., 8-oxo-guanine, જે G થી T ઉત્પરિવર્તનો તરફ દોરી જાય છે), તેમજ DNA પોલિમરેઝની સક્રિયતામાં અવરોધ ઊભો કરતી ભૌતિક ક્ષતિઓ, જેમ કે એક તંતુમાં કાપા, ખાલી જગ્યાઓ અને બેઝરહિત સ્થાનોનો સમાવેશ થાય છે. ફોર્માલિન દ્વારા સ્થિરીકરણની પ્રક્રિયા DNAનું ખંડન કરી શકે છે, જેના કારણે PCR અને અનુક્રમણ જેવા આનુવંશિક તથા જીનોમિક વિશ્લેષણો જટિલ બને છે.
• RNAની ગુણવત્તા: FFPE ઊતકોમાંથી નિષ્કર્ષિત RNA ઘણી વાર ખંડિત અને રાસાયણિક રીતે પરિવર્તિત હોય છે, જેના કારણે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળાં ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક વિશ્લેષણો કરવાં પડકારજનક બને છે.
• પ્રોટીનમાં પરિવર્તનો: ફોર્માલિન પ્રોટીનમાં રાસાયણિક પરિવર્તનો પ્રેરિત કરી શકે છે, જે તેમની રચના અને કાર્યને અસર કરે છે અને પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણોમાં અવરોધ ઊભો કરી શકે છે.
• નમૂનાની પ્રક્રિયાથી ઉદ્ભવતી કૃત્રિમ વિકૃતિઓ: અંતઃસ્થાપન અને પાતળા છેદ બનાવવાની પ્રક્રિયા દરમિયાન યાંત્રિક તાણ અને ગરમી કૃત્રિમ વિકૃતિઓ ઊભી કરી શકે છે અને ઊતકને વધુ નુકસાન પહોંચાડી શકે છે.
• બેચો વચ્ચેની પરિવર્તનશીલતા: વિવિધ બેચો વચ્ચે સ્થિરીકરણ અને અંતઃસ્થાપનની કાર્યપદ્ધતિઓમાં તફાવતથી પરિણામોમાં નોંધપાત્ર પરિવર્તનશીલતા ઊભી થઈ શકે છે, જેના કારણે અભ્યાસો વચ્ચેની તુલનાઓ જટિલ બને છે.
• સંગ્રહ સંબંધિત સમસ્યાઓ: FFPE બ્લૉકોના લાંબા ગાળાના સંગ્રહથી સમય જતાં વધુ વિઘટન અને ન્યુક્લિક એસિડની અખંડિતતામાં ઘટાડો થઈ શકે છે, જે ભૂતલક્ષી અભ્યાસો માટે સંગ્રહિત નમૂનાઓની ઉપયોગયોગ્યતાને અસર કરે છે.

અનુકૂળતમ બનાવેલી કાર્યપદ્ધતિઓનો ઉપયોગ, નમૂનાઓનું સાવચેતીપૂર્વક સંચાલન અને અદ્યતન તકનીકોનો પ્રયોગ FFPE ઊતકોમાંથી મેળવેલા ડેટાની ગુણવત્તા અને વિશ્વસનીયતા સુધારવામાં મદદ કરે છે.

FFPE અને હિમીકૃત ઊતક વચ્ચે શું તફાવત છે?

FFPE (ફોર્માલિનથી સ્થિરીકૃત, પેરાફિનમાં અંતઃસ્થાપિત) ઊતકને જાળવવા માટે પ્રથમ ફોર્માલિનનો ઉપયોગ કરીને સ્થિરીકૃત કરવામાં આવે છે અને ત્યારબાદ પેરાફિન મીણમાં અંતઃસ્થાપિત કરવામાં આવે છે, જેથી ઊતકનું આકારવિજ્ઞાન જાળવી રાખીને ઓરડાના તાપમાને લાંબા ગાળા સુધી સંગ્રહ કરી શકાય છે. તેની સરખામણીમાં, હિમીકૃત ઊતકને થીજવીને ઝડપથી જાળવવામાં આવે છે, જે ન્યુક્લિક એસિડ અને પ્રોટીનની અખંડિતતા વધુ સારી રીતે જાળવે છે, પરંતુ તેના માટે અત્યંત નીચા તાપમાને સંગ્રહ જરૂરી છે.

FFPE અંતઃસ્થાપન માટે કયાં રસાયણોનો ઉપયોગ થાય છે?

FFPE એમ્બેડિંગ માટે વપરાતાં રસાયણોમાં સામાન્ય રીતે સ્થિરીકરણ માટે ફોર્માલિન અને એમ્બેડિંગ માટે પેરાફિન મીણનો સમાવેશ થાય છે. FFPE એમ્બેડિંગ માટે, પેશીઓનું સ્થિરીકરણ સામાન્ય રીતે 10% (v/v) તટસ્થ બફરયુક્ત ફોર્માલિન (FA) અથવા પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ પાઉડરમાંથી તાજું તૈયાર કરેલું 4% (w/v) ફોર્માલ્ડિહાઇડ દ્રાવણ (PFA) વાપરીને કરવામાં આવે છે. ફોર્માલિન એ પાણીમાં ફોર્માલ્ડિહાઇડનું દ્રાવણ છે, જેને પેશીઓની આકારરચના જાળવવા અને અતિશય ક્રોસ-લિંકિંગ અટકાવવા માટે તટસ્થ pH પર બફર કરવામાં આવે છે. પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ આધારિત દ્રાવણ પણ પ્રોટીનનું ક્રોસ-લિંકિંગ કરીને અસરકારક સ્થિરીકરણ પૂરું પાડે છે, જેનાથી પેરાફિન મીણમાં અનુવર્તી એમ્બેડિંગ માટે પેશીની રચના સ્થિર થાય છે. સ્થિરીકરણ અને એમ્બેડિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન પેશીની અખંડિતતા અને આકારરચના જાળવવા માટે આ રસાયણો આવશ્યક છે.

FFPE નમૂનાઓમાંથી પેરાફિન કેવી રીતે દૂર કરવામાં આવે છે?

FFPE નમૂનાઓમાંથી પેરાફિન દૂર કરવા માટે, પેશીના છેદોને સામાન્ય રીતે ઝાયલીનથી ક્રમશઃ ધોવામાં આવે છે, ત્યારબાદ આલ્કોહોલની ક્રમશઃ બદલાતી સાંદ્રતાઓ અને અંતે પાણી દ્વારા તેમનું પુનર્જલીકરણ કરવામાં આવે છે. ઝાયલીન અત્યંત ઝેરી હોવાથી શ્વસન સંબંધી સમસ્યાઓ, ત્વચામાં બળતરા અને વારંવારના સંપર્કથી સંભવિત લાંબા ગાળાની અસરો જેવા આરોગ્ય સંબંધી જોખમો ઊભાં કરે છે, તેથી ઘણી પ્રયોગશાળાઓમાં અલ્ટ્રાસોનિક પેરાફિન નિષ્કાસન એક આશાસ્પદ વિકલ્પ તરીકે ઊભરી રહ્યું છે. આ પદ્ધતિ ઝાયલીન જેવા ઝેરી દ્રાવકોની જરૂર વિના પેરાફિનને કાર્યક્ષમ રીતે અને સુરક્ષિત રીતે દૂર કરવા માટે તીવ્ર અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોનો ઉપયોગ કરે છે, જેનાથી પ્રયોગશાળાના કર્મચારીઓ માટેનું જોખમ ઘટે છે અને વધુ સુરક્ષિત કાર્યપર્યાવરણ સર્જાય છે.

સારી FFPE નમૂના ગુણવત્તા માટે મારે મારી પેશીઓનું સ્થિરીકરણ કેટલા સમય સુધી કરવું જોઈએ?

સ્થિરીકરણના સમયગાળા માટેની સામાન્ય ભલામણો સામાન્ય રીતે પેશીના નમૂનાઓનું ફોર્માલિનમાં 24 થી 48 કલાક સુધી સ્થિરીકરણ કરવાનું સૂચવે છે. આ સમયગાળો સામાન્ય રીતે પેશીની આકારરચના અને કોષીય રચનાઓ જાળવવા માટે પૂરતો હોય છે, સાથે જ અતિશય સ્થિરીકરણને ન્યૂનતમ રાખે છે, જે અતિશય ક્રોસ-લિંકિંગ અને ન્યુક્લિક એસિડ તથા પ્રોટીનના વિઘટન તરફ દોરી શકે છે. જોકે, શ્રેષ્ઠ સ્થિરીકરણ સમય પેશીના કદ અને પ્રકારના આધારે બદલાઈ શકે છે, અને નાના અથવા વધુ નાજુક નમૂનાઓ માટે ટૂંકો સ્થિરીકરણ સમય જરૂરી હોય છે. પેશીના સ્વલયન અને વિઘટનને અટકાવવા માટે પૂરતું સ્થિરીકરણ કરવા અને અનુવર્તી આણ્વિક વિશ્લેષણોને જટિલ બનાવી શકે તેવા લાંબા સ્થિરીકરણને ટાળવા વચ્ચે સંતુલન જાળવવું અત્યંત જરૂરી છે.