Liposomien valmistus ultraäänellä

Ultraäänellä valmistetuilla liposomeilla on erittäin korkea kapseloitumistehokkuus, suuri kuormituskapasiteetti ja tasaisen pieni, pallomainen koko. Näin ultraäänellä valmistetut liposomit tarjoavat erinomaisen biologisen hyötyosuuden. Hielscher Ultrasonics tarjoaa ultraäänilaitteita lääkelaatuisien liposomien luotettavaan valmistukseen erä- ja jatkuvatoimisissa prosesseissa.

Ultraäänellä tapahtuvan liposomien valmistuksen edut

Ultraäänellä tapahtuva liposomikapselointi on tekniikka, jolla lääkkeitä tai muita terapeuttisia aineita kapseloidaan liposomien sisään ultraäänienergian avulla. Muihin liposomikapselointimenetelmiin verrattuna ultraäänikapseloinnilla on useita etuja, jotka tekevät siitä ylivoimaisen valmistustekniikan.

• Suuri kuormitus, korkea kapseloitumistehokkuus: Ultraäänellä tapahtuvan liposomien valmistuksen tiedetään tuottavan liposomeja, joissa on suuri määrä vaikuttavia aineita, esimerkiksi C-vitamiinia, lääkemolekyylejä jne. Samalla ultraäänikäsittelymenetelmällä saavutetaan korkea kapseloitumistehokkuus. Tämä tarkoittaa, että suuri prosenttiosuus vaikuttavasta aineesta kapseloituu ultraäänikäsittelyssä. Näin ultraäänikäsittely on erittäin tehokas menetelmä liposomien valmistukseen.
• Tasaisen pienet liposomit: Yksi ultraäänellä tapahtuvan liposomikapseloinnin eduista on sen kyky tuottaa erittäin tasalaatuisia liposomeja, joiden kokojakauma on kapea. Ultraäänienergian avulla suurempia liposomeja tai lipidiaggregaatteja voidaan hajottaa pienemmiksi, tasalaatuisemmiksi liposomeiksi. Tämä tekee liposomien koosta ja muodosta yhdenmukaisempia, mikä voi olla tärkeää lääkkeenannostelusovelluksissa, joissa hiukkasten koko voi vaikuttaa niiden farmakokinetiikkaan ja tehoon.
• Soveltuu kaikille molekyyleille: Toinen ultraäänellä tapahtuvan liposomikapseloinnin etu on sen kyky kapseloida laaja valikoima lääkkeitä ja muita terapeuttisia aineita. Tekniikalla voidaan kapseloida sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia lääkkeitä, mikä voi olla vaikeaa muilla menetelmillä. Lisäksi ultraäänienergialla voidaan kapseloida makromolekyylejä ja nanohiukkasia, jotka saattavat olla liian suuria kapseloitaviksi muilla menetelmillä.
• Nopea ja luotettava: Ultraäänellä tapahtuva liposomikapselointi on myös suhteellisen yksinkertainen ja nopea prosessi. Se ei edellytä voimakkaiden kemikaalien tai korkeiden lämpötilojen käyttöä. Nämä voivat olla haitallisia kapseloitaville terapeuttisille aineille.
• Mittakaavan kasvattaminen: Lisäksi tekniikan mittakaavaa voidaan helposti kasvattaa laajamittaista tuotantoa varten, mikä tekee siitä kustannustehokkaan vaihtoehdon lääkkeenannostelusovelluksiin.

Yhteenvetona ultraäänellä tapahtuva liposomikapselointi on ylivoimainen liposomikapselointitekniikka, koska sillä voidaan tuottaa tasalaatuisia liposomeja, joiden kokojakauma on kapea, kapseloida laaja valikoima terapeuttisia aineita ja hyödyntää menetelmän yksinkertaisuutta ja skaalautuvuutta.

Lipidikalvon muodostamisen ja sitä seuraavan uudelleenhydratoinnin jälkeen ultraäänikäsittelyllä edistetään vaikuttavien aineiden kapseloitumista liposomiin. Lisäksi ultraäänikäsittelyllä saavutetaan haluttu liposomikoko.

Liposomien valmistus ultraäänellä lääkkeitä ja kosmetiikkaa varten

Liposomit (lipidipohjaiset vesikkelit), transferosomit (erittäin muovautuvat liposomit), etosomit (erittäin muovautuvat vesikkelit, joiden alkoholipitoisuus on korkea) ja niosomit (synteettiset vesikkelit) ovat mikroskooppisia vesikkeleitä, joita voidaan valmistaa keinotekoisesti pallomaisiksi kantajiksi, joiden sisään vaikuttavia molekyylejä voidaan kapseloida. Näitä halkaisijaltaan 25–5000 nm:n vesikkeleitä käytetään usein lääkkeiden kantajina lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa esimerkiksi suun kautta tai paikallisesti tapahtuvaan lääkkeenannosteluun, geeniterapiaan ja immunisointiin. Ultraäänikäsittely on tieteellisesti osoitettu menetelmä erittäin tehokkaaseen liposomien valmistukseen. Yrityksen Hielscher ultraäänilaitteet tuottavat liposomeja, joissa on suuri määrä vaikuttavia aineita ja joilla on ylivoimainen biologinen hyötyosuus.

Liposomit ja liposomaalinen formulointi

Liposomit ovat unilamellaarisia, oligolamellaarisia tai multilamellaarisia vesikkelijärjestelmiä, ja ne koostuvat samasta materiaalista kuin solukalvo (lipidikaksoiskerros). Koostumuksensa ja kokonsa perusteella liposomit jaotellaan seuraavasti:

• multilamellaariset vesikkelit (MLV, 0,1–10μm)
• pienet unilamellaariset vesikkelit (SUV, <100 nm)
• suuret unilamellaariset vesikkelit (LUV, 100–500 nm)
• jättikokoiset unilamellaariset vesikkelit (GUV, ≥1 μm)

Liposomien perusrakenne koostuu fosfolipideistä. Fosfolipideillä on hydrofiilinen pääryhmä ja hydrofobinen häntäryhmä, joka koostuu pitkästä hiilivetyketjusta.
Liposomikalvon koostumus on hyvin samankaltainen kuin ihon suojakerroksen, joten liposomit voivat helposti liittyä osaksi ihmisen ihoa. Kun liposomit sulautuvat ihoon, ne voivat vapauttaa kapseloidut aineet suoraan kohteeseen, jossa vaikuttavat aineet voivat hoitaa tehtävänsä. Näin liposomit parantavat kapseloitujen lääke- ja kosmetiikka-aineiden kykyä tunkeutua ihoon ja läpäistä sitä. Myös liposomit, joissa ei ole kapseloituja aineita, eli tyhjät vesikkelit, ovat tehokkaita ihoa hoitavia aineita, sillä ”phosphatidylcholin” sisältää kaksi välttämätöntä ainetta, joita ihmisen elimistö ei pysty itse tuottamaan: linolihappoa ja koliinia.
Liposomeja käytetään lääkkeiden, peptidien, proteiinien, ”plasmic DNA” -aineen, antisense-oligonukleotidien tai ribotsyymien biologisesti yhteensopivina kantajina farmaseuttisiin, kosmeettisiin ja biokemiallisiin tarkoituksiin. Hiukkaskoon ja lipidien fysikaalisten parametrien valtava muunneltavuus tarjoaa houkuttelevia mahdollisuuksia räätälöityjen kantajien rakentamiseen monenlaisiin sovelluksiin. (Ulrich 2002)

Liposomien muodostaminen ultraäänellä

Liposomeja voidaan muodostaa ultraäänen avulla. Liposomien valmistuksen perusmateriaalina ovat ”amphilic”-molekyylit, jotka on johdettu biologisten kalvojen lipideistä tai jotka perustuvat niihin. Pienten unilamellaaristen vesikkelien (SUV) muodostamiseksi lipididispersiota käsitellään varovasti ultraäänellä – esimerkiksi kädessä pidettävällä ultraäänilaitteella UP50H (50W, 30kHz), laitteella VialTweeter tai ultraäänireaktorilla CupHorn – jäähauteessa. Tällaisen ultraäänikäsittelyn kesto on noin 5–15 minuuttia. Toinen menetelmä pienten unilamellaaristen vesikkelien tuottamiseen on multilamellaaristen liposomivesikkelien ultraäänikäsittely.
Dinu-Pirvu et al. (2010) raportoivat transferosomien valmistuksesta käsittelemällä MLV-vesikkeleitä ultraäänellä huoneenlämmössä.
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänilaitteita, sonotrodeja ja lisävarusteita ja voi siten tarjota sopivimman ultraäänilaitteiston erittäin tehokkaaseen liposomikapselointiin missä tahansa mittakaavassa.

Vaikuttavien aineiden kapselointi liposomeihin ultraäänellä

Liposomit toimivat vaikuttavien aineiden, kuten vitamiinien, terapeuttisten molekyylien, peptidien jne., kantajina. Ultraääni on tehokas väline liposomien valmistamiseen ja muodostamiseen vaikuttavien aineiden kapselointia varten. Samalla ultraäänikäsittely tukee kapselointi- ja sitoutumisprosessia, jolloin syntyy liposomeja, joissa on suuri määrä vaikuttavia aineita. Ennen kapselointia liposomit pyrkivät muodostamaan ryppäitä fosfolipidien polaaristen pääryhmien pinnalla tapahtuvan varausten välisen vuorovaikutuksen vuoksi (vrt. Míckova et al. 2008), ja lisäksi ne on avattava. Esimerkiksi Zhu et al. (2003) kuvaavat biotiinijauheen kapselointia liposomeihin ultraäänikäsittelyllä. Kun biotiinijauhe oli lisätty vesikkelisuspensioliuokseen, liuosta käsiteltiin ultraäänellä. Tämän käsittelyn jälkeen biotiini oli kapseloitunut liposomeihin.
Lue lisää GLP-1 ”peptrides” -aineiden (esim. semaglutidin) kapseloinnista liposomeihin ultraäänellä!

Liposomaaliset emulsiot ultraäänikäsittelyllä

Kosteuttavien tai ikääntymisen merkkejä ehkäisevien voiteiden, ihovoiteiden, geelien ja muiden kosmeseuttisten valmisteiden hoitavan vaikutuksen tehostamiseksi liposomaalisiin dispersioihin lisätään emulgointiaineita suurempien lipidimäärien stabiloimiseksi. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että liposomien kapasiteetti on yleensä rajallinen. Emulgointiaineita lisättäessä tämä vaikutus ilmenee aikaisemmin, ja ylimääräiset emulgointiaineet heikentävät fosfatidyylikoliinin affiniteettia ihon suojakerrokseen. Nanohiukkaset – jotka koostuvat fosfatidyylikoliinista ja lipideistä – ovat ratkaisu tähän ongelmaan. Nämä nanohiukkaset muodostuvat öljypisarasta, jota peittää fosfatidyylikoliinin yksikerros. Nanohiukkasten käyttö mahdollistaa valmisteet, jotka pystyvät sitomaan enemmän lipidejä ja pysymään stabiileina, jolloin ylimääräisiä emulgointiaineita ei tarvita.
Ultraäänikäsittely on hyväksi todettu menetelmä nanoemulsioiden ja nanodispersioiden valmistukseen. Erittäin voimakas ultraääni tuottaa tehon, jota tarvitaan nestefaasin (dispergoituneen faasin) hajottamiseen pieniksi pisaroiksi toisessa faasissa (jatkuvassa faasissa). Dispergointivyöhykkeellä sisäänpäin luhistuvat kavitaatiokuplat synnyttävät voimakkaita iskuaaltoja ympäröivään nesteeseen ja johtavat suurella nopeudella liikkuvien nestesuihkujen muodostumiseen. Jotta dispergoituneen faasin vastamuodostuneet pisarat stabiloituisivat koalesenssia vastaan, emulsioon lisätään emulgointiaineita (pinta-aktiivisia aineita, tensidejä) ja stabilointiaineita. Koska pisaroiden koalesenssi hajottamisen jälkeen vaikuttaa lopulliseen pisarakokojakaumaan, tehokkaasti stabiloivilla emulgointiaineilla pidetään lopullinen pisarakokojakauma samalla tasolla kuin välittömästi pisaroiden hajottamisen jälkeen ultraäänidispergointivyöhykkeellä.

Liposomaaliset dispersiot ultraäänikäsittelyllä

Tyydyttymättömään ”phosphatidylchlorine”-yhdisteeseen perustuvien liposomaalisten dispersioiden hapettumiskestävyys on heikko. Dispersio voidaan stabiloida antioksidanteilla, kuten C- ja E-vitamiinien kompleksilla.
 

Liposomien muodostaminen käänteisfaasihaihdutusmenetelmällä ultraäänikäsittelyä käyttäen

 
Ortan et al. (2002) saavuttivat hyviä tuloksia tutkimuksessaan, joka koski Anethum graveolens -kasvin eteerisen öljyn ultraäänellä tapahtuvaa valmistamista liposomeihin. Ultraäänikäsittelyn jälkeen liposomien koko oli 70–150 nm ja MLV-vesikkelien koko 230–475 nm; nämä arvot olivat suunnilleen samat myös 2 kuukauden kuluttua, mutta kasvoivat 12 kuukauden jälkeen erityisesti SUV-dispersiossa (ks. histogrammit alla). Eteerisen öljyn hävikkiä ja kokojakaumaa koskeva stabiilisuusmittaus osoitti myös, että liposomaaliset dispersiot säilyttivät haihtuvan öljyn pitoisuuden. Tämä viittaa siihen, että eteerisen öljyn kapselointi liposomeihin paransi öljyn stabiilisuutta.

Ortan et al. (2009): MLV- ja SUV-dispersioiden stabiilisuus 1 vuoden jälkeen. Liposomaalisia valmisteita säilytettiin lämpötilassa 4±1 ºC.

Yrityksen Hielscher ultraääniprosessorit ovat ihanteellisia laitteita kosmetiikka- ja lääketeollisuuden sovelluksiin. Järjestelmät, jotka koostuvat useista ultraääniprosessoreista, joiden kunkin teho on jopa 16 000 wattia, tarjoavat tarvittavan kapasiteetin tämän laboratoriosovelluksen muuttamiseksi tehokkaaksi tuotantomenetelmäksi hienojakoisten emulsioiden valmistamiseen jatkuvassa virtauksessa tai eräprosessissa – saavuttaen tuloksia, jotka ovat verrattavissa nykyisten parhaiden saatavilla olevien korkeapainehomogenisaattorien, kuten aukkoventtiilien, tuloksiin. Tämän jatkuvatoimisen emulgoinnin korkean tehokkuuden lisäksi yrityksen Hielscher ultraäänilaitteet tarvitsevat hyvin vähän huoltoa, ja niitä on erittäin helppo käyttää ja puhdistaa. Ultraääni tukee myös puhdistusta ja huuhtelua. Ultraääniteho on säädettävissä, ja se voidaan mukauttaa tiettyihin tuotteisiin ja emulgointivaatimuksiin. Saatavilla on myös erityisiä virtauskennoreaktoreita, jotka täyttävät edistyneet CIP- (puhdistus paikallaan) ja SIP-vaatimukset (sterilointi paikallaan).

Usein kysyttyjä kysymyksiä liposomeista

Mihin tyyppeihin liposomit jaotellaan?

Liposomit luokitellaan eri tyyppeihin niiden koon ja sisältämien kaksoiskerrosten lukumäärän perusteella. Näihin luokkiin kuuluvat:

• Pienet unilamellaariset vesikkelit (SUV): Nämä ovat pienimpiä liposomeja, joissa on yksi lipidikaksoiskerros.
• Suuret unilamellaariset vesikkelit (LUV): Nämä ovat SUV-vesikkeleitä suurempia, ja niissäkin on yksi kaksoiskerros.
• Multilamellaariset vesikkelit (MLV): Näissä on useita samankeskisiä kaksoiskerroksia.
• Multivesikulaariset vesikkelit (MVV): Nämä koostuvat useista pienemmistä vesikkeleistä suuremman vesikkelin sisällä.

 
Muihin erikoistuneisiin tyyppeihin kuuluvat:

• PEGyloidut liposomit: Liposomit, joita on muokattu polyetyleeniglykolilla (PEG) stabiilisuuden parantamiseksi ja verenkierrossa pysymisen pidentämiseksi.
• Nanoliposomit: Erittäin pienet liposomit, joita käytetään tyypillisesti kohdennettuun lääkkeenannosteluun.

Millaisia vesikkelirakenteita liposomeilla voi olla?

Liposomit jaotellaan edelleen vesikkelirakenteensa perusteella seitsemään päätyyppiin:

• Suuret multilamellaariset vesikkelit (MLV): Sisältävät useita kaksoiskerroksia.
• Oligolamellaariset vesikkelit (OLV): Sisältävät muutamia kaksoiskerroksia.
• Pienet unilamellaariset vesikkelit (SUV): Pienimmät vesikkelit, joissa on yksi kaksoiskerros.
• Keskikokoiset unilamellaariset vesikkelit (MUV): Keskikokoiset vesikkelit, joissa on yksi kaksoiskerros.
• Suuret unilamellaariset vesikkelit (LUV): Suuremmat vesikkelit, joissa on yksi kaksoiskerros.
• Jättikokoiset unilamellaariset vesikkelit (GUV): Erittäin suuret vesikkelit, joissa on yksi kaksoiskerros.
• Multivesikulaariset vesikkelit (MVV): Useita vesikkeleitä yhden suuren vesikkelin sisällä.

Mitä eroja liposomeilla ja niosomeilla on?

Liposomit ja niosomit eroavat toisistaan pääasiassa koostumukseltaan:
Liposomit: Valmistetaan kaksiketjuisista fosfolipideistä, jotka voivat olla joko neutraaleja tai varautuneita.
Niosomit: Valmistetaan varauksettomista yksiketjuisista pinta-aktiivisista aineista ja kolesterolista.
Molemmat rakenteet muodostetaan ultraäänikäsittelyllä, joka edistää kaksoiskerroksisten vesikkelien rakentumista.

Mikä on liposomin ihanteellinen koko?

Terapeuttisten aineiden annostelussa liposomin ihanteellinen halkaisija on teoriassa 50–200 nanometriä. Tämä kokoalue optimoi stabiilisuuden ja biologisen hyötyosuuden. Ultraäänikäsittelyä käytetään yleisesti vesikkelin pienentämiseen haluttuun kokoon.

Voivatko liposomit kuljettaa hydrofiilisiä lääkkeitä?

Kyllä, liposomit voivat kuljettaa hydrofiilisiä lääkkeitä. Niitä arvostetaan biolääketieteellisissä sovelluksissa, koska ne pystyvät kapseloimaan sekä hydrofobisia että hydrofiilisiä aineita. Lisäksi niillä on hyvä biologinen yhteensopivuus ja biohajoavuus, mikä tekee niistä tehokkaita annostelujärjestelmiä.

Miten liposomeja valmistetaan?

Yleisimmät liposomien valmistustekniikat ovat ohutkalvomenetelmä ja käänteisfaasihaihdutusmenetelmä.
Ohutkalvon hydratointimenetelmä:

1. Liuota lipidit orgaaniseen liuottimeen.
2. Haihduta liuotin ohuen lipidikalvon muodostamiseksi.
3. Hydratoi kalvo vesiliuoksella ultraäänikäsittelyä käyttäen multilamellaaristen vesikkelien muodostamiseksi.

Käänteisfaasihaihdutusmenetelmä:

1. Liuota lipidit veteen ja etanoliin.
2. Käsittele liuosta ultraäänellä 60°C:ssa noin 10 minuutin ajan lipiditahnan muodostamiseksi.
3. Jäähdytä lipidiliete ja lisää vettä tai puskuriliuosta tipoittain samalla sekoittaen.
4. Hydratoi suspensiota 1 tunnin ajan multilamellaaristen vesikkelien muodostamiseksi.
5. Pienennä liposomien kokoa jatkamalla ultraäänikäsittelyä.

Mitä arkeosomit ovat?

Arkeosomit ovat arkeojen lipideistä valmistettuja liposomeja. Nämä lipidit tunnetaan stabiilisuudestaan ja äärimmäisten olosuhteiden kestävyydestään. Nämä ominaisuudet tekevät arkeosomeista erityisen hyödyllisiä lääkkeenannostelussa ja rokotteiden kehittämisessä haastavissa ympäristöissä.

Miten arkeosomeja valmistetaan?

Ultraäänikäsittelymenetelmä Pisen (2022) mukaan: Arkeosomeja voidaan valmistaa Sulfolobussolfataricus-organismin polaarisesta lipidifraktiosta ”PLF” ultraäänikäsittelyllä 60°C:ssa ilman ulkoista lipiditäydennystä. Sulfolobusacidocaldarius-organismin polaarisia lipidejä käsiteltiin tehokkaasti ultraäänellä 0°C:ssa arkeosomien muodostamiseksi. BMD:llä kuormitettuja arkeosomeja ja tavanomaisia liposomeja sekä Archaea H. salinarum -organismista eristettyjä ja fosfatidyylikoliinilla rikastettuja arkeojen lipidejä valmistettiin ultraäänikäsittelytekniikoilla. Ultraäänikäsiteltyjä vesikkeleitä valmistettiin paikallista annostelua varten käsittelemällä MLV-dispersioita ultraäänellä 80 prosentin amplitudilla 4 minuutin ajan Hielscher UP50H -anturityyppisellä ultraäänilaitteella (ks. kuva vasemmalla).

Kirjallisuus/viitteet

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.