Paranna HPLC-analyysiä luotettavalla näytteenkäsittelyllä
Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) on edelleen yksi tärkeimmistä analyysitekniikoista yhdisteiden tunnistamiseen ja määrälliseen määrittämiseen monimutkaisissa matriiseissa. HPLC-menetelmiä arvostetaan niiden herkkyyden, selektiivisyyden ja toistettavuuden vuoksi niin lääkkeiden laadunvalvonnassa kuin ympäristön seurannassa ja elintarvikeanalyyseissä. Kromatografisten tietojen luotettavuus riippuu kuitenkin suuresti yhdestä ratkaisevasta vaiheesta: HPLC-näytteenkäsittelystä.
Tutkimukset ja näytteenkäsittelyn rutiinikäytännöt osoittavat, että ultraääniavusteinen uutto ja näytteenkäsittely parantavat merkittävästi HPLC-analyysin tehokkuutta, oikeellisuutta ja nopeutta. Käyttämällä ultraäänienergiaa matriisien hajottamiseen ja analyyttien liuottimiin siirtymisen tehostamiseen laboratoriot voivat saavuttaa suurempia saantoja, lyhyempiä uuttoaikoja ja paremmin toistettavia analyysituloksia.
Miksi näytteenkäsittely on tärkeää HPLC-analyysissä
Monissa analyysityönkuluissa näytematriisi – kuten kasvimateriaali, biologinen kudos, maaperä tai vesi – sisältää monimutkaisia yhdisteseoksia, jotka voivat häiritä kromatografista erotusta. Tehokas näytteenkäsittely on siksi tarpeen analyyttien eristämiseksi, häiritsevien aineiden poistamiseksi ja kohdeyhdisteiden konsentroimiseksi ennen injektointia HPLC-järjestelmään.
Perinteisiin uuttotekniikoihin liittyy usein aikaa vieviä toimenpiteitä, suuria määriä orgaanisia liuottimia ja useita puhdistusvaiheita. Nämä menetelmät voivat aiheuttaa vaihtelua, lisätä käyttökustannuksia ja pidentää analyysin kokonaisaikaa.
Ultraääninäytteenkäsittely tarjoaa tehokkaan vaihtoehdon. Ultraäänikäsittely tuo nestemäiseen väliaineeseen suurtaajuista akustista energiaa, joka synnyttää mikroskooppisia kavitaatiokuplia. Kun nämä kuplat luhistuvat, ne synnyttävät paikallisia leikkausvoimia ja mikrosekoitusvaikutuksia, jotka hajottavat kiinteitä matriiseja ja nopeuttavat aineensiirtoa. Tämä prosessi tehostaa uuttoa huomattavasti.
Suuren näytekapasiteetin ultraäänilaite UIP400MTP varustettuna automaattisen näytteensyöttäjän näytepulloille tarkoitetulla putkitelineellä
Tieteellinen näyttö: ultraäänikäsittely parantaa analyysin suorituskykyä
Useat vertaisarvioidut tutkimukset ovat osoittaneet ultraääniuuton edut HPLC-analyysin työnkuluissa.
Esimerkiksi vesinäytteiden torjunta-ainejäämien seurantaan kehitetyssä menetelmässä käytettiin ultraäänikäsittelyä yhdessä menetelmällä LC–MS/MS tehdyn analyysin kanssa karbaryyli-torjunta-aineen pitoisuuksien määrittämiseen. Tässä lähestymistavassa vesinäytteet uutettiin asetonitriilillä ultraäänikäsittelyn aikana ennen kromatografista analyysiä. Menetelmällä saavutettiin hyvä analyyttinen suorituskyky, muun muassa saannot välillä 89,53% ja 101,72%, mikä vahvisti ultraääninäytteenkäsittelymenettelyn oikeellisuuden ja luotettavuuden.
Ultraääniuuton vaihe mahdollisti analyyttien tehokkaan siirtymisen vesimatriisista orgaaniseen liuottimeen, mikä vähensi liuottimen kulutusta ja poisti laajojen puhdistusmenettelyjen tarpeen. Validoitu analyysimenetelmä osoitti erinomaista lineaarisuutta ja täsmällisyyttä sekä erinomaiset määritysrajat, mikä korostaa ultraäänikäsittelyn tehokkuutta nykyaikaisissa kromatografisissa työnkuluissa. (vrt. Roudani et al., 2018)
Toisessa tutkimuksessa esiteltiin ultraääniavusteinen matriisin kiinteäfaasidispersio (UA-MSPD) oleuropeiinin määrittämiseen oliivinlehdistä HPLC-analyysillä. Tässä tekniikassa kasvijauhe ja sorbenttimateriaali sekoitettiin ja altistettiin sitten ultraääniaalloille eluutiovaiheen aikana. Ultraääni tehosti analyyttien desorptiota sorbentin pinnalta ja paransi samalla uuttoa näytematriisista. (vrt. Rashidipour ja Heydari, 2018)
Optimoitu ultraäänimenettely tuotti merkittäviä analyyttisiä parannuksia, kuten:
- Lineaariset kalibrointikäyrät, joiden R² = 0,9979
- Toteamisrajat jopa vain 0,03 µg mL⁻¹
- Saannot välillä 90,2% ja 96,7%
Nämä tulokset vahvistavat, että ultraääniavusteinen uutto paitsi nopeuttaa näytteenkäsittelyä myös lisää uuttosaantoa verrattuna perinteisiin matriisin kiinteäfaasidispersiotekniikoihin.
Sondityyppinen ultraäänilaite UP200St HPLC-näytteenkäsittelyyn
Ultraääninäytteenkäsittelyn keskeiset edut HPLC-analyysissä
Ultraääniuuton yleistymistä analyysilaboratorioissa edistävät useat mitattavat hyödyt.
- Tehokkaampi uutto
Akustinen kavitaatio hajottaa kiinteitä matriiseja ja parantaa liuottimen tunkeutumista niihin. Tämä tehostaa analyyttien vapautumista ja lisää saantoja erityisesti monimutkaisissa näytteissä esiintyvien, pitoisuudeltaan hyvin pienten yhdisteiden osalta. - Lyhyempi näytteenkäsittelyaika
Ultraääniuutolla näytteenkäsittely voidaan usein suorittaa sekunneissa tai minuuteissa. Esimerkiksi menetelmässä UA-MSPD optimoiduilla ultraääniuuton parametreilla saavutettiin tehokas analyyttien talteenotto noin 30 sekunnin ultraäänikäsittelyllä, mikä osoittaa, kuinka huomattavasti analyysityönkulkuja voidaan nopeuttaa. - Pienempi liuottimen kulutus
Koska ultraääni tehostaa aineensiirtoa, liuotinta tarvitaan yleensä pienempiä määriä. Liuottimien käytön vähentäminen parantaa laboratorion kestävyyttä ja pienentää käyttökustannuksia. - Parempi toistettavuus
Ultraäänienergian tasainen jakautuminen varmistaa yhdenmukaisen näytteiden hajotuksen ja uuton rinnakkaisnäytteissä, mikä parantaa analyyttisten mittausten täsmällisyyttä. - Yhteensopivuus nykyaikaisten kromatografisten menetelmien kanssa
Ultraääniuutto on helppo yhdistää HPLC-, UHPLC- ja LC-MS-järjestelmiin, joten se soveltuu analyysiympäristöihin, joissa käsitellään suuria näytemääriä.
HPLC-kromatogrammi fenolisista yhdisteistä, jotka ovat peräisin Annona muricata -lehdistä ultraäänilaitteella UP400S ultraäänellä eristetystä uutteesta.
(Tutkimus ja kuva: ©Nolasco-González et al., 2022)
Käytännön ultraäänikäsittelyratkaisut HPLC-näytteenkäsittelyyn
Ultraääniuuttoa käyttöön ottaville laboratorioille Hielscher tarjoaa ultraäänilaitteita, joilla voidaan hallita tarkasti parametreja, kuten amplitudia, aikaa ja pulssitilaa. Siksi Hielscher tarjoaa analyysilaboratorioihin erityisen hyvin soveltuvia laboratorioultraäänilaitteita.
Valitse HPLC-näytteillesi parhaiten soveltuva laboratorioultraäänilaite
| Ultraäänilaitteen malli | Edut HPLC-analyysissä | Parhaat käyttökohteet HPLC-näytteenkäsittelyssä |
| Usean putken ultraäänilaite VialTweeter |
• Jopa 10 suljetun näytepullon samanaikainen ultraäänikäsittely identtisellä ultraäänienergialla • Steriili: ei ristikontaminaatiota, koska näytteet pysyvät suljettuina • Erittäin hyvin toistettavat uutto-olosuhteet eri erissä • Tehokas kavitaatio pienitilavuuksisille analyysinäytteille |
• Suurten ympäristö-, elintarvike- tai lääkenäytemäärien käsittely • Hivenpitoisuuksina esiintyvien analyyttien uutto ennen analyysiä menetelmillä HPLC, UHPLC tai LC-MS • Standardoidut työnkulut, jotka edellyttävät useiden näytteiden identtistä käsittelyä |
| Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP |
• Kokonaisten mikrolevyjen kosketukseton ultraäänikäsittely (96- ja 384-kuoppaiset levyt) • Ultraäänienergian tasainen jakautuminen kaikkiin kuoppiin • Mahdollistaa analyysityönkulkujen automatisoinnin ja robotiikan integroinnin • Suuri näytekapasiteetti sekä amplitudin ja ultraäänikäsittelyajan tarkka hallinta |
• Suuren näytekapasiteetin UHPLC-seulontatyönkulut • Lääkeaineiden yhdistekirjastot ja metabolomiikan näytteenkäsittely • Mikrolevyillä tehtävä uutto menetelmiä LC-MS tai UHPLC käyttäviä analyysiprosesseja varten |
| Laboratorioultraäänilaitteet, joissa on mikrokärki (suora ultraäänikäsittely) |
• Suurin ultraääni-intensiteetti matriisin tehokkaaseen hajottamiseen • Analyyttien erittäin nopea uutto kiinteistä, viskooseista tai heterogeenisistä näytteistä • Säädettävä amplitudi ja pulssiparametrit optimoituja uutto-olosuhteita varten • Suuri kavitaatioenergia parantaa analyyttien talteenottoa ja uuttosaantoa |
• Uutto vaikeista matriiseista, kuten kasvikudoksesta, elintarvikenäytteistä tai polymeereistä • Homogenointi ennen SPE:tä, suodatusta tai neste–nesteuuttoa • Ultraääneen perustuvan HPLC-näytteenkäsittelyn menetelmäkehitys |
| CupHorn (”suuren intensiteetin haude” dekantterilaseille ja putkille) |
• Epäsuora ultraäänikäsittely estää sondin kontaminaation • Tasainen ultraäänikenttä useille putkille samanaikaisesti • Ihanteellinen steriileille, vaarallisille tai haihtuville näytteille, joiden on pysyttävä suljettuina • Yksinkertaistaa käsittelyä säilyttäen suuren kavitaatioenergian |
• Useiden HPLC-näytteiden rinnakkainen uutto suljetuissa sentrifugiputkissa • Biologisten näytteiden, lääkenäytteiden tai ympäristönäytteiden käsittely • Työnkulut, joissa tarvitaan kontaminaatiotonta epäsuoraa ultraäänikäsittelyä |
Tieteellinen merkitys analyyttiselle kemialle
Analyyttisen kemian siirtyessä kohti nopeampia ja kestävämpiä laboratoriokäytäntöjä ultraääninäytteenkäsittelystä on tullut tehokas mahdollistava teknologia. Ultraäänikäsittely tukee nopeiden analyysimenetelmien kehittämistä pienemmällä liuottimen kulutuksella, paremmalla uuttotehokkuudella ja luotettavilla validointiparametreilla.
Ultraääniuuttoa käsittelevän kirjallisuuden kasvava määrä osoittaa, että ultraääniavusteinen HPLC-näytteenkäsittely ei ole pelkästään käytännöllinen ratkaisu – se on tieteellisesti validoitu lähestymistapa, joka parantaa analyyttistä suorituskykyä. Yhdistämällä ultraääniuuton nykyaikaisiin kromatografisiin tekniikoihin laboratoriot voivat havaita luotettavasti pitoisuudeltaan hyvin pieniä analyyttejä yhä monimutkaisemmista näytematriiseista.
Ultraäänikäsittelyllä tehostetut HPLC-työnkulut
Analyysilaitteiston ja näytteenkäsittelyteknologioiden kehittyessä jatkuvasti ultraääniuutolla on todennäköisesti entistä suurempi rooli kromatografisissa laboratorioissa. Sen kyky sujuvoittaa työnkulkuja, parantaa tietojen laatua ja vähentää ympäristövaikutuksia vastaa hyvin nykyaikaisen analytiikan kehittyviä vaatimuksia.
HPLC-näytteenkäsittelyn optimointiin pyrkiville analyyttisille kemisteille ja teollisuuslaboratorioille ultraääniuutto tarjoaa toimivaksi osoitetun, skaalautuvan ja tieteellisesti vankan ratkaisun. Integroimalla ultraäänikäsittelyn rutiininomaisiin näytteenkäsittelyprotokolliin laboratoriot voivat parantaa merkittävästi sekä kromatografisen analyysin tehokkuutta että luotettavuutta.
Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua
Hielscher-ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher-ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL:n, CSA:n ja RoHs:n vaatimukset.
Kirjallisuus / lähteet
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Usein kysytyt kysymykset
Mitä HPLC on?
Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) on analyyttinen erotustekniikka, jota käytetään seoksen komponenttien tunnistamiseen, määrälliseen määrittämiseen ja puhdistamiseen. HPLC:ssä nestemäinen liikkuva faasi kuljettaa liuenneet analyytit korkeassa paineessa stationaarifaasilla pakatun kolonnin läpi. Analyyttien, stationaarifaasin ja liikkuvan faasin välisten vuorovaikutusten erot saavat yhdisteet erottumaan niiden kulkiessa kolonnin läpi. Ilmaisimet, kuten UV-Vis-, fluoresenssi- tai massaspektrometriset ilmaisimet, mittaavat erotetut yhdisteet ja mahdollistavat tarkan kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen analyysin.
Mitä nestekromatografian tyyppejä on olemassa?
Nestekromatografia voidaan luokitella analyytin, stationaarifaasin ja liikkuvan faasin välisen erotusmekanismin mukaan. Yleisimmät tyypit ovat käänteisfaasikromatografia, jossa pooliton stationaarifaasi erottaa yhdisteet hydrofobisten vuorovaikutusten perusteella; normaalifaasikromatografia, jossa käytetään poolista stationaarifaasia ja erotetaan yhdisteet poolisuuden mukaan; ioninvaihtokromatografia, jossa varautuneet stationaarifaasit erottavat analyytit ionisten vuorovaikutusten perusteella; sekä kokoerottelukromatografia, joka erottaa molekyylit niiden hydrodynaamisen koon ja molekyylipainon mukaan. Muita erikoistuneita menetelmiä ovat affiniteettikromatografia ja hydrofiilinen vuorovaikutuskromatografia (HILIC), jotka kohdistuvat tiettyihin molekyylien välisiin vuorovaikutuksiin tai poolisiin yhdisteisiin.
Mitä näytepulloja HPLC-analyysissä käytetään?
HPLC-analyyseissä käytetään tavallisesti pieniä lasisia tai polymeerisiä näytepulloja, jotka on suunniteltu käsiteltyjen näytteiden säilyttämiseen ennen injektointia kromatografiseen järjestelmään. Yleisin koko on 2 mL:n automaattisen näytteensyöttäjän näytepullo, joka on yhteensopiva useimpien HPLC-laitteiden automaattisten näytteensyöttäjien kanssa. Nämä näytepullot valmistetaan yleensä borosilikaattilasista kemiallisen kestävyyden ja mahdollisimman vähäisten liuottimien ja analyyttien kanssa tapahtuvien vuorovaikutusten varmistamiseksi. Näytetyypistä riippuen näytepulloissa voi olla sisäputkia pienitilavuuksisille näytteille, kierrekorkkeja tai puristettavia korkkeja sekä esimerkiksi PTFE:stä/silikonista valmistettuja septumeita näytteen eheyden säilyttämiseksi.
Mitä automaattisen näytteensyöttäjän näytepullot ovat?
Automaattisen näytteensyöttäjän näytepullot ovat erityisiä näyteastioita, jotka on suunniteltu HPLC- ja UHPLC-laitteiden automaattisiin injektiojärjestelmiin. Ne sisältävät käsitellyn näyteliuoksen, ja ne asetetaan laitteen automaattisen näytteensyöttäjän tarjottimelle, jossa järjestelmä ottaa automaattisesti määritetyn tilavuuden injektoitavaksi kromatografiseen kolonniin. Automaattisen näytteensyöttäjän näytepullot valmistetaan tarkoin mitoin, jotta ne ovat yhteensopivia robottikäyttöisten näytteenottoneulojen kanssa ja jotta näytteen haihtuminen, kontaminaatio tai adsorptio minimoidaan. Niiden rakenne mahdollistaa toistettavan analyysin suurille näytemäärille nykyaikaisissa kromatografisissa laboratorioissa.
Mitkä ovat HPLC-analyysin vaiheet?
Korkean erotuskyvyn nestekromatografian (HPLC) tyypillinen työnkulku koostuu useista peräkkäisistä vaiheista, jotka varmistavat analyyttien luotettavan erotuksen ja havaitsemisen.
- Ensin suoritetaan näytteenkäsittely analyytin liuottamiseksi, hiukkasten poistamiseksi ja usein kohdeyhdisteiden uuttamiseksi tai konsentroimiseksi näytematriisista. Tämä vaihe voi sisältää suodatusta, laimennusta tai uuttotekniikoita, kuten ultraääniuuttoa, kiinteäfaasiuuttoa tai neste–nesteuuttoa.
- Seuraavaksi käsitelty näyte sijoitetaan HPLC-näytepulloon ja asetetaan automaattiseen näytteensyöttäjään. Automaattinen näytteensyöttäjä injektoi tarkan tilavuuden näytettä virtaavaan liikkuvaan faasiin.
- Liikkuvan faasin syöttövaihe kuljettaa sitten injektoidun näytteen järjestelmän läpi korkeapainepumpun avulla. Liikkuva faasi kuljettaa analyytit kromatografisen kolonnin läpi hallitulla tilavuusvirralla.
- Erotus tapahtuu kromatografisen kolonnin sisällä. Kolonni sisältää stationaarifaasin, tyypillisesti pakattuja hiukkasia, joilla on määritellyt kemialliset ominaisuudet. Analyyttien kulkiessa kolonnin läpi ne ovat eri tavoin vuorovaikutuksessa stationaarifaasin ja liikkuvan faasin kanssa, minkä vuoksi ne eluoituvat eri aikoina.
- Erotuksen jälkeen yhdisteet kulkevat ilmaisimen, kuten UV-Vis-, fluoresenssi- tai massaspektrometrisen ilmaisimen, läpi. Ilmaisin mittaa eluoituvien yhdisteiden läsnäolon ja pitoisuuden ja muuntaa signaalin sähköiseksi tiedoksi.
- Lopuksi suoritetaan tiedonkeruu ja analyysi kromatografiaohjelmistolla. Järjestelmä tuottaa kromatogrammin, jonka piikit vastaavat yksittäisiä yhdisteitä. Piikkien retentioajat auttavat tunnistamaan analyytit, kun taas piikkien pinta-alat tai korkeudet mahdollistavat niiden pitoisuuden kvantitatiivisen määrittämisen.
Hielscher Ultrasonics valmistaa suorituskykyisiä ultraäänihomogenisaattoreita laboratoriokoosta aina teolliseen kokoluokkaan asti.