Soluviljelyyn perustuvat virusrokotteet – Tehokas solujen hajottaminen ultraäänikäsittelyllä

Usein kysyttyjä kysymyksiä ultraäänipohjaisesta solujen hajottamisesta viruspohjaisten rokotteiden tuotannossa

Mitä on solujen hajottaminen ultraäänellä?

Ultraäänisessä solujen hajottamisessa käytetään suuritehoista ultraääntä, tyypillisesti taajuusalueella 20–30 kHz, solukalvojen rikkomiseen ja solunsisäisen aineksen vapauttamiseen. Suuritehoiset ultraääniaallot muodostavat nesteeseen kavitaatiokuplia. Kun nämä kuplat romahtavat, ne tuottavat voimakkaita paikallisia leikkausvoimia ja mikrovirtauksia, jotka hajottavat solut mekaanisesti ja edistävät massansiirtoa solun sisäosan ja ympäröivän väliaineen välillä. Rokotetuotannossa tätä menetelmää käytetään virustartunnan saaneiden soluviljelmien hajottamiseen sekä solunsisäisten ja kalvoon kiinnittyneiden viruspartikkelien vapauttamiseen tuotantoon.

Miksi virusten eristämisessä kannattaa käyttää ultraäänikäsittelyä kemiallisen tai entsymaattisen hajotuksen sijaan?

Ultraäänikäsittely perustuu puhtaasti mekaanisiin voimiin. Siinä ei tarvita pesuaineita, lysotsyymiä, proteinaasi K:ta tai muita lyysireagensseja, jotka saattaisivat muuttaa lysaattia, häiritä myöhempää puhdistusta tai jotka olisi poistettava ennen jatkokäsittelyä. Kemialliset reagenssit vaativat tyypillisesti aikaa vievää monivaiheista valmistelua, jotta estetään myöhempien määritysten ja muiden jälkikäsittelyvaiheiden estyminen. Entsymaattinen hajottaminen vaatii pitkiä inkubointiaikoja ja tuottaa usein tuloksia, joita ei voida toistaa. Ultraäänilyysaus yhdistää myös resuspensio-, hajotus- ja uuttovaiheet yhdeksi jatkuvaksi prosessiksi. Jos prosessissasi tarvitaan pesuaine- tai entsyymivaihetta, ultraäänikäsittely tehostaa sitä sen sijaan, että korvaisi sen: kavitaatio heikentää solukalvoja ja parantaa kaikkien solujen tasapuolista altistumista reagenssille.

Miten ultraäänikäsittely eroaa mekaanisista homogenisointimenetelmistä?

Anturityyppiset ultraäänilaitteet siirtävät ultraäänienergiaa suoraan ja tehokkaasti, koska sonotrodi on suorassa kosketuksessa näytteen kanssa. Mekaanisesti toimivat homogenisointitekniikat johtavat usein heikompaan energian siirtotehokkuuteen. Ultraäänikäsittelyssä ei tarvita kuluvia jauhatushelmiä tai pyöriviä tiivisteitä tuotevirrassa, eikä suuttimia tai kammioita, jotka voivat tukkeutua viskoosista solumassasta, eikä erien välistä ristikontaminaatiota.

Voiko ultraäänikäsittely vahingoittaa virusta tai antigeeniä?

Tämä on keskeinen optimointitehtävä, ja se on hallittavissa. Säätämällä ultraäänikäsittelyn parametreja ultraäänikäsittelyn vaikutuksia voidaan hallita tarkasti: pienellä amplitudilla ja lyhyellä käsittelyajalla vaikutukset ovat hyvin lieviä, kun taas suuret amplitudit, korkea paine ja pidempi käsittelyaika johtavat voimakkaaseen käsittelyyn. Koska intensiteettiä voidaan säätää tarkasti biologisen näytteen mukaan, vältetään ylikäsittely, hajoaminen ja saannon menetys. Käytännössä amplitudi, viipymäaika ja käsittelykertojen määrä asetetaan minimiin, jolla saavutetaan tavoiteltu hajotusaste, samalla kun lämpötilaa seurataan jatkuvasti ja jäähdytystä käytetään.

Vähentääkö ultraäänikäsittely sadon viskositeettia?

Kyllä. Tiheät, korkean solutiheyden saaliit ovat viskooseja ja vaikeasti pumpattavia vapautuneen, fragmentoitumattoman isäntäsolun DNA:n vuoksi. Ultraäänikäsittely leikkaa ja pilkkoo DNA:n ja RNA:n, liuottaa solumassan ja hajottaa solujätteiden agglomeraatit. Tuloksena on homogeeninen, pumpattava suspensio, joka helpottaa kirkastamista, sentrifugointia ja kromatografiaa tehokkaammin. DNA:n ja RNA:n pilkkominen hallitulla ultraäänikäsittelyllä on vakiintunut laboratoriokäyttö samalle teknologialle.

Voinko suorittaa prosessin jatkuvassa inline-tilassa?

Kyllä. Hielscherin ultraäänilaitteet on suunniteltu toimimaan teollisuusympäristöissä keskeytyksettä ympäri vuorokauden, ja ne voidaan varustaa virtauskammioilla ja reaktoreilla jatkuvaa linjassa tapahtuvaa ultraäänikäsittelyä, kierrätyspiirejä tai integrointia tuotantoyksiköihin ja prosessilinjoihin varten. Sekä yksivaiheinen että monivaiheinen käyttö ovat mahdollisia.

Miten siirryn laboratoriovaiheesta tuotantoon?

Lineaarisesti, mitattavan energian syötön perusteella. Kaikki Hielscher-ultraäänihomogenisaattorilla saadut ultraäänikäsittelytulokset voidaan skaalata lineaarisesti suurempiin tuotantomääriin teollisessa valmistuksessa; pöytämallisella ultraäänilaitteella kehitetyt ultraäänikäsittelyparametrit voidaan siirtää suoraan suurempiin Hielscher-järjestelmiin. Skaalauskriteerinä käytetään tilavuuskohtaista energian syöttöä yhdessä amplitudin, viipymäajan ja lämpötilan kanssa. Hielscherin prosessikonsultointiin sisältyy suosituksia parametrien optimoinnista (amplitudi, tilavuuskohtainen energia E/V, viipymäaika, lämpötila ja paineen säätö) mitattavan energian syötön perusteella.

Sopiiiko solujen hajottaminen ultraäänellä puhdastiloissa ja GMP-vaatimusten mukaisessa tuotannossa?

Hielscherin ultraäänilaitteet voidaan asentaa helposti puhdastilalaboratorioihin ja tuotantotiloihin. Kotelot on valmistettu antibakteerisesta muovista tai ruostumattomasta teräksestä. Kaikki nesteen kanssa kosketuksiin joutuvat osat, kuten sonotrodit ja virtauskennot, on valmistettu titaanista tai ruostumattomasta teräksestä, ja ne voidaan autoklavoida. Saatavilla on erityisiä virtauskenno-reaktoreita, jotka täyttävät edistyneet CIP- (clean-in-place) ja SIP- (sterilize-in-place) vaatimukset. Teollisen UIP-sarjan anturi on IP64-luokiteltu ja se voidaan asentaa vaativiin ympäristöihin, kun taas generaattori sijoitetaan etäälle. Koska Hielscherin ultraäänilaitteet muuntavat sähköenergian mekaaniseksi värähtelyksi erittäin korkealla hyötysuhteella – noin 80–90 % pistorasiasta nesteeseen – anturi voidaan rakentaa suljettuihin koteloihin ilman tuuletusritilöitä, eikä pakotettua jäähdytystä, kuten paineilmaa tai vettä, tarvita. Tämä tarkoittaa myös sitä, että mikään jäähdytysaine ei pääse kosketuksiin prosessin kanssa. Automaattinen prosessidokumentointi tukee jäljitettävyyttä ja toistettavuutta säännellyssä valmistuksessa.

Voiko ultraäänikäsittely myös inaktivoida viruksen inaktivoidun rokotteen valmistusta varten?

Kyllä. Tehokasta ultraääntä käytetään patogeenien, kuten bakteerien ja virusten, inaktivointiin. Sopivalla ultraääniannoksella ja -intensiteetillä soluja ja mikrobeja voidaan käsitellä prosessin tavoitteen mukaisesti, joten samaa alustaa voidaan käyttää sekä solujen hajottamiseen saantoa varten että inaktivointiin. Ultraäänikäsittelyn ja lämmön yhdistelmä, joka tunnetaan nimellä termosonikaatio, tarjoaa nopeamman sterilointinopeuden huomattavasti pienemmällä lämpöintensiteetillä ja kestolla, mikä on edullista lämpöherkkien yhdisteiden, kuten proteiinien ja antigeenien, säilyttämisen kannalta. Ultraäänipohjaista inaktivointia käytetään yleensä yhdessä vakiintuneiden kemiallisten inaktivointimenetelmien kanssa, ja täydellinen inaktivointikineettinen prosessi on validoitava jokaisen viruksen osalta erikseen.

Voidaanko samaa järjestelmää käyttää sadonkorjuun jälkeisissä valmistusvaiheissa?

Kyllä. Samalla alustalla hoidetaan antigeenien dispergointi suspensioihin, polymeereihin tai liposomaalisiin kapselointeihin, antigeenien ja alumiinipohjaisten adjuvanttien, kuten Alhydrogel™:n, agglomeraation purkamisen ja tasaisen jakautumisen, rokotteiden formuloinnin liposomeiksi ja kiinteiksi lipidinanopartikkeleiksi, joissa kantajan kokoa voidaan tarkasti säätää, sekä kaasunpoistovaiheen ennen täyttöä ampulleihin tai ruiskuihin.