Ultrahelitöötlus raku lüüsi jaoks: rakkude katkestamine ja ekstraheerimine
Ultraheli rakkude lüüs on proovide ettevalmistamise protseduur biotehnoloogia laborites. Eesmärk on lõhkuda rakuseinad või terved rakud bioloogiliste molekulide vabastamiseks. Sonikatsiooni kasutatakse tavaliselt rakkude lüüsiks, rakkude katkestamiseks ja ekstraheerimiseks. Sonikaatorite peamine eelis rakkude lüüsi jaoks seisneb protsessi parameetrite, näiteks intensiivsuse ja temperatuuri täpses kontrollis, võimaldades õrna, kuid tõhusat rakkude katkestamist ja ekstraheerimist.
Rakkude lüüs ultraheli abil
Ultraheli rakkude lüüs kasutab kõrgsageduslikke helilaineid, et murda avatud rakke ja ekstraheerida nende sisu. Sonikatsioon on loodud ja usaldusväärne rakkude katkestamiseks ja rakusisese materjali, näiteks plasmiidide, retseptorite analüüside, valkude, DNA ja RNA ekstraheerimiseks. Protsessi parameetrite reguleerimisega saab ultraheli intensiivsust peenhäälestada vastavalt konkreetsetele rakendusnõuetele, alates õrnast kuni intensiivse ultrahelitöötluseni. Lüüsile järgnevad etapid hõlmavad fraktsioneerimist, organelli eraldamist ning valgu ekstraheerimist ja puhastamist. Saadud lüsaat tuleb eraldada edasisteks uuringuteks või rakendusteks, näiteks proteoomilisteks uuringuteks.
Kui soovite rohkem teada saada ultrahelitöötluse kohta lüüsi, rakkude katkestamise ja ekstraheerimise jaoks, võtke meiega ühendust. Meie tehnilisel meeskonnal on hea meel teiega koos töötada teie rakulüüsi projektis.
Ultraheli homogenisaatorid UP100H (100 vatti) ja UP400St (400 vatti): ultrahelitöötlus rakkude lüüsiks ja ekstraheerimiseks.
Ultrahelitöötluse kasutamise eelised rakkude lüüsiks
Võrreldes teiste rakkude lüüsi- ja ekstraheerimismeetoditega on ultraheli rakkude lüüsil mitmeid eeliseid:
- Kiirus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on kiire meetod, mis võib mõne sekundi jooksul avatud rakke murda. See on palju kiirem kui muud meetodid, nagu homogeniseerimine, külmsulatamine või helmeste freesimine.
- Tõhusust: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada väikeste, suurte või mitme proovi töötlemiseks korraga, muutes selle tõhusamaks kui muud meetodid, mis nõuavad väikeste proovide individuaalset töötlemist.
- Kemikaalivaba: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on mitteinvasiivne meetod, mis ei nõua karmide kemikaalide või ensüümide kasutamist. See muudab selle ideaalseks rakendusteks, kus tuleb säilitada raku sisu terviklikkus. Proovide soovimatut saastumist on võimalik vältida.
- Suur saagikus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine võivad eraldada rakulise sisu, sealhulgas DNA, RNA ja valkude suure saagise. Seda seetõttu, et kõrgsageduslikud helilained murravad rakuseinad lahti ja vabastavad sisu ümbritsevasse lahusesse.
- Temperatuuri reguleerimine: Keerukad ultrahelid võimaldavad proovi täpset temperatuuri reguleerimist. Hielscheri digitaalsed sonikaatorid on varustatud ühendatava temperatuurianduri ja temperatuuri jälgimise tarkvaraga.
- Reprodutseeritav: Ultraheli rakkude lüüsi protokolle saab hõlpsasti reprodutseerida ja isegi sobitada erinevate suuremate või väiksemate proovimahtudega lihtsa lineaarse skaala abil.
- Mitmekülgne: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada paljude rakutüüpide, sealhulgas bakterite, pärmi, seente, taimede ja imetajate rakkude ekstraheerimiseks. Seda saab kasutada ka erinevat tüüpi molekulide, sealhulgas valkude, DNA, RNA ja lipiidide ekstraheerimiseks.
- Paljude proovide samaaegne ettevalmistamine: Hielscher Ultrasonics pakub mitmeid lahendusi paljude proovide mugavaks töötlemiseks täpselt samades protsessitingimustes. See muudab lüüsi ja ekstraheerimise proovi ettevalmistamise etapi väga tõhusaks ja ajasäästlikuks.
- Lihtne kasutada: Ultraheli rakkude lüüsi- ja ekstraheerimisseadmed on kergesti kasutatavad ja nõuavad minimaalset koolitust. Seadmed on ka ökonoomsed, kuna tegemist on ühekordse investeeringuga, mille puhul ei nõuta müügivahendite tagasiostmist. See muudab selle atraktiivseks paljudele teadlastele ja laboritele.
Üldiselt on ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine kiire, tõhus, täpselt kontrollitav ja mitmekülgne meetod rakulise sisu ekstraheerimiseks. Selle eelised alternatiivsete meetodite ees muudavad selle atraktiivseks valikuks paljude teadusuuringute ja tööstuslike rakenduste jaoks.
Ultraheli rakkude lüüsi tööpõhimõte
Ultraheli rakkude lüüsimine ja ekstraheerimine kasutab rakkude häirimiseks ja nende sisu ekstraheerimiseks kõrgsageduslikke helilaineid. Helilained tekitavad ümbritsevas vedelikus rõhumuutusi, põhjustades väikeste mullide moodustumist ja kokkuvarisemist protsessis, mida nimetatakse kavitatsiooniks. Need mullid tekitavad lokaliseeritud väga intensiivseid mehaanilisi jõude, mis võivad murda avatud rakke ja vabastada nende sisu ümbritsevasse lahusesse.
Rakkude lüüs ultrasonikaatori abil hõlmab tavaliselt järgmisi samme:
- Proov asetatakse vedela puhvriga katseklaasi või anumasse.
- Proovi sisestatakse ultraheli sond ja rakendatakse kõrgsageduslikke helilaineid umbes 20-30 kHz.
- Ultraheli lained põhjustavad ümbritsevas vedelikus võnkumist ja kavitatsiooni, tekitades lokaliseeritud jõude, mis lõhuvad avatud rakke ja vabastavad nende sisu.
- Proovi tsentrifuugitakse või filtreeritakse, et eemaldada rakujäägid, ja ekstraheeritud sisu kogutakse järgnevaks analüüsiks.
Võimas ultraheli lained häirivad bioloogiliste struktuuride rakumaatriksit ja vabastavad bioaktiivsed ühendid. Intensiivistatakse massiülekannet taimse materjali ja lahusti (nt puhvri) vahel. (graafik: ©Vilkhu et al., 2006)
Tavaliste lüüsimeetodite puudused
Laborites töötamise ajal olete võib-olla juba kogenud rakkude lüüsi vaeva, kasutades traditsioonilisi mehaanilisi või keemilisi lüüsiprotokolle.
- Mehaaniline lüüs: Mehaanilistel lüüsimeetoditel, nagu lihvimine mördi ja uhmriga või homogeniseerimine prantsuse pressi, helmesveski või rootor-staatorisüsteemi abil, puuduvad sageli eelkontrolli ja reguleerimise võimalused. See tähendab, et jahvatamise ja jahvatamise kasutamine võib kiiresti tekitada soojust ja nihkejõude, mis võivad proovi ja denatureerimisvalke kahjustada. Need võivad olla ka aeganõudvad ja nõuda suurtes kogustes lähteaineid.
- Keemiline lüüs: Keemilise lüüsi meetodid, näiteks pesuvahendil põhinev lüüs, võivad proovi kahjustada, häirides lipiidide kahekihilist kihti ja denatureerivaid valke. Need võivad vajada ka mitut etappi ja võivad jätta jääksaasteaineid, mis segavad järgnevaid rakendusi. Pesuvahendi optimaalse annuse leidmine on täiendav väljakutse.
- Külmumis-sulatustsüklid: Külmumis-sulatustsüklid võivad põhjustada rakumembraanide rebenemist, kuid korduvad tsüklid võivad põhjustada ka valkude denaturatsiooni ja lagunemist. See meetod võib nõuda ka mitut tsüklit, mis võib olla aeganõudev ja põhjustab sageli madalamat saagikust.
- Ensümaatiline lüüs: Ensümaatilise lüüsi meetodid võivad olla spetsiifilised teatud rakutüüpidele ja nõuda mitut sammu, muutes need aeganõudvaks. Samuti tekitavad nad jäätmeid ja vajavad hoolikat optimeerimist, et vältida proovi lagunemist. Ensümaatilise lüüsi komplektid on sageli kallid. Kui teie praegune ensümaatilise lüüsi protseduur annab ebapiisavaid tulemusi, võib rakkude katkestamise intensiivistamiseks rakendada ultrahelitöötlust sünergilise meetodina.
Erinevalt tavapärastest mehaanilistest ja keemilistest rakkude lüüsi meetoditest on ultrahelitöötlus väga tõhus ja usaldusväärne vahend rakkude lagunemiseks, mis võimaldab täielikku kontrolli ultrahelitöötluse parameetrite üle. See tagab materjalide vabanemise ja toote puhtuse kõrge selektiivsuse. [vrd Balasundaram et al., 2009]
See sobib kõigile rakutüüpidele ja on hõlpsasti rakendatav nii väikestes kui ka suurtes mastaapides – alati kontrollitud tingimustes. Ultrasonikaatorid on kergesti puhastatavad. Ultraheli homogenisaatoril on alati puhas kohapeal (CIP) ja steriliseerimise (SIP) funktsioon. Sonotrode koosneb massiivsest titaanist sarvest, mida saab pühkida või loputada vees või lahustis (sõltuvalt töökeskkonnast). Ultrasonikaatorite hooldamine on tingitud nende vastupidavusest peaaegu tähelepanuta jäetud.
Ultraheli lüüs ja rakkude katkestamine
Üldiselt võtab proovide lüüs laboris aega 15 sekundit kuni 2 minutit. Kuna ultrahelitöötluse intensiivsust on väga lihtne reguleerida amplituudiga, seades ultrahelitöötluse aja ja valides õige varustuse, on võimalik rakumembraane väga õrnalt või väga järsult häirida, sõltuvalt rakustruktuurist ja lüüsi eesmärgist (nt DNA ekstraheerimine nõuab pehmemat ultrahelitöötlust, bakterite täielik valgu ekstraheerimine nõuab intensiivsemat ultraheliravi). Protsessi ajal toimuvat temperatuuri saab jälgida integreeritud temperatuurianduri abil ja seda saab hõlpsasti reguleerida jahutamisega (jäävann või jahutussärkidega voolurakud) või impulssrežiimis ultrahelitöötlusega. Impulssrežiimi ultrahelitöötluse ajal võimaldavad lühikesed 1-15-sekundilise kestusega ultrahelitöötluse tsüklid soojuse hajutamist ja jahutamist pikemate vahelduvate perioodide jooksul.
Kõik ultraheliga juhitavad protsessid on täielikult reprodutseeritavad ja lineaarselt skaleeritavad.
The VialTweeter on ultraheli homogenisaator paljude proovide samaaegseks, ühtlaseks ja kiireks steriilseks ettevalmistamiseks.
Ultraheli homogenisaatorid rakkude lüüsimiseks ja ekstraheerimiseks
Erinevat tüüpi ultraheli seadmed võimaldavad sobitada proovi ettevalmistamise eesmärki ning tagada kasutajasõbralikkuse ja töömugavuse. Sondi tüüpi ultrasonikaatorid on laboris kõige tavalisemad seadmed. Need sobivad kõige paremini väikeste ja keskmise suurusega proovide valmistamiseks mahuga 0,1 ml kuni 1000 ml. Erinevad võimsuse suurused ja sonotroodid võimaldavad kohandada ultrasonikaatorit proovi mahuga ja anumaga kõige tõhusamate ja tõhusamate ultrahelitöötluse tulemuste saavutamiseks. Ultraheli sondi seade on parim valik, kui tuleb valmistada üksikuid proove.
Kui tuleb valmistada rohkem proove, nt 8-10 viaali rakulahust, on intensiivsem kaudne ultrahelitöötlus ultraheli süsteemidega, nagu VialTweeter või ultraheli kuppel, kõige sobivam homogeniseerimismeetod tõhusaks lüüsiks. Mitmed viaalid töödeldakse ultraheliga samal ajal, sama intensiivsusega. See säästab mitte ainult aega, vaid tagab ka kõigi proovide võrdse käsitlemise, mis muudab proovide tulemused usaldusväärseks ja võrreldavaks. Lisaks välditakse kaudse ultrahelitöötluse ajal ristsaastumist ultraheli sonotrode (tuntud ka kui ultraheli sond, sarv, ots või sõrm) sukeldamisega. Kuna kasutatakse individuaalselt proovi suurusega sobitatud viaale, jäetakse ära aeganõudev puhastamine ja proovide kadu anumate dekanteerimise tõttu. Mitmekihiliste või mikrotiiterplaatide ühtlaseks ultrahelitöötluseks pakub Hielscher UIP400MTP.
Suuremate mahtude jaoks, nt rakuekstraktide kaubanduslikuks tootmiseks, sobivad kõige paremini voolurakureaktoriga pidevad ultraheli süsteemid. Töödeldud materjali pidev ja ühtlane vool tagab ühtlase ultrahelitöötluse. Kõiki ultraheli lagunemisprotsessi parameetreid saab optimeerida ja kohandada vastavalt rakenduse ja konkreetse rakumaterjali nõuetele.
Bakterirakkude ultraheli lüüsimise näidisprotseduur:
- Rakususpensiooni valmistamine: rakugraanulid tuleb puhverlahuses täielikult suspendeerida, homogeniseerides (valige puhverlahus, mis sobib järgneva analüüsiga, nt spetsiifiline kromatograafiameetod). Vajadusel lisage lüsosüüme ja / või muid lisaaineid (need peavad sobima ka eraldus- / puhastusvahenditega). Segage / homogeniseerige lahus õrnalt kerge ultrahelitöötlusega, kuni saavutatakse täielik suspensioon.
- Ultraheli lüüs: Asetage proov jäävanni. Rakkude katkestamise korral sonikeerige suspensioon 60-90-sekundiliste purunemiste korral (kasutades sonikaatori pulsirežiimi).
- Eraldamine: lüsaati tsentrifuugitakse (nt 10 minutit 10 000 x g juures; 4 °C juures). Supernatant eraldatakse ettevaatlikult rakupelletist. Supernatant on kogu rakulüsaat. Pärast supernatandi filtreerimist saate lahustuva rakuvalgu selitatud vedeliku.
Kõige tavalisemad rakendused ultraheli jaoks bioloogias ja biotehnoloogias on:
- Rakuekstrakti valmistamine
- Pärmi, bakterite, taimerakkude, pehme- või kõvarakulise koe, nukleiinmaterjali katkestamine
- valgu ekstraheerimine
- Ensüümide ettevalmistamine ja eraldamine
- Antigeenide tootmine
- DNA ekstraheerimine ja / või sihipärane killustumine
- liposoomi valmistamine
Rakkude katkestamine sondi tüüpi ultrasonikaatoriga on tõhus proovi ettevalmistamise meetod.
Allolev tabel annab teile ülevaate meie ultrasonikaatoritest rakkude katkestamiseks ja ekstraheerimiseks. Klõpsake seadme tüübil, et saada lisateavet iga ultraheli homogenisaatori kohta. Meie hästi koolitatud ja pikaajaliste kogemustega tehniline personal aitab teil hea meelega valida oma proovide jaoks kõige sobivama ultrasonikaatori!
| Partii maht | Voolukiirus | Soovitatavad seadmed |
|---|---|---|
| kuni 10 viaali või tuubi | mujal liigitamata | VialTweeter |
| mitmekihilised / mikrotiiterplaadid | mujal liigitamata | UIP400MTP |
| mitu toru / anumat | mujal liigitamata | kupael |
| 1 kuni 500 ml | 10 kuni 200 ml / min | UP100H |
| 10 kuni 1000 ml | 20 kuni 200 ml / min | UP200Ht, UP200St |
| 10 kuni 2000 ml | 20 kuni 400 ml / min | UP400St |
Ultraheli mitmesugused rakendused hargnevad biotehnoloogia, biotehnoloogia, mikrobioloogia, molekulaarbioloogia, biokeemia, immunoloogia, bakterioloogia, viroloogia, proteoomika, geneetika, füsioloogia, rakubioloogia, hematoloogia ja botaanika sektorites.
Lüüs: rakustruktuuride purustamine
Rakke kaitseb poolläbilaskev plasmamembraan, mis koosneb fosfolipiidide kahekihilisest kihist (ka valk-lipiidide kahekihiline; moodustatud hüdrofoobsete lipiidide ja hüdrofiilsete fosforimolekulide poolt koos sisseehitatud valgumolekulidega) ja loob barjääri raku sisemuse (tsütoplasma) ja rakuvälise keskkonna vahel. Taimerakke ja prokarüootseid rakke ümbritseb rakusein. Tselluloosi mitmekihilise paksuse rakuseina tõttu on taimerakke raskem lüüsida kui loomarakke. Raku sisemus, nagu organellid, tuum, mitokondrioon, stabiliseeritakse tsütoskeleti abil.
Rakkude lüüsimisega on selle eesmärk organellide, valkude, DNA, mRNA või muude biomolekulide ekstraheerimine ja eraldamine.
Rakkude lüüsi tavapärased meetodid ja nende puudused
Rakkude lüseerimiseks on mitmeid meetodeid, mida saab jagada mehaanilisteks ja keemilisteks meetoditeks, mis hõlmavad detergentide või lahustite kasutamist, kõrgsurve rakendamist või helmesveski või prantsuse pressi kasutamist. Nende meetodite kõige problemaatilisem puudus on protsessi parameetrite keeruline kontroll ja reguleerimine ning seeläbi mõju.
Allolevas tabelis on esitatud tavaliste lüüsimeetodite peamised puudused:
Tabel: Rakkude lüüsi tavapärastel meetoditel on suured puudused
Lüüsi protseduur
Lüüs on tundlik protsess. Lüüsi käigus rakumembraani kaitse hävitatakse, kuid tuleb vältida ekstraheeritud valkude inaktiveerimist, denatureerimist ja lagunemist mittefüsioloogilises keskkonnas (kõrvalekalle pH-väärtusest). Seetõttu viiakse lüüs üldiselt läbi puhverlahuses. Enamik raskusi tuleneb kontrollimatust rakukatkestusest, mille tulemuseks on kogu rakusisese materjali sihtotstarbetu vabanemine või / ja sihtprodukti denatureerimine.
Korduma kippuvad küsimused ultrahelitöötluse ja rakkude lüüsi kohta
- Kas saate ultrahelitöötlusega rakke lüüsida? Jah, ultrahelitöötlus lüüsib rakke tõhusalt, kasutades kõrgsageduslikke ultraheli laineid, mis indutseerivad kavitatsiooni- nähtus, kus rakususpensioonis moodustuvad ja ägedalt kokku varisevad väikesed aurumullid. Saadud mehaanilised jõud häirivad rakumembraane ja hõlbustavad rakusiseste komponentide vabanemist vedelikku.
- Kuidas kasutada sonikaatorit rakkude lüüsiks? Sonikaatori kasutamine raku lüüsiks hõlmab sonikaatori sondi sukeldamist rakususpensiooni ja selliste parameetrite reguleerimist nagu amplituud ja impulsi kestus. Protsessi tuleb hoolikalt jälgida, et optimeerida rakkude häireid, minimeerides samal ajal valkude denaturatsiooni ja ensüümide inaktiveerimist.
- Milline on ultrahelitöötluse põhimõte raku lüüsi jaoks? Sonikatsioon toimib akustilise kavitatsiooni põhimõttel. Ultraheli energia edastatakse vedelasse keskkonda, põhjustades kiireid rõhu kõikumisi, mis põhjustavad mikromullide moodustumist ja implosiooni. Need implosioonid tekitavad intensiivseid nihkejõude ja lokaliseeritud kõrgeid temperatuure, häirides rakustruktuure ja suurendades lüsaadi homogeensust.
- Kui kaua võtab raku lüüsi ultrahelitöötlus? Raku lüüsi ultrahelitöötluse kestus võib oluliselt varieeruda sõltuvalt sellistest teguritest nagu rakutüüp, raku tihedus, sonikaatori võimsus ja kasutatav spetsiifiline protokoll. Tüüpilised protseduurid võivad ulatuda mitmest sekundist mõne minutini, mida sageli tehakse tsüklitena, et juhtida soojuse teket ja tagada ühtlane rakkude katkestus.
- Milline on ultrahelitöötluse eesmärk valgu ekstraheerimisel? Valgu ekstraheerimisel aitab ultrahelitöötlus tõhusalt rebeneda rakumembraane ja lahustada valke. See meetod on eriti kasulik valkude vabastamiseks rakukambritest, mistõttu on oluline valmistada lüsaate, millest valke puhastatakse või analüüsitakse.
- Miks kasutatakse ultrahelitöötlust ekstraheerimiseks? Sonikatsiooni eelistatakse ekstraheerimiseks tänu oma kiirele toimele ja võimele rakendada sihipärast energiat, lagundades rakustruktuure, et vabastada bioaktiivseid molekule ilma karmide keemiliste töötlusteta, säilitades seeläbi ekstraheeritud ühendite funktsionaalse terviklikkuse.
- Kas ultrahelitöötlus häirib valgu-valgu koostoimeid? Kuigi ultrahelitöötlus võib tõhusalt häirida rakumembraane, võib see häirida ka valgu-valgu koostoimeid. Häirete tase sõltub ultrahelitöötluse intensiivsusest ja kokkupuute kestusest, mis võib viia valgukomplekside denatureerimiseni või dissotsiatsioonini, mis võib mõjutada järgnevaid analüütilisi või funktsionaalseid uuringuid.
- Kas ultrahelitöötlust saab kasutada E. coli lüüsimiseks? Hielscheri sonikaatorid on eriti tõhusad bakterirakkude, näiteks E. coli lüüsimiseks, millel on tugevad rakuseinad. See meetod pakub füüsikalist meetodit rakuseina ja membraani lõikamiseks, muutes selle eelistatud meetodiks bakteriaalsete lüsaatide valmistamiseks molekulaarbioloogia ja biokeemia laborites.
Kirjandus / viited
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.