Lüüsi ultrahelitöötlus: rakkude katkestamine ja ekstraheerimine

Rakkude lagunemine või lüüs on biotehnoloogia laborites igapäevase proovide ettevalmistamise tavaline osa. Lüüsi eesmärk on häirida rakuseina osi või kogu rakku, et vabastada bioloogilisi molekule. Ultraheli homogenisaatoreid kasutatakse laialdaselt rakkude edukaks lüüsiks. Keerukate ultrasonikaatorite peamiseks eeliseks on täpne kontroll protsessi parameetrite üle, nagu intensiivsus ja temperatuur, mis võimaldab õrna, kuid väga tõhusat rakkude katkestamist ja ekstraheerimist.

Rakkude lüüs ultraheli abil

Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on meetod, mida kasutatakse avatud rakkude purustamiseks ja sisu ekstraheerimiseks kõrgsageduslike helilainete, s.t. ultraheli abil. Sonikatsioon on lüüsitehnika, mida kasutatakse laialdaselt väljakujunenud ja usaldusväärsete meetoditena rakkude katkestamiseks ja rakusisese materjali ekstraheerimiseks. Ultraheli lüüs on usaldusväärne meetod lüsaadi valmistamiseks, nt plasmiid, retseptori testid, valgud, DNA, RNA jne. Kuna ultraheli intensiivsust saab protsessi parameetrite reguleerimisega tasandada, saab optimaalse ultrahelitöötluse intensiivsuse väga pehmest intensiivseks seada iga aine ja söötme jaoks eraldi, et see vastaks konkreetsetele rakendusnõuetele. Lüüsi järgmised etapid on fraktsioneerimine, organellide eraldamine või / ja valkude ekstraheerimine ja puhastamine. Ekstraheeritud materjal (= lüsaat) tuleb eraldada ja seda tuleb täiendavalt uurida või kasutada, nt proteoomilisteks uuringuteks.

Võrreldes teiste rakkude lüüsi ja ekstraheerimismeetoditega on ultraheli rakkude lüüsil mitmeid eeliseid:

1. Kiirus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on kiire meetod, mis võib mõne sekundi jooksul murda avatud rakke. See on palju kiirem kui muud meetodid, nagu homogeniseerimine, freez-sulatamine või helmeste jahvatamine.
2. Tõhusus: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada väikeste, suurte või mitme proovi raviks korraga, muutes selle tõhusamaks kui muud meetodid, mis nõuavad väikeste proovide individuaalset töötlemist.
3. Kemikaalivaba: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on mitteinvasiivne meetod, mis ei nõua karmide kemikaalide või ensüümide kasutamist. See muudab selle ideaalseks rakenduste jaoks, kus tuleb säilitada raku sisu terviklikkus. Proovide soovimatut saastumist on võimalik vältida.
4. Suur saagikus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine võivad eraldada rakulise sisu, sealhulgas DNA, RNA ja valkude suure saagise. Seda seetõttu, et kõrgsageduslikud helilained lõhuvad rakuseinad lahti ja vabastavad sisu ümbritsevasse lahusesse.
5. Temperatuuri kontroll: Keerukad ultraheliuuringud võimaldavad proovi täpset temperatuuri reguleerimist. Hielscheri digitaalne ultraheli on varustatud ühendatava temperatuurianduri ja temperatuuri jälgimise tarkvaraga.
6. Reprodutseeritav: Ultraheli rakkude lüüsi protokolle saab hõlpsasti paljundada ja isegi sobitada erinevate suuremate või väiksemate proovimahtudega lihtsa lineaarse skaala abil.
7. Mitmekülgne: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada paljude rakutüüpide, sealhulgas bakterite, pärmi, seente, taime- ja imetajarakkude ekstraheerimiseks. Seda saab kasutada ka erinevat tüüpi molekulide, sealhulgas valkude, DNA, RNA ja lipiidide ekstraheerimiseks.
8. Paljude proovide samaaegne ettevalmistamine: Hielscher Ultrasonics pakub mitmeid lahendusi paljude proovide mugavaks töötlemiseks täpselt samades protsessitingimustes. See muudab lüüsi ja ekstraheerimise proovi ettevalmistamise etapi väga tõhusaks ja ajasäästlikuks.
9. Lihtne kasutada: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimise seadmeid on lihtne kasutada ja see nõuab minimaalset koolitust. Seadmed on ka ökonoomsed, kuna tegemist on ühe investeeringuga, mille puhul ei ole vaja realiseerimist uuesti osta. See muudab selle atraktiivseks paljudele teadlastele ja laboritele.

Üldiselt on ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine kiire, tõhus, täpselt kontrollitav ja mitmekülgne meetod rakulise sisu ekstraheerimiseks. Selle eelised alternatiivsete meetodite ees muudavad selle atraktiivseks valikuks paljude teadusuuringute ja tööstuslike rakenduste jaoks.

Ultraheli rakkude lüüsi tööpõhimõte

Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine kasutab kõrgsageduslikke helilaineid rakkude häirimiseks ja nende sisu ekstraheerimiseks. Helilained tekitavad ümbritsevas vedelikus rõhumuutusi, põhjustades väikeste mullide moodustumist ja kokkuvarisemist protsessis, mida nimetatakse kavitatsiooniks. Need mullid tekitavad lokaliseeritud väga intensiivseid mehaanilisi jõude, mis võivad murda avatud rakke ja vabastada nende sisu ümbritsevasse lahusesse.

Rakkude lüüs ultrasonikaatori abil hõlmab tavaliselt järgmisi samme:

• Proov asetatakse vedelikupuhvriga torusse või anumasse.
• Proovi sisestatakse ultraheli sond ja rakendatakse kõrgsageduslikke helilaineid umbes 20-30 kHz.
• Ultraheli lained põhjustavad ümbritsevas vedelikus võnkumist ja kavitatsiooni, tekitades lokaliseeritud jõude, mis lõhuvad avatud rakke ja vabastavad nende sisu.
• Proov tsentrifuugitakse või filtreeritakse rakujäätmete eemaldamiseks ja ekstraheeritud sisu kogutakse järgnevaks analüüsiks.

Võimas ultraheli lained häirivad bioloogiliste struktuuride rakumaatriksit ja vabastavad bioaktiivsed ühendid. Massülekanne taimse materjali ja lahusti (nt puhvri) vahel intensiivistub. (graafik: ©Vilkhu et al., 2006)

Tavaliste lüüsimeetodite puudused

Laborites töötades olete võib-olla juba kogenud rakkude lüüsi vaeva, kasutades traditsioonilisi mehaanilisi või keemilisi lüüsiprotokolle.

• Mehaaniline lüüs: Mehaanilise lüüsi meetoditel, nagu jahvatamine mördi ja uhmriga või homogeniseerimine prantsuse pressi, helmesveski või rootor-staatori süsteemi abil, puuduvad sageli eelnevad kontrolli- ja reguleerimisvõimalused. See tähendab, et jahvatamise ja jahvatamise kasutamine võib kiiresti tekitada soojust ja nihkejõude, mis võivad proovi kahjustada ja valke denatureerida. Need võivad olla ka aeganõudvad ja nõuda suurtes kogustes lähtematerjali.
• Keemiline lüüs: Keemilise lüüsi meetodid, näiteks pesuainepõhine lüüs, võivad proovi kahjustada, häirides lipiidide kahekihilist ja denatureerides valke. Need võivad nõuda ka mitut etappi ja võivad jätta jääksaasteaineid, mis häirivad järgnevaid rakendusi. Pesuvahendi optimaalse annuse leidmine on täiendav väljakutse.
• Külmumis- ja sulatustsüklid: Külmumis-sulatustsüklid võivad põhjustada rakumembraanide rebenemist, kuid korduvad tsüklid võivad põhjustada ka valgu denaturatsiooni ja lagunemist. See meetod võib nõuda ka mitut tsüklit, mis võib olla aeganõudev ja mille tulemuseks on sageli madalam saagikus.
• Ensümaatiline lüüs: Ensümaatilised lüüsimeetodid võivad olla teatud rakutüüpidele spetsiifilised ja nõuda mitut sammu, muutes need aeganõudvaks. Samuti tekitavad need jäätmeid ja nõuavad hoolikat optimeerimist, et vältida proovi lagunemist. Ensümaatilise lüüsi komplektid on sageli kallid. Kui teie praegune ensümaatilise lüüsi protseduur ei anna piisavalt tulemusi, võib rakkude häirete intensiivistamiseks rakendada ultrahelitöötlust kui sünergistlikku meetodit.

Erinevalt tavapärastest mehaanilistest ja keemilistest rakulüüsimeetoditest on ultrahelitöötlus väga tõhus ja usaldusväärne vahend rakkude lagunemiseks, mis võimaldab täielikku kontrolli ultrahelitöötluse parameetrite üle. See tagab materjalide vabanemise ja toote puhtuse kõrge selektiivsuse. [vrd Balasundaram et al., 2009]
See sobib kõigile rakutüüpidele ja on kergesti rakendatav nii väikeses kui ka suures mahus – alati kontrollitud tingimustes. Ultrasonikaatorid on kergesti puhastatavad. Ultraheli homogenisaatoril on alati puhas kohapeal (CIP) ja steriliseerimine kohapeal (SIP) funktsioon. Sonotrode koosneb massiivsest titaansarvest, mida saab pühkida või loputada vees või lahustis (sõltuvalt töövahendist). Ultrasonikaatorite hooldus on tingitud nende tugevusest, mis on peaaegu tähelepanuta jäetud.

Ultraheli lüüsi ja rakkude häired

Üldiselt võtab proovide proovide lüüs 15 sekundi ja 2 minuti jooksul. Kuna ultrahelitöötluse intensiivsust on väga lihtne reguleerida, määrates ultrahelitöötluse ajal amplituudi ning valides õige seadme, on rakumembraane võimalikult õrnalt või väga järsult katkestada, sõltuvalt rakustruktuurist ja lüüsi eesmärgist ( nt DNA ekstraheerimine nõuab pehmemat ultrahelitöötlust, bakterite täieliku valgu ekstraheerimine nõuab intensiivsemat ultraheliravi). Protsessi ajal temperatuuri saab jälgida integreeritud temperatuurianduriga ja seda saab hõlpsasti juhtida jahutamisega (jäävannid või vooluaknad jahutussärgiga) või ultraheliga impulssrežiimis. Impulssrežiimi ultrahelitöötluse ajal võimaldavad lühikesed ultrahelitöötlustsüklid pikkusega 1-15 sekundit pikkade perioodide jooksul soojuse hajumist ja jahutamist.
Kõik ultraheli-juhitavad protsessid on täielikult reprodutseeritavad ja lineaarselt kohandatavad.

Ultraheli homogenisaatorid rakkude lüüsiks ja ekstraheerimiseks

Erinevat tüüpi ultraheli seadmed võimaldavad sobitada proovi ettevalmistamise eesmärki ning tagada kasutajasõbralikkus ja töömugavus. Sondi tüüpi ultrasonikaatorid on laboris kõige levinumad seadmed. Need sobivad kõige paremini väikeste ja keskmise suurusega proovide ettevalmistamiseks mahuga 0,1 ml kuni 1000 ml. Erinevad võimsuse suurused ja sonotroodid võimaldavad kohandada ultrasonikaatorit proovi mahule ja anumale kõige tõhusamate ja tõhusamate ultrahelitöötlustulemuste saamiseks. Ultraheli sondi seade on parim valik, kui tuleb ette valmistada üksikud proovid.

Kui tuleb valmistada rohkem proove, nt 8-10 viaali rakulahust, on tõhusa lüüsi jaoks kõige sobivam homogeniseerimismeetod intensiivne kaudne ultrahelitöötlus ultraheli süsteemidega, nagu VialTweeter või ultraheli cuphorn. Mitu viaali töödeldakse samal ajal sama intensiivsusega. See säästab mitte ainult aega, vaid tagab ka kõigi proovide ühesuguse töötlemise, mis muudab proovide tulemused usaldusväärseks ja võrreldavaks. Lisaks välditakse kaudse ultrahelitöötluse ajal ristsaastumist ultraheli sonotrode (tuntud ka kui ultraheli sond, sarv, ots või sõrm) sukeldamisega. Kuna kasutatakse individuaalselt ja valimi suurusega sobivaid viaale, jäetakse ära aeganõudev puhastamine ja anumate dekanteerimisest tingitud proovikadu. Multiwell- või mikrotiiterplaatide ühtlaseks ultrahelitöötluseks pakub Hielscher UIP400MTP-d.
Suuremateks kogusteks, näiteks rakuekstraktide kaubanduslikuks tootmiseks, on kõige sobivamad voolureaktori pidevad ultraheli süsteemid. Töödeldud materjali pidev ja ühtlane voog tagab ühtlase ultraheliga töötlemise. Kõiki ultraheli lagunemise protsessi parameetreid saab optimeerida ja kohandada vastavalt rakenduse ja konkreetse rakumaterjali nõuetele.
 
 
Bakterirakkude ultrahelilüüsimise näidisprotseduur:

• Rakusisuspensiooni valmistamine: rakupelletid tuleb homogeniseerimisel puhverlahuses täiesti suspendeerida (vali puhverlahus, mis sobib järgneva analüüsiga, nt spetsiifiline kromatograafiline meetod). Vajadusel lisage vajadusel lüsosüüme ja / või muid lisandeid (need peavad sobima ka separatsiooni- / puhastusvahenditega). Lahus segatakse / homogeniseeritakse kerge ultraheliga töötlemisel, kuni saavutatakse täielik suspensioon.
• Ultraheli lüüs: asetage proov jäävanni. Rakuhäirete korral sonikeerige suspensioon 60-90 sekundi jooksul (kasutades ultraheliatori impulsi režiimi).
• Eraldamine: lüsaati tsentrifuugige (nt 10 minutit 10 000 x g juures 4 ° C juures). Eraldi supernatant rakukultuuris ettevaatlikult. Supernatant on kogu rakulüsaat. Pärast supernatandi filtreerimist saadakse lahustuva raku valgu läbipaistev vedelik.

 
 
Bioloogias ja biotehnoloogias ultraheligaatorite kõige tavalisemad rakendused on järgmised:

• Rakuekstrakti valmistamine
• Pärmi, bakterite, taimerakkude, pehmete või kõvarakuliste kudede, nukleiinmaterjali häired
• Valgu ekstraheerimine
• Ensüümide valmistamine ja eraldamine
• Antigeenide tootmine
• DNA ekstraheerimine ja / või sihtmärgistatud killustatus
• liposoomide valmistamine