Ultraheli töötlus rakkude lüüsiks: rakkude lõhkumine ja ekstraheerimine
Ultraheli rakulüüs on kaasaegsetes biotehnoloogialaboratooriumides laialdaselt kasutatav proovi ettevalmistamise meetod. Selle peamine eesmärk on lõhkuda rakumembraane või terveid rakke, et vabastada rakusiseseid komponente, näiteks valke, nukleiinhappeid või organelle. Igapäevases laboritöös tähendab see, et ultraheli töötlus (sonikeerimine) on standardmeetod kontrollitud rakkude lõhkumiseks ja biomolekulide tõhusaks ekstraheerimiseks. Sonikaatorite peamine eelis seisneb nende võimes täpselt reguleerida kriitilisi protsessiparameetreid, sealhulgas ultraheli intensiivsust, pulseerimist ja temperatuuri reguleerimist. See kontroll võimaldab teadlastel saavutada usaldusväärse lüüsi, minimeerides samal ajal tundlike biomolekulide termilist või mehaanilist kahjustamist, mille tulemuseks on õrn, kuid väga tõhus ekstraheerimisprotsess.
Rakkude lüüs sonikaatoritega
Ultraheli rakulüüs kasutab akustilist kavitatsiooni rakumembraanide lõhkumiseks ja rakusiseste molekulide vabastamiseks. Hielscher Ultrasonics pakub klassikalist sondtüüpi sonikaatorit ning mitme proovi sonikaatoreid steriilseks töötlemiseks: VialTweeter mitme tuubi ja viaali jaoks ning 96-süvendilist plaadisonikaatorit UIP400MTP standardsete mikroplaatide jaoks.
Hielscher Ultrasonics pakub võimsaid kontaktivabu sonikaatoreid proovide ettevalmistamiseks ja kliiniliseks analüüsiks. Mitmesüvendilise plaadi sonikaator UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn ja läbivoolusonikaator GDmini2 töötlevad proove steriilsetes tingimustes.
Ultraheli homogenisaatorid UP100H (100 vatti) ja UP400St (400 vatti): ultraheli töötlus rakkude lüüsiks ja ekstraheerimiseks.
Ultraheli homogenisaatorid rakkude lüüsiks ja ekstraheerimiseks
| Ultraheliseadme tüüp | Rakendusfookus | Proovi maht | Tüüpiline kasutusjuht | Eelised | Näidismudelid |
|---|---|---|---|---|---|
| Sondtüüpi sonikaatorid | Ühe proovi ultraheli töötlus | 0,1 mL kuni ~1000 mL | Rakkude lüüs, valkude ekstraheerimine, DNA/RNA fragmenteerimine | Täpne energia reguleerimine; erinevad sonotroodid; optimaalne väikeste kuni keskmiste proovide jaoks | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Mitme suletud viaali paralleelne töötlemine | 8–10 viaali (~1–20 mL igaüks) | Mitme rakususpensiooni standardiseeritud lüüs | Ühtlane ultraheli töötlus; väldib ristsaastumist; korduvate tulemustega | VialTweeter, CupHorn |
| 96-süvendiline plaadisonikaator | Mitmesüvendiliste ja mikrotiiterplaatide ultraheli töötlus | Mikroplaadi formaat | Suure läbilaskevõimega sõeluuringud, proteoomika, rakuanalüüsid | Samaaegne ühtlane ultraheli töötlus kõigis süvendites; ideaalne mitme proovi töövoogude jaoks | UIP400MTP |
| Läbivoolukambriga reaktorid | Pidev ultraheli töötlus suuremate mahtude jaoks | >1 L, skaleeritav | Tööstusliku mastaabi rakkude lõhkumine, ekstraktide tootmine | Pidev töötlemine; skaleeritav; täielik protsessikontroll (amplituud, rõhk, temperatuur) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + läbivoolukamber |
| Steriilsed / kaudse ultraheli töötluse süsteemid | Saastevaba proovide töötlemine | Sõltub viaalist/tuubist/mikroplaadist | Tundlikud proovid, steriilsed keskkonnad, reguleeritud keskkonnad | Sondiga kontakti pole; väldib ülekandumist proovide vahel; minimaalne puhastusvajadus | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Ultraheli töötluse eelised rakkude lüüsiks
Võrreldes teiste rakkude lüüsi ja ekstraheerimise meetoditega on ultraheli rakulüüsil mitu eelist:
- Kiirus: Ultraheli rakulüüs ja ekstraheerimine on kiire meetod, mis suudab rakud avada paari sekundiga. See on palju kiirem kui muud meetodid, näiteks homogeniseerimine, külmutamine-sulatamine või helmesveski.
- Efektiivsus: Ultraheli rakulüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada väikeste, suurte või mitme proovi töötlemiseks korraga, mistõttu see on tõhusam kui muud meetodid, mis nõuavad väikeste proovide eraldi töötlemist.
- Keemiavaba: Ultraheli rakulüüs ja ekstraheerimine on mitteinvasiivne meetod, mis ei nõua karmide kemikaalide ega ensüümide kasutamist. See muudab selle ideaalseks rakenduste jaoks, kus rakusisu terviklikkus tuleb säilitada. Proovide soovimatut saastumist on võimalik vältida.
- Kõrge saagis: Ultraheli rakulüüs ja ekstraheerimine võimaldab ekstraheerida rakusisu, sealhulgas DNA-d, RNA-d ja valke, kõrge saagisega. Seda seetõttu, et kõrgsageduslikud helilained lõhuvad rakuseinad ja vabastavad sisu ümbritsevasse lahusesse.
- Temperatuuri reguleerimine: Täiustatud ultrahelisonikaatorid võimaldavad proovi temperatuuri täpselt juhtida. Hielscheri digitaalsed sonikaatorid on varustatud ühendatava temperatuurianduriga ja temperatuuri jälgimise tarkvaraga.
- Reprodutseeritav: Ultraheli abil toimuva rakkude lüüsi protokolle on lihtne reprodutseerida ja neid saab lihtsa lineaarse suurendamise (scale-up) abil kohandada isegi erinevatele suuremate või väiksemate proovimahtudele.
- Mitmekülgne: Ultraheli abil toimuvat rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada paljude erinevate rakutüüpide ekstraheerimiseks, sealhulgas bakterite, pärmi, seente, taime- ja imetajarakkude puhul. Seda saab kasutada ka erinevat tüüpi molekulide ekstraheerimiseks, sealhulgas valkude, DNA, RNA ja lipiidide puhul.
- Paljude proovide samaaegne ettevalmistamine: Hielscher Ultrasonics pakub mitmeid lahendusi, mis võimaldavad mugavalt töödelda paljusid proove täpselt samadel protsessitingimustel. See muudab lüüsi ja ekstraheerimise proovide ettevalmistamise etapi väga tõhusaks ja ajasäästlikuks.
- Lihtne kasutada: Ultraheli abil toimuva rakkude lüüsi ja ekstraheerimise seadmeid on lihtne kasutada ning need nõuavad minimaalset väljaõpet. Seadmed on ka ökonoomsed, sest tegemist on ühekordse investeeringuga ning ühekordselt kasutatavaid tarvikuid ei ole vaja uuesti osta. See muudab need atraktiivseks paljudele teadlastele ja laboritele.
Kokkuvõttes on ultraheli abil toimuv rakkude lüüs ja ekstraheerimine kiire, tõhus, täpselt juhitav ja mitmekülgne meetod rakusisalduse ekstraheerimiseks. Selle eelised alternatiivsete meetodite ees muudavad selle atraktiivseks valikuks paljudes teadus- ja tööstusrakendustes.
Ultraheli abil toimuva rakkude lüüsi tööpõhimõte
Ultraheli abil toimuv rakkude lüüs ja ekstraheerimine kasutab rakkude lõhkumiseks ja nende sisu ekstraheerimiseks kõrgsageduslikke helilaineid. Helilained tekitavad ümbritsevas vedelikus rõhumuutusi, mille tõttu tekivad väikesed mullid, mis kollabeeruvad – seda protsessi nimetatakse kavitatsiooniks. Need mullid tekitavad lokaalselt väga intensiivseid mehaanilisi jõude, mis võivad rakud lõhkuda ja vabastada nende sisu ümbritsevasse lahusesse.
Rakkude lüüs ultrahelisonikaatori abil hõlmab tavaliselt järgmisi etappe:
- Proov asetatakse vedela puhvriga katseklaasi või anumasse.
- Proovi sisestatakse ultrahelisond ning rakendatakse kõrgsageduslikke helilaineid sagedusega ca 20-30 kHz.
- Ultrahelilained põhjustavad ümbritsevas vedelikus võnkumist ja kavitatsiooni, tekitades lokaalseid jõude, mis lõhuvad rakud ja vabastavad nende sisu.
- Proov tsentrifuugitakse või filtreeritakse rakujääkide eemaldamiseks ning ekstraheeritud sisu kogutakse edasiseks analüüsiks.
Tavaliste lüüsimeetodite puudused
Laboritöös olete võib-olla juba kogenud traditsiooniliste mehaaniliste või keemiliste lüüsiprotokollidega rakkude lüüsimisega kaasnevat vaeva.
- Mehaaniline lüüs: Mehaanilistel lüüsimeetoditel, nagu uhmri ja nuiaga jahvatamine või homogeniseerimine prantsuse pressi, kuulveski või rootor-stator süsteemi abil, puuduvad sageli täpne kontroll ja reguleerimisvõimalused. See tähendab, et jahvatamine ja peenestamine võivad kiiresti tekitada soojust ja nihkejõude, mis võivad proovi kahjustada ja valke denatureerida. Need võivad olla ka aeganõudvad ning vajada suurt hulka lähtematerjali.
- Keemiline lüüs: Keemilised lüüsimeetodid, nagu detergendipõhine lüüs, võivad proovi kahjustada, lõhkudes lipiidide kaksikkihti ja denatureerides valke. Need võivad vajada ka mitut etappi ning jätta jääkreostust, mis segab järgnevaid rakendusi. Detergendi optimaalse doosi leidmine on täiendav väljakutse.
- Külmutus-sulatustsüklid: Külmutus-sulatustsüklid võivad põhjustada rakumembraanide rebenemist, kuid korduvad tsüklid võivad põhjustada ka valkude denatureerumist ja lagunemist. See meetod võib nõuda ka mitut tsüklit, mis võib olla aeganõudev ja annab sageli väiksema saagise.
- Ensümaatiline lüüs: Ensümaatilise lüüsi meetodid võivad olla spetsiifilised teatud rakutüüpidele ja nõuavad mitut sammu, mistõttu need on aeganõudvad. Samuti tekitavad need jäätmeid ja nõuavad hoolikat optimeerimist, et vältida proovi lagunemist. Ensümaatilise lüüsi komplektid on sageli kallid. Kui teie praegune ensümaatilise lüüsi protseduur annab ebapiisavaid tulemusi, saab rakkude lõhkumise tõhustamiseks rakendada ultraheli töötlust (sonikeerimist) sünergilise meetodina.
Erinevalt tavapärastest mehaanilistest ja keemilistest rakkude lüüsi meetoditest on ultraheli töötlus (sonikeerimine) väga tõhus ja usaldusväärne vahend rakkude desintegreerimiseks, mis võimaldab täielikult kontrollida ultraheli töötluse parameetreid. See tagab materjalide vabanemise suure selektiivsuse ja toote puhtuse. [cf. Balasundaram et al., 2009]
See sobib kõikide rakutüüpide jaoks ja on hõlpsasti rakendatav nii väikeses kui ka suures mastaabis – alati kontrollitud tingimustes. Ultraheli homogenisaatoreid on lihtne puhastada. Ultraheli homogenisaator on alati varustatud kohapealse puhastuse (CIP) ja kohapealse steriliseerimise (SIP) funktsiooniga. Sonotrood koosneb massiivsest titaanist sarvest, mida saab pühkida või loputada vees või lahustis (olenevalt töökeskkonnast). Ultraheli homogenisaatorite hooldus on nende vastupidavuse tõttu peaaegu tähtsusetu.
Ultraheli lüüs ja rakkude lõhkumine
Üldjuhul kestab proovide lüüs laboris 15 sekundit kuni 2 minutit. Kuna ultraheli töötluse intensiivsust on väga lihtne reguleerida amplituudi seadistuse ja ultraheli töötluse aja kaudu ning õige seadme valikuga, on võimalik rakumembraane lõhkuda väga õrnalt või väga järsult, olenevalt raku struktuurist ja lüüsi eesmärgist (nt DNA ekstraheerimine nõuab õrnemat ultraheli töötlust, bakterite täielik valkude ekstraheerimine nõuab intensiivsemat ultrahelitöötlust). Protsessi ajal saab temperatuuri jälgida integreeritud temperatuurianduriga ja seda on lihtne kontrollida jahutamise (jäävann või jahutusmantliga läbivoolukambrid) või impulssrežiimis ultraheli töötlusega. Impulssrežiimis ultraheli töötluse ajal võimaldavad lühikesed 1–15 sekundi pikkused ultraheli töötluse impulsitsüklid soojuse hajumist ja jahtumist pikemate vaheaegade ajal.
Kõik ultrahelil põhinevad protsessid on täielikult reprodutseeritavad ja lineaarselt skaleeritavad.
VialTweeter on ultraheli homogenisaator arvukate proovide samaaegseks, ühtlaseks ja kiireks steriilseks ettevalmistamiseks.
- Rakususpensiooni ettevalmistamine: rakupelletid tuleb homogeniseerimise teel täielikult puhverlahuses suspendeerida (valige puhverlahus, mis sobib järgneva analüüsiga, nt konkreetse kromatograafiameetodiga). Lisage vajaduse korral lüsosüüme ja/või muid lisandeid (need peavad sobima ka eraldamis-/puhastusmeetoditega). Segage/homogeniseerige lahust õrnalt kerge ultraheli töötluse all, kuni suspensioon on täielik.
Lugege lähemalt lüsosüümide ja ultraheli töötluse kombinatsiooni sünergiatest! - Ultraheli lüüs: asetage proov jäävanni. Rakkude lõhkumiseks sonikeerige suspensiooni 60–90-sekundiliste impulssidena (kasutades oma sonikaatori impulssrežiimi).
- Eraldamine: tsentrifuugige lüsaati (nt 10 min. 10 000 x g juures; 4degC juures). Eraldage supernatant ettevaatlikult rakupelletist. Supernatant on kogu rakulüsaat. Pärast supernatandi filtreerimist saate lahustuva rakuvalgu selitatud vedeliku.
Ultraheli homogenisaatorite levinumad rakendused bioloogias ja biotehnoloogias on:
- Rakuekstrakti valmistamine
- Pärmi, bakterite, taimerakkude, pehme või kõva rakukoe ning nukleiinmaterjali lõhkumine
- Valkude ekstraheerimine
- Ensüümide valmistamine ja isoleerimine
- Antigeenide tootmine
- DNA ekstraheerimine ja/või sihipärane fragmenteerimine
- Liposoomide valmistamine
Rakkude lõhkumine sondtüüpi ultraheli homogenisaatoriga on tõhus proovide ettevalmistamise meetod.
Ultraheli mitmekesised rakendused hargnevad biotehnoloogia, biotehnika, mikrobioloogia, molekulaarbioloogia, biokeemia, immunoloogia, bakterioloogia, viroloogia, proteoomika, geneetika, füsioloogia, rakubioloogia, hematoloogia ja botaanika valdkondadesse.
Lüüs: rakustruktuuride lõhkumine
Rakke kaitseb poolläbilaskev plasmamembraan, mis koosneb fosfolipiidsest kaksikkihist (ka valk-lipiid kaksikkihist; moodustunud hüdrofoobsetest lipiididest ja hüdrofiilsetest fosforimolekulidest koos sisseehitatud valgumolekulidega) ning loob barjääri raku sisemuse (tsütoplasma) ja rakuvälise keskkonna vahele. Taimerakke ja prokarüootseid rakke ümbritseb rakusein. Mitmekihilise paksu tselluloosist rakukesta tõttu on taimerakke raskem lüüsida kui loomarakke. Raku sisemust, näiteks organelle, tuuma ja mitokondreid, stabiliseerib tsütoskelett.
Rakkude lüüsimisega taotletakse organellide, valkude, DNA, mRNA või muude biomolekulide eraldamist ja separeerimist.
Rakkude lüüsi tavapärased meetodid ja nende puudused
Rakkude lüüsimiseks on mitu meetodit, mida saab jagada mehaanilisteks ja keemilisteks meetoditeks; nende hulka kuuluvad detergentide või lahustite kasutamine, kõrgrõhu rakendamine või kuulveski või prantsuse pressi (french press) kasutamine. Nende meetodite kõige problemaatilisem puudus on protsessiparameetrite ja seeläbi mõju raske kontrollimine ja reguleerimine.
Alljärgnev tabel näitab tavaliste lüüsimeetodite peamisi puudusi:
Tabel: Rakkude lüüsi tavapärastel meetoditel on olulised puudused
Lüüsi protseduur
Lüüs on tundlik protsess. Lüüsi käigus rakumembraani kaitse hävib, kuid eraldatud valkude inaktiveerumist, denatureerumist ja lagunemist mittefüsioloogilise keskkonna (kõrvalekalle pH-väärtusest) tõttu tuleb vältida. Seetõttu tehakse lüüs üldjuhul puhverlahuses. Enamik raskusi tekib kontrollimatust rakkude lõhkumisest, mille tulemuseks on kogu rakusisese materjali sihipäratu vabanemine ja/või sihtprodukti denatureerumine.
Korduma kippuvad küsimused ultraheli töötluse (sonikeerimise) ja rakulüüsi kohta
- Kas rakke saab sonikeerimisega lüüsida? Jah, sonikeerimine lüüsib rakke tõhusalt, kasutades kõrgsageduslikke ultraheli laineid, mis esilekutsuvad kavitatsiooni – nähtust, mille korral rakususpensioonis tekivad pisikesed aurumullid ja kukuvad vägivaldselt kokku. Tekkivad mehaanilised jõud lõhuvad rakumembraane ja soodustavad rakusiseste komponentide vabanemist vedelikku.
- Kuidas kasutada sonikaatorit rakkude lüüsiks? Sonikaatori kasutamine rakkude lüüsiks hõlmab sonikaatori sondi sukeldamist rakususpensiooni ning parameetrite, näiteks amplituudi ja pulsi kestuse, reguleerimist. Protsessi tuleks hoolikalt jälgida, et optimeerida rakkude lõhkumist ning minimeerida samal ajal valkude denatureerumist ja ensüümide inaktiveerumist.
- Mis on rakulüüsi sonikeerimise põhimõte? Sonikeerimine põhineb akustilise kavitatsiooni põhimõttel. Ultraheli energia kandub vedelasse keskkonda, tekitades kiireid rõhukõikumisi, mis viivad mikromullide tekkimise ja implodeerumiseni. Need implosioonid tekitavad intensiivseid nihkejõude ja lokaalselt kõrgeid temperatuure, lõhkudes rakustruktuure ja parandades lüsaadi homogeensust.
- Kui kaua rakulüüsi sonikeerimine kestab? Rakulüüsi sonikeerimise kestus võib oluliselt varieeruda sõltuvalt teguritest nagu rakutüüp, rakutihedus, sonikaatori võimsus ja kasutatav konkreetne protokoll. Tüüpilised protseduurid võivad kesta mõnest sekundist mõne minutini ning neid tehakse sageli tsüklitena, et reguleerida soojuse teket ja tagada rakkude ühtlane lõhkumine.
- Mis on sonikeerimise eesmärk valkude ekstraktsioonil? Valkude ekstraktsioonil on sonikeerimise ülesanne rakumembraane tõhusalt purustada ja valke solubiliseerida. See meetod on eriti kasulik valkude vabastamiseks rakukompartmentidest, muutes selle hädavajalikuks lüsaatide ettevalmistamisel, millest valke puhastatakse või analüüsitakse.
- Miks kasutatakse ekstraktsiooniks sonikeerimist? Sonikeerimist eelistatakse ekstraktsiooniks selle kiire toime ja sihipärase energia rakendamise võime tõttu, mis lagundab rakustruktuure bioaktiivsete molekulide vabastamiseks ilma karmide keemiliste töötlusteta, säilitades seeläbi ekstraheeritud ühendite funktsionaalse terviklikkuse.
- Kas sonikeerimine katkestab valk-valk interaktsioonid? Kuigi sonikeerimine võib rakumembraane tõhusalt lõhkuda, võib see häirida ka valk-valk interaktsioone. Häirimise ulatus sõltub sonikeerimise intensiivsusest ja kestusest, mis võib põhjustada valgukomplekside denaturatsiooni või dissotsiatsiooni ning mõjutada seeläbi hilisemaid analüütilisi või funktsionaalseid uuringuid.
- Kas sonikeerimist saab kasutada E. coli lüüsimiseks? Hielscheri sonikaatorid sobivad eriti hästi bakterirakkude, näiteks E. coli lüüsimiseks, millel on tugevad rakuseinad. See tehnika pakub füüsikalist meetodit rakuseina ja membraani nihkeks, mistõttu on see eelistatud meetod bakteriaalsete lüsaatide ettevalmistamiseks molekulaarbioloogia ja biokeemia laborites.
- Millised protsessid järgnevad sonikeerimisetapile?
Ultraheli lüüsi järgsed etapid hõlmavad tavaliselt lüsaadi fraktsioneerimist, organellide sihipärast isoleerimist ning valkude edasist ekstraheerimist või puhastamist.
Töödeldud lüsaat eraldatakse seejärel ja valmistatakse ette analüütiliseks või funktsionaalseks kasutamiseks, näiteks kõrglahutusega proteoomika, transkriptoomika või retseptoritega seondumise uuringute jaoks.
Kirjandus/viited
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.