Hielscheri ultraheli tehnoloogia

Ultrahelitöötluse lüüsimine: raku häired & kaevandamine

Rakkude lagunemine või lüüsimine on biotehnoloogia laborites igapäevase proovide ettevalmistamine. Lüüsi eesmärk on häirida rakuseina osi või täielikku rakku bioloogiliste molekulide vabastamiseks. Niinimetatud lüsaat võib koosneda näiteks plasmiidist, retseptori testidest, valkudest, DNAst, RNA-st jne. Pärast lüüsi etappideks on fraktsioonimine, organellide eraldamine ja / või valgu ekstraheerimine ja puhastamine. Ekstraheeritud materjal (= lüsaat) tuleb eraldada ja seda tuleb täiendavalt uurida või rakendada, nt proteoomikauuringute jaoks. Ultraheli homogenisaatorid on tavaline rakkude lüüsi edukas vahend. Kuna ultraheli intensiivsust saab korrigeerida protsessi parameetrite abil, saab iga aine ja keskkonna jaoks individuaalselt määrata optimaalse ultrakõrguse intensiivsuse väga pehmest kuni väga raskeks, et vastata konkreetsele rakendusvajadusele.

Raku struktuur

Rakud on kaitstud poolpaksendava plasmamembraaniga, mis koosneb fosfolipiidi kaksikkihist (ka valgu-lipiidide kaksikkiht, moodustunud hüdrofoobsete lipiidide ja põimitud valgumolekulide hüdrofiilsete fosfori molekulidega) ja loob barjääri rakkude interjööride (tsütoplasma) ja rakuväline keskkond. Taimerakud ja prokarüootsed rakud on ümbritsetud rakuseina. Tselluloosi paksu rakuseina mitmekihiliste kihtide tõttu on taimerakud raskem lüüsida kui loomarakud. Rakkude sisustus, nagu organellid, tuum, mitokondrid, stabiliseerub tsütoskeleti poolt.
Rakkude lüüsimisel on selle eesmärk organellide, valkude, DNA, mRNA või teiste biomolekulide eraldamine ja eraldamine.

Ultraheliga seotud proovide ettevalmistamiseks kasutatakse tavaliselt sonikatsiooni.

Joonis 1: Ultraheli ekstraheerimine rakkudest: mündi apikaalse varre (Mentha piperita) mikroskoopiline ristlõige (TS) näitab rakkude ultraheliga ekstraheerimise ajal toimivat toimemehhanismi (suurendus 2000x) [ressurss: Vilkhu et al. 2011]

Meetodid

Rakkude lüüsimiseks on mitu meetodit, mida saab jagada mehaanilisteks ja keemilisteks meetoditeks, milleks on näiteks pesuvahendite või lahustite kasutamine, kõrgsurve kasutamine või rantlõnga või prantsuse pressi kasutamine. Nende meetodite kõige problemaatilisem puudus on protsesside parameetrite keeruline kontroll ja reguleerimine ning seeläbi mõju.
Üldiste lüüsi meetodite peamised puudused:

Erinevad lüüsi tehnikad

Tabel: tavapärased rakkude lüüsi meetodid on suuri puudusi

Vastupidi, ultrahelitöötlus on väga efektiivne ja usaldusväärne vahend raku lagunemise jaoks, mis võimaldab sonikeerumise parameetrite täielikku kontrolli. See tagab materjalide vabanemise ja toote puhtuse suhtes suure selektiivsuse. [Balasundaram et al. 2009] See sobib kõigile rakutüüpidele ja on hõlpsalt kohaldatav väikeste ja suurte skaalal. Ultrasonicators on kergesti puhastatavad. Ultraheli homogenisaatoril on alati puhas-in-place (CIP) ja steriliseerimine-in-place (SIP) funktsioon. Sonotrode koosneb massiivsest titaani sarvest, mida saab pühkida või loputada vees või lahustis (sõltuvalt töökeskkonnast). Ultrasonikaatorite hooldus on tingitud nende stabiilsusest peaaegu tähelepanuta.

lüüsi

Lüüs on tundlik protsess. Lüüsi ajal hävib rakumembraani kaitse, kuid tuleb vältida ekstraheeritud valkude inaktiveerimist, denaturatsiooni ja lagunemist mittefüsioloogilises keskkonnas (kõrvalekalle pH väärtusest). Seetõttu üldiselt lüüsitakse puhverlahuses. Enamik raskusi tekib kontrollimatu raku hävingu tagajärjel, mille tagajärjeks on kogu rakusisese materjali sihitud vabanemine või sihtotstarbelise produkti denaturatsioon.

Ultrahelirakkude lüüsi saab kasutada proovide valmistamiseks laboris ja suuremahuliste koguste tootmiseks. Klõpsa suurendamiseks

Joonis 1: võimsad ultraheli homogenisaatorid võimsusega 200 W Uf200 ः t digitaalse juhtimise ja automaatse andmete salvestamiseks usaldusväärse ja reprodutseeritavate rakkude lüüsi jaoks.

Ultraheli leelis

Üldiselt võtab proovide proovide lüüs 15 sekundi ja 2 minuti jooksul. Kuna ultrahelitöötluse intensiivsust on väga lihtne reguleerida, määrates ultrahelitöötluse ajal amplituudi ning valides õige seadme, on rakumembraane võimalikult õrnalt või väga järsult katkestada, sõltuvalt rakustruktuurist ja lüüsi eesmärgist ( nt DNA ekstraheerimine nõuab pehmemat ultrahelitöötlust, bakterite täieliku valgu ekstraheerimine nõuab intensiivsemat ultraheliravi). Protsessi ajal temperatuuri saab jälgida integreeritud temperatuurianduriga ja seda saab hõlpsasti juhtida jahutamisega (jäävannid või vooluaknad jahutussärgiga) või ultraheliga impulssrežiimis. Impulssrežiimi ultrahelitöötluse ajal võimaldavad lühikesed ultrahelitöötlustsüklid pikkusega 1-15 sekundit pikkade perioodide jooksul soojuse hajumist ja jahutamist.
Kõik ultraheli-juhitavad protsessid on täielikult reprodutseeritavad ja lineaarselt kohandatavad.

Ultraheli homogenisaator VialTweeter kuni 10 katseklaasi samaaegse proovi ettevalmistamiseks. (Klõpsa suurendamiseks!)

Ultraheli seade VialTweeter võimaldab sama protsessi tingimustes kuni 10 viaali üheaegset proovi ettevalmistamist.

Ultraheli homogenisaatorid

Erinevat tüüpi Ultraheli seadmed võimaldavad sobitada proovi ettevalmistamise eesmärki ning tagada kasutajasõbralikkus ja mugavus. Probe tüüpi ultraheligaatorid on lab kõige levinumad seadmed. Need sobivad kõige paremini väikeste ja keskmise suurusega proovide ettevalmistamiseks mahuga 0,1 ml kuni 1000 ml. Erinevad võimsusmõõtmed ja sonotrood võimaldavad ultrasonikorat kohandada proovi mahule ja anumale kõige efektiivsemate ja efektiivsete sonicating tulemustega. Ultraheli sondi seade on parim valik, kui tuleb valmistada üksikproove.

Kui on vaja valmistada rohkem proove, näiteks 8 rakulahuse viaali, on seadmed, nagu näiteks VialTweeter või ultraheli tassihormoon, kõige sobivam lüüsimise homogenisaator. Sama intensiivsusega töödeldakse samaaegselt mitut viaali. See säästab mitte ainult aega, vaid tagab ka kõikide proovide sama töötlemise, mis muudab proovide seas proovide usaldusväärsuse ja võrreldavuse. Lisaks välditakse ristsaastumist ultraheli sonotrode (tuntud ka kui ultraheliandur, sarvest, otsikust või sõrmest) sukeldamise teel. Kuna viaale kasutatakse, on laevade dekanteerimise tõttu aeganõudev puhastus ja proovikadu ära jäetud.
Suuremateks kogusteks, näiteks rakuekstraktide kaubanduslikuks tootmiseks, on kõige sobivamad voolureaktori pidevad ultraheli süsteemid. Töödeldud materjali pidev ja ühtlane voog tagab ühtlase ultraheliga töötlemise. Kõiki ultraheli lagunemise protsessi parameetreid saab optimeerida ja kohandada vastavalt rakenduse ja konkreetse rakumaterjali nõuetele.

Bakterirakkude ultrahelilüüsimise näidisprotseduur:

  • Rakusisuspensiooni valmistamine: rakupelletid tuleb homogeniseerimisel puhverlahuses täiesti suspendeerida (vali puhverlahus, mis sobib järgneva analüüsiga, nt spetsiifiline kromatograafiline meetod). Vajadusel lisage vajadusel lüsosüüme ja / või muid lisandeid (need peavad sobima ka separatsiooni- / puhastusvahenditega). Lahus segatakse / homogeniseeritakse kerge ultraheliga töötlemisel, kuni saavutatakse täielik suspensioon.
  • Ultraheli lüüs: asetage proov jäävanni. Rakuhäirete korral sonikeerige suspensioon 60-90 sekundi jooksul (kasutades ultraheliatori impulsi režiimi).
  • Eraldamine: lüsaati tsentrifuugige (nt 10 minutit 10 000 x g juures 4 ° C juures). Eraldi supernatant rakukultuuris ettevaatlikult. Supernatant on kogu rakulüsaat. Pärast supernatandi filtreerimist saadakse lahustuva raku valgu läbipaistev vedelik.

Bioloogias ja biotehnoloogias ultraheligaatorite kõige tavalisemad rakendused on järgmised:

  • Rakuekstrakti valmistamine
  • Katkestus pärm, bakterid, taimerakud, pehmed & raskekujuline rakk, nukleiinmaterjal
  • Valgu ekstraheerimine
  • Ensüümide valmistamine ja eraldamine
  • Antigeenide tootmine
  • DNA ekstraheerimine ja / või sihtmärgistatud killustatus
  • liposoomide valmistamine
Kõrge võimsusega ultraheli homogenisaatorid nagu UIP1000hd kasutatakse raku katkestamiseks ja ekstraheerimiseks partii või pideva vooluhulgaga režiimis. (Klõpsa suurendamiseks!)

Ultraheli benchtop süsteemid nagu UIP1000hd (1kW) saab töödelda suuremaid bioloogilise materjali koguseid.

Ultraheli filiaalide mitmesugused rakendused on seotud biotehnoloogia, bioengustehnika, mikrobioloogia, molekulaarbioloogia, biokeemia, immunoloogia, bakterioloogia, viroloogia, proteoomika, geneetika, füsioloogia, rakubioloogia, hematoloogia ja botaanika valdkondades.

Hielscher Ultrasonics pakub klientide taotluste hindamiseks ja optimeerimiseks täielikult varustatud ultraheli protsessi labor. Lisateabe saamiseks võtke meiega ühendust!

Kirjandus / viited

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, peadirektor (2009): edusammud toote vabastamise strateegiate ja mõju bioprotsessi disain. Biotehnoloogia suundumused 27/8, 2009. lk. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasse, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): toidu koostisosade ultraheli taastamine ja modifitseerimine. In: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): ultraheli tehnoloogiad toidu ja bioprotsesside jaoks. New York: Springer, 2011. lk. 345-368.

Kontakt / küsi

Rääkige meile oma töötlemise nõuetele. Me soovitame kõige sobivam setup ja töötlemise parameetrid oma projekti.





Palun pange tähele, et meie Privaatsuspoliitika.