Ultrahelitöötlus raku lüüsi jaoks: rakkude katkestamine ja ekstraheerimine
Ultraheli rakulüüs on kaasaegsetes biotehnoloogialaborites laialdaselt kasutatav proovide ettevalmistamise tehnika. Selle peamine eesmärk on lõhkuda rakumembraane või terveid rakke, et vabastada rakusiseseid komponente, näiteks valke, nukleiinhappeid või organelle. Igapäevases laboritöös tähendab see, et sonikatsioon on standardmeetod rakkude kontrollitud lõhkumiseks ja biomolekulide tõhusaks ekstraheerimiseks. Sonikaatorite peamine eelis seisneb nende võimekuses täpselt reguleerida kriitilisi protsessiparameetreid, sealhulgas ultraheli intensiivsust, pulsatsiooni ja temperatuuri reguleerimist. Selline kontroll võimaldab teadlastel saavutada usaldusväärset lüüsi, vähendades samal ajal tundlike biomolekulide termilist või mehaanilist kahjustamist, mille tulemuseks on õrn, kuid väga tõhus ekstraheerimisprotsess.
Raku lüüsimine Sonicatorite abil
Ultraheli rakulüüs kasutab akustilist kavitatsiooni rakumembraanide lõhkumiseks ja rakusiseste molekulide vabastamiseks. Hielscher Ultrasonics pakub klassikalist sonditüüpi sonikaatorit, samuti mitme proovi sonikaatoreid steriilseks töötlemiseks: VialTweeter mitme toru ja viaali jaoks ning 96-kujulise plaadi sonikaator UIP400MTP standardsetele mikroplaatidele.
Hielscher Ultrasonics varustab võimsaid kontaktivabasid sonikaatoreid proovide ettevalmistamiseks ja kliiniliseks analüüsiks. Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP, The VialTweeter, kupatus ja GDmini2 vooluheli töödelda proovid steriilsetes tingimustes.
Ultraheli homogenisaatorid UP100H (100 vatti) ja UP400St (400 vatti): ultrahelitöötlus rakkude lüüsiks ja ekstraheerimiseks.
Ultraheli homogenisaatorid rakkude lüüsimiseks ja ekstraheerimiseks
| Ultraheli seadme tüüp | Rakenduse fookus | Proovi maht | Tüüpiline kasutusjuhtum | Eelised | Näidismudelid |
|---|---|---|---|---|---|
| Sondi tüüpi sonikaatorid | Ühe proovi sonikatsioon | 0.1 ml kuni ~1000 ml | Raku lüüs, valkude ekstraheerimine, DNA/RNA fragmenteerimine | Täpne energiakontroll; erinevad sonotroodid; optimaalne väikeste ja keskmise suurusega proovide jaoks | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Mitme suletud viaali paralleelne töötlemine | 8-10 viaali (~1-20 ml igaüks) | Mitme rakususpensiooni standardiseeritud lüüs | Ühetaoline sonikatsioon; väldib ristsaastumist; korratavad tulemused | VialTweeter, kupael |
| 96-kujulise plaadi sonikaator | Mitmekülvikute ja mikrotiterplaatide sonikatsioon | Mikroplaatide formaat | Suure läbilaskevõimega sõelumine, proteoomika, rakuproovid | Samaaegne, ühtlane sonikatsioon kõigis puuraukudes; ideaalne mitme proovi töövoogude jaoks. | UIP400MTP |
| vooluelemendi reaktorid | Pidev sonikatsioon suuremate mahtude jaoks | >1 L, skaleeritav | Tööstuslik rakkude lõhkumine, ekstrakti tootmine | Pidev töötlemine; skaleeritav; täielik protsessikontroll (amplituud, rõhk, temperatuur) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + voolukamber |
| Steriilsed / kaudsed sonikatsioonisüsteemid | Proovide saastevaba töötlemine | Viaal/tuubi/mikroplaadi sõltuvus | Tundlikud proovid, steriilsed keskkonnad, regulatiivsed seadistused | Puudub sondi kokkupuude; väldib ülekandumist; minimaalne puhastamiskoormus | VialTweeter, kupael, UIP400MTP |
Ultrahelitöötluse kasutamise eelised rakkude lüüsiks
Võrreldes teiste rakkude lüüsi- ja ekstraheerimismeetoditega on ultraheli rakkude lüüsil mitmeid eeliseid:
- Kiirus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on kiire meetod, mis võib mõne sekundi jooksul avatud rakke murda. See on palju kiirem kui muud meetodid, nagu homogeniseerimine, külmsulatamine või helmeste freesimine.
- Tõhusust: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada väikeste, suurte või mitme proovi töötlemiseks korraga, muutes selle tõhusamaks kui muud meetodid, mis nõuavad väikeste proovide individuaalset töötlemist.
- Kemikaalivaba: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine on mitteinvasiivne meetod, mis ei nõua karmide kemikaalide või ensüümide kasutamist. See muudab selle ideaalseks rakendusteks, kus tuleb säilitada raku sisu terviklikkus. Proovide soovimatut saastumist on võimalik vältida.
- Suur saagikus: Ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine võivad eraldada rakulise sisu, sealhulgas DNA, RNA ja valkude suure saagise. Seda seetõttu, et kõrgsageduslikud helilained murravad rakuseinad lahti ja vabastavad sisu ümbritsevasse lahusesse.
- Temperatuuri reguleerimine: Keerukad ultrahelid võimaldavad proovi täpset temperatuuri reguleerimist. Hielscheri digitaalsed sonikaatorid on varustatud ühendatava temperatuurianduri ja temperatuuri jälgimise tarkvaraga.
- Reprodutseeritav: Ultraheli rakkude lüüsi protokolle saab hõlpsasti reprodutseerida ja isegi sobitada erinevate suuremate või väiksemate proovimahtudega lihtsa lineaarse skaala abil.
- Mitmekülgne: Ultraheli rakkude lüüsi ja ekstraheerimist saab kasutada paljude rakutüüpide, sealhulgas bakterite, pärmi, seente, taimede ja imetajate rakkude ekstraheerimiseks. Seda saab kasutada ka erinevat tüüpi molekulide, sealhulgas valkude, DNA, RNA ja lipiidide ekstraheerimiseks.
- Paljude proovide samaaegne ettevalmistamine: Hielscher Ultrasonics pakub mitmeid lahendusi paljude proovide mugavaks töötlemiseks täpselt samades protsessitingimustes. See muudab lüüsi ja ekstraheerimise proovi ettevalmistamise etapi väga tõhusaks ja ajasäästlikuks.
- Lihtne kasutada: Ultraheli rakkude lüüsi- ja ekstraheerimisseadmed on kergesti kasutatavad ja nõuavad minimaalset koolitust. Seadmed on ka ökonoomsed, kuna tegemist on ühekordse investeeringuga, mille puhul ei nõuta müügivahendite tagasiostmist. See muudab selle atraktiivseks paljudele teadlastele ja laboritele.
Üldiselt on ultraheli rakkude lüüs ja ekstraheerimine kiire, tõhus, täpselt kontrollitav ja mitmekülgne meetod rakulise sisu ekstraheerimiseks. Selle eelised alternatiivsete meetodite ees muudavad selle atraktiivseks valikuks paljude teadusuuringute ja tööstuslike rakenduste jaoks.
Ultraheli rakkude lüüsi tööpõhimõte
Ultraheli rakkude lüüsimine ja ekstraheerimine kasutab rakkude häirimiseks ja nende sisu ekstraheerimiseks kõrgsageduslikke helilaineid. Helilained tekitavad ümbritsevas vedelikus rõhumuutusi, põhjustades väikeste mullide moodustumist ja kokkuvarisemist protsessis, mida nimetatakse kavitatsiooniks. Need mullid tekitavad lokaliseeritud väga intensiivseid mehaanilisi jõude, mis võivad murda avatud rakke ja vabastada nende sisu ümbritsevasse lahusesse.
Rakkude lüüs ultrasonikaatori abil hõlmab tavaliselt järgmisi samme:
- Proov asetatakse vedela puhvriga katseklaasi või anumasse.
- Proovi sisestatakse ultraheli sond ja rakendatakse kõrgsageduslikke helilaineid umbes 20-30 kHz.
- Ultraheli lained põhjustavad ümbritsevas vedelikus võnkumist ja kavitatsiooni, tekitades lokaliseeritud jõude, mis lõhuvad avatud rakke ja vabastavad nende sisu.
- Proovi tsentrifuugitakse või filtreeritakse, et eemaldada rakujäägid, ja ekstraheeritud sisu kogutakse järgnevaks analüüsiks.
Tavaliste lüüsimeetodite puudused
Laborites töötamise ajal olete võib-olla juba kogenud rakkude lüüsi vaeva, kasutades traditsioonilisi mehaanilisi või keemilisi lüüsiprotokolle.
- Mehaaniline lüüs: Mehaanilistel lüüsimeetoditel, nagu lihvimine mördi ja uhmriga või homogeniseerimine prantsuse pressi, helmesveski või rootor-staatorisüsteemi abil, puuduvad sageli eelkontrolli ja reguleerimise võimalused. See tähendab, et jahvatamise ja jahvatamise kasutamine võib kiiresti tekitada soojust ja nihkejõude, mis võivad proovi ja denatureerimisvalke kahjustada. Need võivad olla ka aeganõudvad ja nõuda suurtes kogustes lähteaineid.
- Keemiline lüüs: Keemilise lüüsi meetodid, näiteks pesuvahendil põhinev lüüs, võivad proovi kahjustada, häirides lipiidide kahekihilist kihti ja denatureerivaid valke. Need võivad vajada ka mitut etappi ja võivad jätta jääksaasteaineid, mis segavad järgnevaid rakendusi. Pesuvahendi optimaalse annuse leidmine on täiendav väljakutse.
- Külmumis-sulatustsüklid: Külmumis-sulatustsüklid võivad põhjustada rakumembraanide rebenemist, kuid korduvad tsüklid võivad põhjustada ka valkude denaturatsiooni ja lagunemist. See meetod võib nõuda ka mitut tsüklit, mis võib olla aeganõudev ja põhjustab sageli madalamat saagikust.
- Ensümaatiline lüüs: Ensümaatilise lüüsi meetodid võivad olla spetsiifilised teatud rakutüüpidele ja nõuda mitut sammu, muutes need aeganõudvaks. Samuti tekitavad nad jäätmeid ja vajavad hoolikat optimeerimist, et vältida proovi lagunemist. Ensümaatilise lüüsi komplektid on sageli kallid. Kui teie praegune ensümaatilise lüüsi protseduur annab ebapiisavaid tulemusi, võib rakkude katkestamise intensiivistamiseks rakendada ultrahelitöötlust sünergilise meetodina.
Erinevalt tavapärastest mehaanilistest ja keemilistest rakkude lüüsi meetoditest on ultrahelitöötlus väga tõhus ja usaldusväärne vahend rakkude lagunemiseks, mis võimaldab täielikku kontrolli ultrahelitöötluse parameetrite üle. See tagab materjalide vabanemise ja toote puhtuse kõrge selektiivsuse. [vrd Balasundaram et al., 2009]
See sobib kõigile rakutüüpidele ja on hõlpsasti rakendatav nii väikestes kui ka suurtes mastaapides – alati kontrollitud tingimustes. Ultrasonikaatorid on kergesti puhastatavad. Ultraheli homogenisaatoril on alati puhas kohapeal (CIP) ja steriliseerimise (SIP) funktsioon. Sonotrode koosneb massiivsest titaanist sarvest, mida saab pühkida või loputada vees või lahustis (sõltuvalt töökeskkonnast). Ultrasonikaatorite hooldamine on tingitud nende vastupidavusest peaaegu tähelepanuta jäetud.
Ultraheli lüüs ja rakkude katkestamine
Üldiselt võtab proovide lüüs laboris aega 15 sekundit kuni 2 minutit. Kuna ultrahelitöötluse intensiivsust on väga lihtne reguleerida amplituudiga, seades ultrahelitöötluse aja ja valides õige varustuse, on võimalik rakumembraane väga õrnalt või väga järsult häirida, sõltuvalt rakustruktuurist ja lüüsi eesmärgist (nt DNA ekstraheerimine nõuab pehmemat ultrahelitöötlust, bakterite täielik valgu ekstraheerimine nõuab intensiivsemat ultraheliravi). Protsessi ajal toimuvat temperatuuri saab jälgida integreeritud temperatuurianduri abil ja seda saab hõlpsasti reguleerida jahutamisega (jäävann või jahutussärkidega voolurakud) või impulssrežiimis ultrahelitöötlusega. Impulssrežiimi ultrahelitöötluse ajal võimaldavad lühikesed 1-15-sekundilise kestusega ultrahelitöötluse tsüklid soojuse hajutamist ja jahutamist pikemate vahelduvate perioodide jooksul.
Kõik ultraheliga juhitavad protsessid on täielikult reprodutseeritavad ja lineaarselt skaleeritavad.
The VialTweeter on ultraheli homogenisaator paljude proovide samaaegseks, ühtlaseks ja kiireks steriilseks ettevalmistamiseks.
- Rakususpensiooni valmistamine: rakugraanulid tuleb puhverlahuses täielikult suspendeerida, homogeniseerides (valige puhverlahus, mis sobib järgneva analüüsiga, nt spetsiifiline kromatograafiameetod). Vajadusel lisage lüsosüüme ja / või muid lisaaineid (need peavad sobima ka eraldus- / puhastusvahenditega). Segage / homogeniseerige lahus õrnalt kerge ultrahelitöötlusega, kuni saavutatakse täielik suspensioon.
Loe lähemalt lüsosüümide sünergiast koos sonikatsiooniga! - Ultraheli lüüs: Asetage proov jäävanni. Rakkude katkestamise korral sonikeerige suspensioon 60-90-sekundiliste purunemiste korral (kasutades sonikaatori pulsirežiimi).
- Eraldamine: lüsaati tsentrifuugitakse (nt 10 minutit 10 000 x g juures; 4 °C juures). Supernatant eraldatakse ettevaatlikult rakupelletist. Supernatant on kogu rakulüsaat. Pärast supernatandi filtreerimist saate lahustuva rakuvalgu selitatud vedeliku.
Kõige tavalisemad rakendused ultraheli jaoks bioloogias ja biotehnoloogias on:
- Rakuekstrakti valmistamine
- Pärmi, bakterite, taimerakkude, pehme- või kõvarakulise koe, nukleiinmaterjali katkestamine
- valgu ekstraheerimine
- Ensüümide ettevalmistamine ja eraldamine
- Antigeenide tootmine
- DNA ekstraheerimine ja / või sihipärane killustumine
- liposoomi valmistamine
Rakkude katkestamine sondi tüüpi ultrasonikaatoriga on tõhus proovi ettevalmistamise meetod.
Ultraheli mitmesugused rakendused hargnevad biotehnoloogia, biotehnoloogia, mikrobioloogia, molekulaarbioloogia, biokeemia, immunoloogia, bakterioloogia, viroloogia, proteoomika, geneetika, füsioloogia, rakubioloogia, hematoloogia ja botaanika sektorites.
Lüüs: rakustruktuuride purustamine
Rakke kaitseb poolläbilaskev plasmamembraan, mis koosneb fosfolipiidide kahekihilisest kihist (ka valk-lipiidide kahekihiline; moodustatud hüdrofoobsete lipiidide ja hüdrofiilsete fosforimolekulide poolt koos sisseehitatud valgumolekulidega) ja loob barjääri raku sisemuse (tsütoplasma) ja rakuvälise keskkonna vahel. Taimerakke ja prokarüootseid rakke ümbritseb rakusein. Tselluloosi mitmekihilise paksuse rakuseina tõttu on taimerakke raskem lüüsida kui loomarakke. Raku sisemus, nagu organellid, tuum, mitokondrioon, stabiliseeritakse tsütoskeleti abil.
Rakkude lüüsimisega on selle eesmärk organellide, valkude, DNA, mRNA või muude biomolekulide ekstraheerimine ja eraldamine.
Rakkude lüüsi tavapärased meetodid ja nende puudused
Rakkude lüseerimiseks on mitmeid meetodeid, mida saab jagada mehaanilisteks ja keemilisteks meetoditeks, mis hõlmavad detergentide või lahustite kasutamist, kõrgsurve rakendamist või helmesveski või prantsuse pressi kasutamist. Nende meetodite kõige problemaatilisem puudus on protsessi parameetrite keeruline kontroll ja reguleerimine ning seeläbi mõju.
Allolevas tabelis on esitatud tavaliste lüüsimeetodite peamised puudused:
Tabel: Rakkude lüüsi tavapärastel meetoditel on suured puudused
Lüüsi protseduur
Lüüs on tundlik protsess. Lüüsi käigus rakumembraani kaitse hävitatakse, kuid tuleb vältida ekstraheeritud valkude inaktiveerimist, denatureerimist ja lagunemist mittefüsioloogilises keskkonnas (kõrvalekalle pH-väärtusest). Seetõttu viiakse lüüs üldiselt läbi puhverlahuses. Enamik raskusi tuleneb kontrollimatust rakukatkestusest, mille tulemuseks on kogu rakusisese materjali sihtotstarbetu vabanemine või / ja sihtprodukti denatureerimine.
Korduma kippuvad küsimused ultrahelitöötluse ja rakkude lüüsi kohta
- Kas saate ultrahelitöötlusega rakke lüüsida? Jah, ultrahelitöötlus lüüsib rakke tõhusalt, kasutades kõrgsageduslikke ultraheli laineid, mis indutseerivad kavitatsiooni- nähtus, kus rakususpensioonis moodustuvad ja ägedalt kokku varisevad väikesed aurumullid. Saadud mehaanilised jõud häirivad rakumembraane ja hõlbustavad rakusiseste komponentide vabanemist vedelikku.
- Kuidas kasutada sonikaatorit rakkude lüüsiks? Sonikaatori kasutamine raku lüüsiks hõlmab sonikaatori sondi sukeldamist rakususpensiooni ja selliste parameetrite reguleerimist nagu amplituud ja impulsi kestus. Protsessi tuleb hoolikalt jälgida, et optimeerida rakkude häireid, minimeerides samal ajal valkude denaturatsiooni ja ensüümide inaktiveerimist.
- Milline on ultrahelitöötluse põhimõte raku lüüsi jaoks? Sonikatsioon toimib akustilise kavitatsiooni põhimõttel. Ultraheli energia edastatakse vedelasse keskkonda, põhjustades kiireid rõhu kõikumisi, mis põhjustavad mikromullide moodustumist ja implosiooni. Need implosioonid tekitavad intensiivseid nihkejõude ja lokaliseeritud kõrgeid temperatuure, häirides rakustruktuure ja suurendades lüsaadi homogeensust.
- Kui kaua võtab raku lüüsi ultrahelitöötlus? Raku lüüsi ultrahelitöötluse kestus võib oluliselt varieeruda sõltuvalt sellistest teguritest nagu rakutüüp, raku tihedus, sonikaatori võimsus ja kasutatav spetsiifiline protokoll. Tüüpilised protseduurid võivad ulatuda mitmest sekundist mõne minutini, mida sageli tehakse tsüklitena, et juhtida soojuse teket ja tagada ühtlane rakkude katkestus.
- Milline on ultrahelitöötluse eesmärk valgu ekstraheerimisel? Valgu ekstraheerimisel aitab ultrahelitöötlus tõhusalt rebeneda rakumembraane ja lahustada valke. See meetod on eriti kasulik valkude vabastamiseks rakukambritest, mistõttu on oluline valmistada lüsaate, millest valke puhastatakse või analüüsitakse.
- Miks kasutatakse ultrahelitöötlust ekstraheerimiseks? Sonikatsiooni eelistatakse ekstraheerimiseks tänu oma kiirele toimele ja võimele rakendada sihipärast energiat, lagundades rakustruktuure, et vabastada bioaktiivseid molekule ilma karmide keemiliste töötlusteta, säilitades seeläbi ekstraheeritud ühendite funktsionaalse terviklikkuse.
- Kas ultrahelitöötlus häirib valgu-valgu koostoimeid? Kuigi ultrahelitöötlus võib tõhusalt häirida rakumembraane, võib see häirida ka valgu-valgu koostoimeid. Häirete tase sõltub ultrahelitöötluse intensiivsusest ja kokkupuute kestusest, mis võib viia valgukomplekside denatureerimiseni või dissotsiatsioonini, mis võib mõjutada järgnevaid analüütilisi või funktsionaalseid uuringuid.
- Kas ultrahelitöötlust saab kasutada E. coli lüüsimiseks? Hielscheri sonikaatorid on eriti tõhusad bakterirakkude, näiteks E. coli lüüsimiseks, millel on tugevad rakuseinad. See meetod pakub füüsikalist meetodit rakuseina ja membraani lõikamiseks, muutes selle eelistatud meetodiks bakteriaalsete lüsaatide valmistamiseks molekulaarbioloogia ja biokeemia laborites.
- Millised on järgmised protsessid, mis järgnevad sonikatsioonietapile?
Pärast ultrahelilüüsi toimuvad tavaliselt lüsaadi fraktsioneerimine, organellide sihipärane isoleerimine ja valkude edasine ekstraheerimine või puhastamine.
Töödeldud lüsaat eraldatakse ja valmistatakse ette analüütilisteks või funktsionaalseteks rakendusteks, näiteks kõrge resolutsiooniga proteoomika, transkriptoomika või retseptoriga seondumise uuringuteks.
Kirjandus / viited
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.