Extracción de proteínas del tejido tumoral asistida por sonicación – Protocolo

Este protocolo describe un método de extracción de proteínas asistido por sonicación para tejido tumoral que mejora el flujo de trabajo estándar de lisis con urea de CPTAC añadiendo un paso de sonda-sonicación controlada durante la disrupción del tejido. Sobre la base de la estrategia de preparación del proteoma y fosfoproteoma CPTAC a gran escala establecida, esta modificación mejora la disrupción de la estructura celular y subcelular, reduce la viscosidad de la muestra y mejora la liberación de proteínas que normalmente son más difíciles de recuperar con la lisis con urea sola, especialmente las proteínas unidas a membranas y de unión al ADN o asociadas al núcleo. En el estudio subyacente, el flujo de trabajo asistido por sonicación aumentó la detección tanto de proteínas como de fosfopéptidos, preservando al mismo tiempo la compatibilidad con la digestión posterior al estilo CPTAC, el etiquetado TMT, el fraccionamiento, el enriquecimiento de fosfopéptidos y el proceso de análisis LC-MS/MS.

Extracción de proteínas del tejido tumoral asistida por sonicación para el análisis proteómico profundo y fosfoproteómico

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Ámbito de aplicación del Protocolo

Utilice este procedimiento para:

• tejido tumoral fresco congelado y criopulverizado
• pellets de células u otras muestras biológicas en las que ya se haya establecido la extracción con urea
• flujos de trabajo de proteómica global y fosfoproteómica mediante digestión tríptica y etiquetado TMT opcional

El estudio de Li et al. (2025) afirma que el flujo de trabajo también es aplicable a otros tipos de muestras, como líneas celulares, sangre y orina, aunque puede ser necesario optimizarlo según el tipo de muestra.

Flujo de trabajo optimizado de preparación de muestras con paso de sonicación implementado. El flujo de trabajo optimizado y el diseño experimental se basan en el protocolo de preparación de muestras CPTAC para el análisis proteómico y fosfoproteómico global.
Estudio y esquema: ©Li et al., 2025

principio de funcionamiento

El estudio original añadió la sonicación al flujo de trabajo estándar de lisis con urea de CPTAC y descubrió una mejora en la detección de proteínas asociadas a membranas y núcleos. Los autores afirman que los parámetros de sonicación deben ajustarse en función del tamaño y la concentración de la muestra. – eligiendo el tamaño del sonotrodo, la entrada de energía y la duración del pulso.

A modo de ejemplo, para las Hielscher UP200Ht y UP200St, esto significa:

• utilizar la amplitud y el modo de impulso como principales variables de control
• mantener las muestras frías durante todo el proceso (es decir, en hielo)
• empezar con ajustes conservadores
• optimizar en función de la claridad de la muestra, la temperatura, el rendimiento proteico y la calidad del péptido posterior

 
Los dos sonicadores Hielscher de 200 vatios, modelos UP200Ht y UP200St, están diseñados para volúmenes de muestra pequeños y medianos, con ajustes de amplitud y pulso ajustables; ambos homogeneizadores ultrasónicos ofrecen control digital mediante pantalla táctil para un ajuste preciso de los parámetros, registro automático de datos, sensor de temperatura enchufable, control remoto e iluminación de la muestra.
 

Reactivos para la extracción de proteínas asistida por sonicación

Tampón de lisis de urea

Prepárelo fresco inmediatamente antes de utilizarlo:

• 8 M de urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL de aprotinina
• 10 µg/mL de leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Cóctel de inhibidores de fosfatasas 2, 1:100 (v/v)
• Cóctel inhibidor de fosfatasas 3, 1:100 (v/v)

La urea debe estar completamente disuelta antes de añadir los aditivos; los inhibidores deben añadirse inmediatamente antes de su uso; el tampón debe mantenerse en hielo; y se recomienda agitar en lugar de agitar enérgicamente después de añadir los aditivos.
 

Reactivos adicionales:

• Reactivos para el ensayo de proteínas BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• TDT
• Yodoacetamida
• LysC
• tripsina
• Ácido fórmico
• Reactivos TMT, si se utiliza proteómica cuantitativa multiplexada
• Reactivos IMAC, si se realiza enriquecimiento de fosfopéptidos

Equipos para la extracción de proteínas asistida por sonicación

Requerido

Selección de sonda recomendada

Para muestras de alrededor de 200-1000 µL, utilice un sonotrodo de diámetro pequeño apropiado para el procesamiento directo de alta intensidad de volúmenes pequeños. Hielscher ofrece múltiples diámetros de sonotrodo, y los diámetros de punta más pequeños proporcionan una mayor intensidad en la punta.

Nota práctica: Utilice la sonda más pequeña que proporcione una mezcla eficaz sin formación excesiva de espuma ni contacto con las paredes del recipiente.

Si trabaja con varias muestras al mismo tiempo, puede considerar la posibilidad de el Multi-Tube Sonicator VialTweeter o ¡el sonicador de microplacas UIP400MTP!

Instrucciones paso a paso: Procedimiento de extracción de proteínas asistida por sonicación

A. Preenfriar y preparar

1. Enfriar la centrífuga a 4°C.
2. Prepare tampón de lisis de urea fresco y manténgalo en hielo.
3. Coloca el UP200Ht o el UP200St en un soporte dentro de un recinto acústico.
4. Prepare un baño de hielo lo suficientemente grande como para mantener los tubos de muestras en posición vertical y estable.

La preparación de tampón fresco y la manipulación en frío son fundamentales.

B. Extracción inicial de urea

1. Mantener el tejido criopulverizado en hielo.
2. Añadir 200 µL de tampón de lisis de urea refrigerado por cada 50 mg de tejido húmedo.
3. Vórtice 5-10 s a alta velocidad.
4. Incubar 15 min a 4°C.
5. Repetir una vez más el paso de vórtex más incubación.
6. Centrifugar a 20.000g durante 10 min a 4°C.
7. Transfiera el lisado/supernadante a un tubo limpio de bajo enlace.

C. Sonicación con UP200Ht o UP200St

Condiciones iniciales para la sonicación

• Amplitud: a partir del 20-30
• Duración del impulso: 5 s ON
• Enfriamiento: 2 min en hielo entre pulsos
• Número de ciclos: 4 ciclos
• Tiempo total de sonicación activa: 20 s
• Tiempo total del proceso, incluido el enfriamiento: unos 8-10 min.

Pasos de la sonicación

1. Transfiera el lisado a un tubo adecuado para la sonicación. Utilice un tubo estrecho de paredes finas que permita un buen intercambio de calor y una inmersión segura de la sonda.
2. Coloque el tubo en un baño de hielo. El artículo señala que la refrigeración durante la sonicación es fundamental para evitar daños por calor.
3. Sumerja la punta de la sonda en la muestra. Mantenga la punta lo suficientemente sumergida para que la cavitación sea estable, pero no deje que toque la pared o el fondo del tubo.
4. Ejecute un pulso de 5 s a la amplitud inicial.
5. Ponga inmediatamente la muestra completamente en hielo durante 2 min.
6. Repita hasta completar 4 ciclos.
7. Inspeccionar el lisado después del ciclo.
8. Continúe sólo si es necesario, utilizando un pulso adicional de 5 s cada vez, siempre seguido de un enfriamiento completo.
9. Deténgase una vez que el lisado se vuelva más uniforme y menos fibroso/viscoso.
   El punto final es un lisado más translúcido que forma gotas en lugar de un flujo viscoso continuo.
10. Centrifugar a unos 16.000g durante 15 min a 4°C.
11. Transferir el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo y medir la concentración de proteínas.

Comparación de la proteómica global y la fosfoproteómica entre muestras sonicadas y no sonicadas.
a. Número de proteínas identificadas (proteómica global) en todos los tejidos tumorales PDX con o sin sonicación. b. Número de fosfopéptidos identificados (enriquecimiento IMAC) en todos los tejidos tumorales PDX con o sin sonicación. Sólo se contaron las proteínas y los fosfopéptidos con una relación de abundancia superior o igual al percentil 25. La relación de abundancia se calculó entre los tejidos tumorales PDX con o sin sonicación. La relación de abundancia se calculó entre los mismos tipos de muestras.
Estudio y gráficos: ©Li et al., 2025

Digestión y análisis posteriores

Tras la sonicación y la clarificación, proceda como se describe en el flujo de trabajo original al estilo CPTAC:

1. Diluir el lisado 1:3 (v/v) con 50 mM Tris-HCl pH 8,0 para reducir la urea a <2 M.
2. Añadir LysC a 1 mAU por 50 µg de proteína e incubar 2 h a 25°C.
3. Añadir tripsina a 1:49 enzima:sustrato (p/p) y digerir durante la noche a 25°C.
4. Enfriar con ácido fórmico al 1% final.
5. Continuar con la desalación, etiquetado TMT, fraccionamiento, enriquecimiento de fosfopéptidos y LC-MS/MS según sea necesario.

Expresión diferencial de fosfopéptidos de EM marcados con TMT.
a. El subtipo basal, destacando algunos fosfopéptidos humanos (inicio y final de la secuencia de proteínas) regulados al alza en muestras sonicadas en comparación con muestras no sonicadas. b. El subtipo luminal, destacando algunos fosfopéptidos humanos (inicio y final de la secuencia de proteínas) regulados al alza en muestras sonicadas en comparación con muestras no sonicadas. c. Vías KEGG enriquecidas basadas en las proteínas de fosfopéptidos regulados al alza en el subtipo basal de tumores sonicados. d. Vías KEGG enriquecidas basadas en las proteínas de fosfopéptidos regulados al alza en el subtipo luminal de tumores sonicados.
Estudio y gráficos: ©Li et al., 2025

Diseño, fabricación y consultoría – Calidad Made in Germany

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Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y pone especial énfasis en los ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología punta y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonidos de Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.

Literatura / Referencias