Extracción de proteínas de tejido tumoral asistida por sonicación – Protocolo

Este protocolo describe un método de extracción de proteínas de tejido tumoral asistida por sonicación que mejora el flujo de trabajo estándar de lisis con urea de CPTAC mediante la incorporación de una etapa controlada de sonicación con sonda durante la disgregación del tejido. Partiendo de la estrategia establecida de CPTAC para la preparación del proteoma y el fosfoproteoma con gran profundidad de cobertura, esta modificación mejora la ruptura celular y de las estructuras subcelulares, reduce la viscosidad de la muestra y favorece la liberación de proteínas que suelen ser más difíciles de recuperar únicamente mediante lisis con urea, especialmente las proteínas unidas a membranas y las que se unen al ADN o están asociadas al núcleo. En el estudio de referencia, el flujo de trabajo asistido por sonicación aumentó la detección tanto de proteínas como de fosfopéptidos, manteniendo la compatibilidad con las etapas posteriores de digestión según el enfoque CPTAC, marcaje TMT, fraccionamiento, enriquecimiento de fosfopéptidos y análisis por LC-MS/MS.

Extracción de proteínas de tejido tumoral asistida por sonicación para análisis proteómicos y fosfoproteómicos de gran profundidad

El siguiente protocolo está optimizado para la extracción de proteínas de tejido tumoral criopulverizado en tampón de lisis con urea 8 M: la incorporación de una etapa de sonicación con sonda mejora la recuperación de clases de proteínas difíciles de extraer, especialmente las asociadas a membranas y al ADN o al núcleo, antes de la digestión y del posterior análisis por LC-MS/MS. En el estudio de referencia de Li et al. (2025), la incorporación de la sonicación aumentó la detección de proteínas asociadas a membranas y al núcleo y permitió alcanzar una cobertura de gran profundidad de >12.000 proteínas y >25.000 fosfopéptidos con su flujo de trabajo.

Ámbito de aplicación del protocolo

Utilice este procedimiento para:

• tejido tumoral fresco congelado y criopulverizado
• sedimentos celulares u otras muestras biológicas para las que ya se haya establecido la extracción con urea
• flujos de trabajo de proteómica y fosfoproteómica globales que utilicen digestión tríptica y marcaje TMT opcional

El estudio de Li et al. (2025) indica que el flujo de trabajo también es aplicable a otros tipos de muestras, como líneas celulares, sangre y orina; sin embargo, puede ser necesaria una optimización según el tipo de muestra.

Flujo de trabajo optimizado de preparación de muestras con una etapa de sonicación incorporada. El flujo de trabajo optimizado y el diseño experimental se basan en el protocolo de preparación de muestras de CPTAC para el análisis proteómico y fosfoproteómico global.
Estudio y esquema: ©Li et al., 2025

Principio de funcionamiento

El estudio original incorporó la sonicación al flujo de trabajo estándar de lisis con urea de CPTAC y observó una mejora en la detección de proteínas asociadas a membranas y núcleos. Los autores indican que los parámetros de sonicación deben ajustarse con precisión en función del tamaño y la concentración de la muestra – mediante la elección del tamaño del sonotrodo, el aporte de energía y la temporización de los pulsos.

Por ejemplo, para los equipos Hielscher UP200Ht y UP200St, esto significa:

• utilizar la amplitud y el modo de pulsos como principales variables de control
• mantener las muestras frías durante todo el proceso (es decir, sobre hielo)
• comenzar con ajustes conservadores
• optimizar en función de la claridad de la muestra, la temperatura, el rendimiento de proteínas y la calidad de los péptidos obtenidos posteriormente

 
Ambos modelos de sonicadores Hielscher de 200 vatios, UP200Ht y UP200St, están diseñados para volúmenes de muestra pequeños y medianos, con ajustes de amplitud y pulsos regulables; ambos homogeneizadores ultrasónicos ofrecen control digital mediante pantalla táctil para un ajuste preciso de los parámetros, registro automatizado de datos, sensor de temperatura conectable, control remoto e iluminación de la muestra.
 

Reactivos para la extracción de proteínas asistida por sonicación

Tampón de lisis con urea

Prepárelo fresco inmediatamente antes de su uso:

• Urea 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8,0
• EDTA 1 mM
• Aprotinina 2 µg/mL
• Leupeptina 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• Cóctel de inhibidores de fosfatasas 2, 1:100 (v/v)
• Cóctel de inhibidores de fosfatasas 3, 1:100 (v/v)

La urea debe disolverse por completo antes de incorporar los aditivos; los inhibidores deben añadirse inmediatamente antes del uso; el tampón debe mantenerse sobre hielo; y, tras añadir los aditivos, se recomienda agitar suavemente con movimientos circulares en lugar de agitar enérgicamente en vórtex.
 

Reactivos adicionales:

• Reactivos para el ensayo de cuantificación de proteínas por BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
• DTT
• Yodoacetamida
• LysC
• Tripsina
• Ácido fórmico
• Reactivos TMT, si se utiliza proteómica cuantitativa multiplexada
• Reactivos IMAC, si se realiza enriquecimiento de fosfopéptidos

Equipos para la extracción de proteínas asistida por sonicación

Necesarios

Selección recomendada de la sonda

Para muestras de aproximadamente 200–1000 µL, utilice un sonotrodo de diámetro pequeño adecuado para el procesamiento directo de alta intensidad de volúmenes pequeños. Hielscher ofrece sonotrodos de distintos diámetros, y los diámetros de punta más pequeños proporcionan mayor intensidad en la punta.

Nota práctica: utilice la sonda más pequeña que permita una mezcla eficaz sin formación excesiva de espuma ni contacto con la pared del recipiente.

Si trabaja con varias muestras al mismo tiempo, puede considerar el sonicador multitubo VialTweeter o el sonicador para microplacas UIP400MTP!

Instrucciones paso a paso: procedimiento de extracción de proteínas asistida por sonicación

A. Enfriamiento previo y preparación

1. Enfríe la centrífuga a 4 °C.
2. Prepare tampón de lisis con urea fresco y manténgalo sobre hielo.
3. Monte el UP200Ht o el UP200St en un soporte dentro de una cabina de protección acústica.
4. Prepare un baño de hielo lo suficientemente grande para mantener los tubos de muestra en posición vertical y estables.

La preparación de tampón fresco y la manipulación en frío son fundamentales.

B. Extracción inicial con urea

1. Mantenga el tejido criopulverizado sobre hielo.
2. Añada 200 µL de tampón de lisis con urea frío por cada 50 mg de tejido húmedo.
3. Agite en vórtex durante 5–10 s a alta velocidad.
4. Incube durante 15 min a 4 °C.
5. Repita una vez más la etapa de agitación en vórtex seguida de incubación.
6. Centrifugue a 20.000 g durante 10 min a 4 °C.
7. Transfiera el lisado/sobrenadante a un tubo limpio de baja adsorción.

C. Sonicación con UP200Ht o UP200St

Condiciones iniciales de sonicación

• Amplitud: comience al 20–30%
• Duración del pulso: 5 s de activación
• Enfriamiento: 2 min sobre hielo entre pulsos
• Número de ciclos: 4 ciclos
• Tiempo total de sonicación activa: 20 s
• Tiempo total del proceso, incluido el enfriamiento: aproximadamente 8–10 min

Etapas de sonicación

1. Transfiera el lisado a un tubo adecuado para la sonicación. Utilice un tubo estrecho y de paredes finas que permita un buen intercambio de calor y la inmersión segura de la sonda.
2. Coloque el tubo en un baño de hielo. El artículo señala que el enfriamiento durante la sonicación es fundamental para evitar daños por calor.
3. Sumerja la punta de la sonda en la muestra. Manténgala suficientemente sumergida para obtener una cavitación estable, pero no permita que toque la pared ni el fondo del tubo.
4. Aplique un pulso de 5 s a la amplitud inicial.
5. Vuelva a colocar inmediatamente la muestra completamente en hielo durante 2 min.
6. Repita hasta completar 4 ciclos.
7. Inspeccione el lisado después del ciclo.
8. Continúe solo si es necesario, aplicando un pulso adicional de 5 s cada vez, seguido siempre de un enfriamiento completo.
9. Deténgase cuando el lisado sea más uniforme y menos filamentoso/viscoso.
   El punto final es un lisado más translúcido que forme gotas en lugar de un flujo viscoso continuo.
10. Centrifugue a aproximadamente 16.000 g durante 15 min a 4 °C.
11. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo y mida la concentración de proteínas.

Comparación de la proteómica y la fosfoproteómica globales entre muestras sonicadas y no sonicadas.
a. Número de proteínas identificadas (proteómica global) en todos los tejidos tumorales PDX con o sin sonicación. b. Número de fosfopéptidos identificados (enriquecimiento IMAC) en todos los tejidos tumorales PDX con o sin sonicación. Solo se contabilizaron las proteínas y los fosfopéptidos con una razón de abundancia mayor o igual al percentil 25. La razón de abundancia se calculó entre los mismos tipos de muestras.
Estudio y gráficos: ©Li et al., 2025

Digestión y análisis posteriores

Tras la sonicación y la clarificación, proceda según lo descrito en el flujo de trabajo original de tipo CPTAC:

1. Diluya el lisado 1:3 (v/v) con Tris-HCl 50 mM pH 8,0 para reducir la concentración de urea a <2 M.
2. Añada LysC a razón de 1 mAU por cada 50 µg de proteínas e incube durante 2 h a 25 °C.
3. Añada tripsina en una proporción enzima:sustrato de 1:49 (w/w) y realice la digestión durante la noche a 25 °C.
4. Detenga la reacción con ácido fórmico hasta una concentración final del 1%.
5. Continúe con el desalado, el marcaje TMT, el fraccionamiento, el enriquecimiento de fosfopéptidos y el análisis por LC-MS/MS, según sea necesario.

Expresión diferencial de fosfopéptidos mediante MS con marcaje TMT.
a. Subtipo basal, con algunos fosfopéptidos humanos destacados (inicio y final de protein-sequence) cuya expresión aumenta en las muestras sonicadas respecto a las no sonicadas. b. Subtipo luminal, con algunos fosfopéptidos humanos destacados (inicio y final de protein_sequence) cuya expresión aumenta en las muestras sonicadas respecto a las no sonicadas. c. Vías KEGG enriquecidas según las proteínas correspondientes a los fosfopéptidos cuya expresión aumenta en los tumores sonicados del subtipo basal. d. Vías KEGG enriquecidas según las proteínas correspondientes a los fosfopéptidos cuya expresión aumenta en los tumores sonicados del subtipo luminal.
Estudio y gráficos: ©Li et al., 2025

Diseño, fabricación y asesoramiento – Calidad fabricada en Alemania

Los sonicadores ultrasónicos Hielscher son conocidos por sus máximos estándares de calidad y diseño. Su robustez y facilidad de manejo permiten integrar nuestros sonicadores ultrasónicos sin dificultades en instalaciones industriales. Los sonicadores ultrasónicos Hielscher funcionan con facilidad en condiciones adversas y entornos exigentes.

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Bibliografía / Referencias

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.