Flujos de trabajo proteómicos con digestión de proteínas de alto rendimiento

La proteómica es un campo esencial para comprender los procesos y sistemas biológicos, y la digestión de proteínas constituye una etapa crítica de sus flujos de trabajo. Tradicionalmente, la digestión de proteínas se realiza en solución utilizando enzimas proteolíticas como la tripsina, que hidroliza específicamente los enlaces peptídicos en los residuos de lisina y arginina. Este proceso genera péptidos adecuados para la ionización y fragmentación en aplicaciones de espectrometría de masas (MS). Sin embargo, los métodos de digestión convencionales requieren 12–24 horas para completarse, lo que genera importantes cuellos de botella en los flujos de trabajo proteómicos.
La ultrasonicación ofrece una alternativa potente que reduce drásticamente los tiempos de digestión de horas a tan solo unos minutos. Al combinarse con sonicadores avanzados para múltiples muestras, como el CupHorn de Hielscher, el VialTweeter y el sonicador para placas de 96 pocillos UIP400MTP, la ultrasonicación permite realizar análisis proteómicos acelerados y de alto rendimiento. Estas tecnologías agilizan los flujos de trabajo, reducen el tiempo de preparación de las muestras y aumentan la eficiencia sin comprometer la reproducibilidad ni la calidad de los datos.

El papel de la energía ultrasónica en la digestión de proteínas

La ultrasonicación utiliza ondas de ultrasonido focalizadas para generar cavitación – microburbujas localizadas que colapsan y generan intensas fuerzas de cizallamiento. Este fenómeno mejora la transferencia de masa, favorece la mezcla de las enzimas con los sustratos y despliega las estructuras de las proteínas, exponiendo los sitios de escisión a enzimas proteolíticas como la tripsina.
¿El resultado? Una reducción significativa del tiempo de digestión sin comprometer la eficiencia ni la reproducibilidad.

Digestión proteolítica mejorada mediante ultrasonidos: metodología y resultados

Protocolo de digestión acelerada

La digestión asistida por ultrasonidos combina enzimas proteolíticas y energía ultrasónica para acelerar los flujos de trabajo. Por ejemplo, al utilizar el UP200St-CupHorn de Hielscher (200 W, 26 kHz), el flujo de trabajo de digestión se desarrolla de la siguiente manera:

1. Reducción: las muestras de proteínas (0,5 mg/mL, 20 µL) se tratan con DTT (2 µL, 110 mM) en tampón de bicarbonato de amonio (12,5 mM). Se aplica sonicación al 50% de amplitud durante 5 minutos.
2. Alquilación: tras añadir IAA (2 µL, 400 mM), se repite la sonicación en las mismas condiciones.
3. Digestión: las muestras se diluyen y se incuban con nanopartículas con tripsina inmovilizada. Una última etapa de sonicación (5 minutos) completa la digestión. Los péptidos se separan, se secan y se almacenan para su análisis por MS.

Este método ultrasónico reduce el tiempo total de preparación de 12 horas a menos de 30 minutos. A pesar de la aceleración del proceso, el rendimiento y la calidad de los péptidos se mantienen en consonancia con los métodos tradicionales de digestión durante toda la noche.

Eficiencia de la digestión ultrasónica de proteínas

En estudios comparativos con proteomas de E. coli:

• Identificación de proteínas: En las muestras digeridas mediante ultrasonidos se identificaron 777 proteínas en 5 minutos, frente a 817 en 12 horas. Las identificaciones de proteínas comunes a ambos métodos superaron el 70%.
• Reproducibilidad: Los análisis de réplicas mostraron valores de correlación superiores al 98% dentro de cada método, lo que demuestra su fiabilidad.
• Selectividad: Cada método digirió preferentemente determinadas proteínas: la digestión ultrasónica favoreció la digestión de 65 proteínas y la digestión durante toda la noche, la de 54 proteínas. Estas diferencias sutiles ponen de relieve el potencial singular de la ultrasonicación para aplicaciones específicas.

Resultados de la cuantificación de proteínas sin marcaje de siete proteínas añadidas a una muestra de E. coli.
Las siguientes proteínas se añadieron a dos niveles diferentes, como se indica en la columna
denominada «Theo Ratio». Theo Ratio es la relación teórica entre los dos niveles utilizados en este
experimento. Albúmina sérica bovina (ALBU), β-lactoglobulina (LACB), caseína α-S1 (CASA1),
caseína α-S2 (CASA2), citocromo c (CYC), ovoalbúmina (OVAL) y anhidrasa carbónica 2
(CAH2). Las relaciones se calcularon utilizando las intensidades de las proteínas obtenidas mediante LFQ a partir del análisis con MaxQuant.
Se aplicó la prueba t de Student para comparar los valores obtenidos con cada método (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Estudio y gráfico: © Martins et al., 2019)

Tripsina inmovilizada en nanopartículas

La combinación de nanopartículas con tripsina inmovilizada (p. ej., T-FMNPs) y ultrasonicación mejora aún más los flujos de trabajo proteómicos. Estas nanopartículas proporcionan una gran superficie para las interacciones entre enzima y sustrato, lo que aumenta la eficiencia. Cuando se aplica a proteomas complejos, como el de E. coli, el método combinado consigue:

• Rapidez: Digestión completa en 5 minutos.
• Exactitud: Cuantificación de proteínas comparable a la de los métodos tradicionales (p > 0,01, n=3).
• Escalabilidad: La adaptación a plataformas multipocillo como el UIP400MTP permite un procesamiento de alto rendimiento.

¡Haga clic aquí para consultar el protocolo detallado con instrucciones paso a paso!
(véase Martins et al., 2019)

Digestión proteolítica rápida y de alto rendimiento con los sonicadores de Hielscher

Los mejores modelos de sonicadores para proteómica

Hielscher Ultrasonics ofrece varios modelos de sonicadores para la preparación simultánea de múltiples muestras, lo que facilita los flujos de trabajo de alto rendimiento. Tanto si trabaja con viales, tubos de ensayo, placas multipocillo (p. ej., placas de 6, 24 o 96 pocillos) o placas de Petri, le ofrecemos los sonicadores ideales para sus experimentos.

Sonicador para placas multipocillo UIP400MTP

Para lograr la máxima capacidad de procesamiento, el UIP400MTP permite tratar placas de 96 pocillos mediante ultrasonidos. Compatible con cualquier microplaca estándar, el UIP400MTP no requiere consumibles exclusivos costosos y le ofrece la libertad de elegir la placa multipocillo más adecuada para su investigación. Al suministrar energía de manera uniforme en toda la placa, permite realizar rápidamente la reducción, la alquilación y la digestión de hasta 200 proteomas complejos en tan solo 1 hora. Este nivel de automatización y eficiencia es crucial para la proteómica de alto rendimiento y las aplicaciones clínicas. ¡Obtenga más información sobre el sonicador para placas multipocillo!

VialTweeter

El VialTweeter está diseñado para laboratorios que requieren la sonicación simultánea de hasta 10 viales o tubos de ensayo. Su método no invasivo elimina los riesgos de contaminación cruzada y garantiza una digestión de proteínas reproducible. Este dispositivo es ideal para investigadores que trabajan con volúmenes de muestra limitados o con diversos tipos de muestras.
¡Obtenga más información sobre el sonicador para múltiples tubos VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

El sonicador CupHorn es un potente dispositivo diseñado para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras en recipientes cerrados herméticamente. Garantiza una distribución uniforme de la energía ultrasónica y un control preciso de la temperatura. La capacidad de procesar hasta cinco muestras simultáneamente, junto con su compatibilidad con los flujos de trabajo de reducción, alquilación y digestión, convierte al CupHorn en una herramienta fiable para la proteómica basada en MS.
¡Obtenga más información sobre el CupHorn SonoReactor!

Protocolo paso a paso para la digestión proteolítica asistida por ultrasonicación con tripsina inmovilizada en nanopartículas

Este protocolo de Martins et al. (2019) está optimizado para la digestión rápida de proteínas mediante energía ultrasónica y tripsina inmovilizada en nanopartículas (T-FMNPs). Los pasos descritos garantizan una reducción, una alquilación y una proteólisis eficientes, adecuadas para aplicaciones de espectrometría de masas (MS).
Pasos del protocolo

1. Reducción de los enlaces disulfuro
   • Añada 2 µL de solución de DTT (110 mM) a la muestra de proteínas de 20 µL (0,5 mg/mL) en tampón AmBic.
   • Coloque el tubo de muestra en el sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Someta la muestra a sonicación durante 2,5 minutos al 50% de amplitud (200 W, 26 kHz).
   • Haga una breve pausa para permitir el enfriamiento y, a continuación, aplique sonicación durante otros 2,5 minutos en las mismas condiciones.
2. Alquilación de los residuos de cisteína reducidos
   • Añada 2 µL de solución de IAA (400 mM) a la muestra de proteínas reducida.
   • Aplique sonicación durante 2,5 minutos al 50% de amplitud para facilitar la alquilación.
   • Haga una pausa para permitir el enfriamiento y, a continuación, aplique sonicación durante otros 2,5 minutos.

   Nota: reduzca al mínimo la exposición de la muestra alquilada a la luz para evitar la degradación del IAA.

3. Dilución de la muestra
   • Diluya la muestra de proteínas alquilada hasta un volumen final de 100 µL utilizando tampón AmBic de 25 mM con un 4% de acetonitrilo (v/v).
   • Mezcle bien mediante pipeteo suave.
4. Digestión proteolítica con tripsina inmovilizada en nanopartículas
   • Añada 20 µL de solución de T-FMNP (3 mg/mL) a la muestra de proteínas diluida.
   • Someta la mezcla a sonicación en el sonoreactor durante 2,5 minutos al 50% de amplitud.
   • Haga una pausa para permitir el enfriamiento y, a continuación, aplique sonicación durante otros 2,5 minutos en las mismas condiciones.
5. Separación de las nanopartículas con tripsina
   • Utilice un imán para separar las T-FMNPs del sobrenadante que contiene los péptidos digeridos.
   • Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo.
6. Preparación de los péptidos para el análisis por MS
   • Seque el sobrenadante que contiene los péptidos en una centrífuga de vacío.
   • Almacene los péptidos secos a -20 °C hasta su posterior análisis por espectrometría de masas.