Flujos de trabajo proteómicos con digestión de proteínas de alto rendimiento

La proteómica es un campo esencial para comprender los procesos y sistemas biológicos, y la digestión de proteínas constituye un paso crítico en sus flujos de trabajo. Tradicionalmente, la digestión de proteínas se lleva a cabo en solución utilizando enzimas proteolíticas como la tripsina, que hidroliza específicamente los enlaces peptídicos en los residuos de lisina y arginina. Este proceso genera péptidos adecuados para la ionización y fragmentación en aplicaciones de espectrometría de masas (EM). Sin embargo, los métodos de digestión convencionales requieren entre 12 y 24 horas para completarse, lo que crea importantes cuellos de botella en los flujos de trabajo proteómicos.
La ultrasonicación ofrece una potente alternativa, acortando drásticamente los tiempos de digestión de horas a sólo unos minutos. Cuando se combina con sonicadores multimuestra avanzados como el CupHorn de Hielscher, el VialTweeter y el sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP, la ultrasonicación permite una proteómica acelerada de alto rendimiento. Estas tecnologías agilizan los flujos de trabajo, reducen el tiempo de preparación de las muestras y aumentan la eficiencia sin comprometer la reproducibilidad ni la calidad de los datos.

El papel de la energía ultrasónica en la digestión de proteínas

La ultrasonicación emplea ondas ultrasónicas focalizadas para crear microburbujas de cavitación localizadas que se colapsan para generar intensas fuerzas de cizallamiento. Este fenómeno mejora la transferencia de masa, favorece la mezcla de enzimas con sustratos y despliega las estructuras proteicas, exponiendo los puntos de corte a enzimas proteolíticas como la tripsina.
¿El resultado? Una reducción significativa del tiempo de digestión sin comprometer la eficacia ni la reproducibilidad.

Digestión proteolítica potenciada por ultrasonidos: Metodología y resultados

Protocolo de digestión acelerada

La digestión asistida por ultrasonidos combina enzimas proteolíticas y energía ultrasónica para agilizar los flujos de trabajo. Por ejemplo, utilizando la UP200St-CupHorn de Hielscher (200 W, 26 kHz), el flujo de trabajo de la digestión procede como sigue:

1. Reducción: Las muestras de proteínas (0,5 mg/mL, 20 µL) se tratan con DTT (2 µL, 110 mM) en tampón de bicarbonato amónico (12,5 mM). Se aplica sonicación al 50% de amplitud durante 5 minutos.
2. Alquilación: Tras añadir IAA (2 µl, 400 mM), se repite la sonicación en las mismas condiciones.
3. Digestión: Las muestras se diluyen y se incuban con nanopartículas de tripsina inmovilizadas. Una última ronda de sonicación (5 minutos) completa la digestión. Los péptidos se separan, se secan y se almacenan para el análisis por EM.

Este método ultrasónico reduce el tiempo total de preparación de 12 horas a menos de 30 minutos. A pesar de la aceleración del proceso, el rendimiento y la calidad de los péptidos siguen siendo los mismos que con los métodos tradicionales de una noche.

Eficacia de la digestión ultrasónica de proteínas

En estudios comparativos con proteomas de E. coli:

• Identificación de proteínas: Las muestras digeridas por ultrasonidos identificaron 777 proteínas en 5 minutos, frente a 817 en 12 horas. Las identificaciones de proteínas compartidas superaron el 70%.
• Reproducibilidad: Los análisis por duplicado mostraron valores de correlación superiores al 98% dentro de cada método, lo que demuestra su fiabilidad.
• Selectividad: Ciertas proteínas fueron digeridas preferentemente por cada método, favoreciendo la digestión ultrasónica a 65 proteínas y la digestión nocturna a 54 proteínas. Estas diferencias matizadas subrayan el potencial único de la ultrasonicación para aplicaciones específicas.

Resultados de la cuantificación de proteínas sin etiqueta de siete proteínas introducidas en una E. coli
muestra. Se añadieron las siguientes proteínas en dos niveles diferentes, como se indica en la columna
denominada "Ratio Theo". Theo Ratio es la relación teórica entre los dos niveles utilizados en esta
experimento. Albúmina sérica bovina (ALBU), β-lactoglobulina (LACB), α-S1 caseína (CASA1),
α-S2 caseína (CASA2), citocromo c (CYC), ovoalbúmina (OVAL) y anhidrasa carbónica 2
(CAH2). Las proporciones se calcularon utilizando las intensidades de proteínas LFQ obtenidas de MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Estudio y gráfico: © Martins et al., 2019)

Tripsina inmovilizada por nanopartículas

La integración de nanopartículas de tripsina inmovilizadas (por ejemplo, T-FMNPs) con ultrasonidos mejora aún más los flujos de trabajo proteómicos. Estas nanopartículas proporcionan una gran superficie para las interacciones enzima-sustrato, lo que aumenta la eficacia. Cuando se aplica a proteomas complejos, como el de E. coli, el método combinado consigue:

• Velocidad: Digestión completa en 5 minutos.
• Precisión: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Escalabilidad: La adaptación a plataformas de múltiples pocillos como la UIP400MTP permite un procesamiento de alto rendimiento.

Haga clic aquí para consultar el protocolo detallado con instrucciones paso a paso.
(cf. Martins et al., 2019)

Digestión proteolítica a alta velocidad y alto rendimiento con sonicadores Hielscher

Los mejores modelos de sonicadores para proteómica

Hielscher Ultrasonics ofrece varios modelos de sonicadores para la preparación simultánea de múltiples muestras que facilitan los flujos de trabajo de alto rendimiento. Tanto si trabaja con viales, tubos de ensayo, placas multipocillo (p. ej. placas de 6, 24 o 96 pocillos) o placas Petri – le ofrecemos los sonicadores ideales para sus experimentos.

UIP400MTP Sonicator para placas de pocillos múltiples

Para obtener el máximo rendimiento, el UIP400MTP permite procesar placas de 96 pocillos por ultrasonidos. Compatible con cualquier microplaca estándar, el UIP400MTP no requiere costosos desechables patentados y le da la libertad de elegir la mejor placa multipocillo para su investigación. Al suministrar energía uniforme en toda la placa, permite una rápida reducción, alquilación y digestión de hasta 200 proteomas complejos en sólo 1 hora. Este nivel de automatización y eficiencia es crucial para la proteómica de alto rendimiento y las aplicaciones clínicas. Más información sobre el sonicador de placas de pocillos múltiples

VialTweeter

El VialTweeter está diseñado para laboratorios que requieren la sonicación simultánea de hasta 10 viales o tubos de ensayo. Su enfoque no invasivo elimina los riesgos de contaminación cruzada al tiempo que garantiza una digestión de proteínas reproducible. Este dispositivo es ideal para investigadores que trabajan con volúmenes de muestra limitados o diversos tipos de muestras.
Más información sobre el sonicador multitubular VialTweeter

Hielscher UP200St-CupHorn

El sonicador CupHorn es un potente dispositivo diseñado para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras en recipientes sellados. Garantiza una distribución uniforme de la energía ultrasónica y un control preciso de la temperatura. La capacidad de procesar hasta cinco muestras simultáneamente, junto con su compatibilidad con flujos de trabajo reducidos, alquilados y digeridos, convierten al CupHorn en una herramienta fiable para la proteómica basada en MS.
Más información sobre CupHorn SonoReactor

Protocolo paso a paso para la digestión proteolítica asistida por ultrasonidos utilizando tripsina inmovilizada por nanopartículas

Este protocolo de Martins et al. (2019) está optimizado para la digestión rápida de proteínas utilizando energía ultrasónica y tripsina inmovilizada por nanopartículas (T-FMNPs). Los pasos descritos garantizan una reducción, alquilación y proteólisis eficientes adecuadas para aplicaciones de espectrometría de masas (EM).
Pasos del protocolo

1. Reducción de los enlaces disulfuro
   • Añadir 2 µL de solución de DTT (110 mM) a los 20 µL de muestra de proteína (0,5 mg/mL) en tampón AmBic.
   • Coloque el tubo de muestra en el sonorreactor UP200St-CupHorn.
   • Sonicar la muestra durante 2,5 minutos al 50% de amplitud (200 W, 26 kHz).
   • Hacer una breve pausa para permitir el enfriamiento y, a continuación, sonicar durante otros 2,5 minutos en las mismas condiciones.
2. Alquilación de residuos de cisteína reducidos
   • Añadir 2 µl de solución de IAA (400 mM) a la muestra de proteína reducida.
   • Sonicar durante 2,5 minutos al 50% de amplitud para facilitar la alquilación.
   • Hacer una pausa para enfriar y, a continuación, sonicar durante 2,5 minutos más.

   Nota: Minimizar la exposición de la muestra alquilada a la luz para evitar la degradación del IAA.

3. Dilución de la muestra
   • Diluir la muestra de proteína alquilada hasta un volumen final de 100 µl utilizando un tampón AmBic 25 mM que contenga un 4% de acetonitrilo (v/v).
   • Mezclar bien mediante pipeteo suave.
4. Digestión proteolítica con tripsina inmovilizada por nanopartículas
   • Añadir 20 µl de solución de T-FMNP (3 mg/mL) a la muestra de proteína diluida.
   • Sonicar la mezcla en el sonorreactor durante 2,5 minutos a una amplitud del 50%.
   • Hacer una pausa para enfriar y, a continuación, sonicar durante otros 2,5 minutos en las mismas condiciones.
5. Separación de nanopartículas de tripsina
   • Utilizar un imán para separar las T-FMNPs del sobrenadante que contiene los péptidos digeridos.
   • Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
6. Preparación de péptidos para análisis MS
   • Secar el sobrenadante que contiene péptidos en una centrifugadora de vacío.
   • Almacenar los péptidos secos a -20°C hasta su posterior análisis por espectrometría de masas.