Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante el cizallamiento de ADN y ARN, las moléculas de ADN se rompen en pedazos más pequeños. La fragmentación de ADN / ARN es uno de los pasos importantes de preparación de muestras necesarios para crear bibliotecas para la secuenciación de la próxima generación (NGS).
  • El cizallamiento ultrasónico del ADN utiliza las fuerzas de la cavitación acústica para romper el ADN o el ARN en pedazos de 100 – 5kb pb.
  • El cizallamiento ultrasónico permite la fragmentación y adaptación precisa del ADN a la longitud deseada del ADN.

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones basadas en ultrasonido para cizallamiento de ADN, ARN y cromatina. Elija entre ultrasonidos de tipo sonda (p. Ej., UP100H) para sonicación directa utilizando un microtip, o use el VialTweeeter o el Cuphorn ultrasónico para la preparación indirecta de ADN de varias muestras simultáneamente. Hielscher ofrece el dispositivo ideal teniendo en cuenta sus necesidades: si tiene 1 o hasta 10 muestras, volúmenes de microlitros a litros. – Los procesadores ultrasónicos Hielscher están disponibles para satisfacer sus requisitos para preparar fragmentos de ADN, ARN y cromatina en la longitud correcta. La reproducibilidad, la fácil operación y el control preciso permiten una biblioteca confiable para la secuenciación de la próxima generación.
A diferencia de la fragmentación del ADN enzimático, el cizallamiento ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento mecánicas puras sin agregar ningún producto químico. Mediante el ajuste preciso de los parámetros del proceso, el cizallamiento ultrasónico produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (plásmido y ADN genómico).
Los ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes o después de una etapa de fragmentación.
Los parámetros de sonicación (potencia, ciclo de impulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) se pueden controlar de forma segura a través de la configuración del software.

Ventajas:

  • control preciso
  • Ciclos de sonicación y tiempo adaptable al tamaño de ADN deseado.
  • fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • control de temperatura
  • rápido
  • resultados reproducibles
  • autoclavable
  • varias soluciones: Tipo de sonda, VialTweeter y Cuphorn

Protocolos para el corte ultrasónico de ADN

Para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

En resumen, las células se colocaron en placas de 60 mm de diámetro (400.000 por placa) y se transfectaron con ARNsi RhoA (como se describe); después de 72 h, se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 minutos a 37 ° C para unir las proteínas al ADN. La reacción de reticulación se detuvo mediante la adición de un décimo de volumen de 1.25 mol / L de glicina, dando una concentración final de 125 mmol / L. Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, se resuspendieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0 )] que contiene 1 mmol / L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag / ml de aprotinina y 1 Ag / ml de pepstatina A, y se mantuvo en hielo durante 30 minutos. Luego, los lisados celulares se sonicaron en hielo con un Hielscher UP200S Sonicador de ultrasonido (3 x 40 s, amplitud del 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hasta que las cromatinas entrecruzadas se cortaron para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pb. Se utilizó una décima parte del lisado completo para cuantificar la cantidad de ADN presente en diferentes muestras y se consideró como “entrada total de ADN”. Los sobrenadantes se incubaron con ADN de esperma de salmón / proteína agarosa-suspensión al 50% para reducir el fondo no específico. La inmunoprecipitación se realizó luego durante la noche a 4 ° C con 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes se suplementaron con 5 mol / L de NaCl y se calentaron durante la noche a 65 ° C para revertir los enlaces cruzados de proteína-ADN. Los inmunocomplejos se trataron adicionalmente con proteinasa K libre de ADNasa y ARNasa, y el ADN se purificó mediante extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen iNOS humano (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudios de expresión de EGFP

Para estudios de expresión, la cepa recombinante L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (proteína fluorescente verde mejorada), ssu cromosómico integrado, se cultivó en los diversos medios como se describió anteriormente y suplementado adicionalmente con 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugaron (2000 x g, 20 ° C, 10 min) y se lavaron con una solución de NaCl al 0,9%. El sedimento se resuspendió en tampón (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) y se desintegró por sonificación con el procesador ultrasónico. UP400S (Aplicación de energía ∼ 400 Ws). Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación (6000 × g, 4 ° C, 5 min) y se analizaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio - poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones reductoras según el método de Laemmli (1970) con 12,5% de geles de poliacrilamida. . La expresión de EGFP se examinó en cultivo agitado. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometidos a ultrasonidos de 0 a 15 minutos. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

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Inmunoprecipitación de cromatina.

Disruptor ultrasónico de células UP100H (100W) para lisis, ruptura de células y cizallamiento de ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó utilizando el ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados se entrecruzaron con formaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y la reacción de fijación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS enfriado con hielo y se rasparon del plato. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos sedimentados se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 minutos y la cromatina se cortó por sonicación, por ejemplo. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) con una potencia del 25%, 5 pulsos de 20 segundos cada uno en hielo en fragmentos de aproximadamente 200–600 pb. La cromatina cortada se centrifugó y se recogió el sobrenadante. Para las inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o NF-κB p50 (Abcam) anticuerpos o con conejo. IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EE. UU.), Como control negativo, durante la noche a 4 ° C con una rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a las perlas magnéticas se recolectaron utilizando un soporte magnético, se lavaron extensivamente y los enlaces cruzados proteína / ADN se invirtieron y el ADN se eluyó para el análisis de PCR en tiempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparación de ADN EHEC para el análisis de matriz de chips

Disposición de lisados celulares y ADN extraídos.
Los sedimentos bacterianos suspendidos en PBS a la concentración final deseada se trataron con disruptor de ultrasonido UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con un microtip MS1 (1 mm de diámetro). La frecuencia de operación fue de 30 kHz y la potencia de salida efectiva fue de 100 W. Durante la operación, las muestras se enfriaron en un baño de agua con hielo, se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que para su posterior manejo, las muestras se sometieron a un tratamiento térmico (95 ° C, 5 min). Los lisados celulares crudos se procesaron con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, la solución se agitó vigorosamente durante 15 segundos y se centrifugó a 15.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT) a aproximadamente 22 ° C. La fase acuosa superior que contenía el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un nuevo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, las muestras se sonicaron para fragmentar el ADN. La etapa de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de la fragmentación en el ADN genómico, las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
(…) Las muestras sometidas a sonicación previamente durante 2,5 minutos se sometieron a una etapa de extracción después del tratamiento térmico y la centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y luego se sometió a una segunda sonicación durante 0-15 minutos. La electroforesis en gel de agarosa se utilizó para determinar la distribución del tamaño del ADN sometido a una fragmentación ultrasónica posterior a la extracción (Fig. En la parte superior derecha). El ADN altamente fragmentado fue evidente por la presencia de un frotis de ADN en lugar de bandas de alto peso molecular que se eliminaron de las muestras sometidas a ultrasonidos durante 2,5 minutos o más. La sonicación más prolongada redujo gradualmente la longitud de los fragmentos a aproximadamente 150 - 600 pb, y la sonicación durante 15 minutos degradó aún más estos fragmentos, como se puede observar principalmente en la parte superior del frotis. Por lo tanto, el tamaño promedio de los fragmentos de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonicación y el tratamiento de 5 minutos permitió obtener los tamaños de los fragmentos de ADN más adecuados para los ensayos de matriz de chips. Finalmente, se estableció el procedimiento de preparación de analito de ADN que comprende los primeros 2 minutos de tratamiento ultrasónico, la extracción de ADN (2x) y la subsiguiente sonicación de 5 minutos. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Procesador ultrasónico UP100H para cizallamiento de ADN, ARN y cromatina. (¡Click para agrandar!)Las células HEK293 se cultivaron como se describe anteriormente y se fijaron con disuccinimidil-glutarato 2 mM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se reticuló durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando formaldehído al 1% (v / v) y se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. La reacción de reticulación se detuvo por incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación con tripsina, las células se rasparon de la placa de cultivo celular y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (tubos 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y Nonidet P-40 al 0,5% (v / v), se incubó en hielo durante 10 minutos y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se sedimentaron por centrifugación (3500 xg, 5 min, 4 ° C) y se resuspendieron en un tampón de núcleos (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, EDTA 10 mM y SDS al 1% (p / v)). Los núcleos fueron interrumpidos por sonicación con tres pulsos de 20 s en una Sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un ajuste de ciclo 0.5 y amplitud del 30%, produciendo fragmentos de ADN genómico con un tamaño de 200 a 1000 pb. Para ChIP, 50 g de ADN se diluyeron 4 veces en tampón de inmunoprecipitación (Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, 1,1% (v / v) Triton X-100 y 0,01% (p / v) v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análisis de modificación de histonas por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP).

En pocas palabras, 6 x 106 las células se lavaron dos veces con PBS y se entrecruzaron en la placa de cultivo durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de reticulación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 48 ° C. Todos los tampones se pre-enfriaron y contenían inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se rasparon. Los sedimentos recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (SDS al 1%, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, pH 8) y se trataron con ultrasonidos en un baño de etanol frío durante 10 ciclos a una amplitud del 100% utilizando un Sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). La fragmentación de la cromatina se visualizó en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos obtenidos estaban en el rango de 200 a 500pb. La cromatina soluble se obtuvo por centrifugación de las muestras sometidas a ultrasonidos a 14,000 g durante 10 min a 48 ° C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, Tris 20 mM pH 8, NaCl 150 mM), luego se dividió en partes alícuotas y se almacenó a 80 ° C hasta su uso. (Rodriguez et al. 2008)

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
VialTweeter 200 autónomo 0,5 1,5
UP50H 50 manual o en soporte 0,01 250
UP100H 100 manual o en soporte 0,01 500
UP200Ht 200 manual o en soporte 0,1 1000
UP200St 200 en soporte 0,1 1000
UP400St 400 en soporte 5,0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

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Literatura/Referencias

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.O., Gabig-Ciminska M. (2008): Procesamiento de muestras para el análisis de Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) basado en matriz de chips de ADN. Fábricas de células microbianas 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): el silenciamiento RhoA revierte la resistencia a la doxorubicina en células de cáncer de colon humano. Investigación de cáncer molecular 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): evaluación del método de extracción de ADN de Fusarium de micelios y trigo para la cuantificación de la PCR en tiempo real en sentido descendente y la correlación con los niveles de micotoxinas . Revista de Métodos Microbiológicos 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterización del comportamiento de crecimiento de Leishmania tarentolae, un nuevo sistema de expresión para proteínas recombinantes. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Welsh GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulación del gen Neph3 en podocitos: funciones clave de los factores de transcripción NF-κB y Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Seguimiento de todo el genoma de ADN Alet no metilado repetido en células normales y cancerosas. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La proteína Hid1 de la tríada de histidina desencadena la apoptosis independientemente de su actividad enzimática. La revista de química biológica. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.


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