Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante ADN y ARN de cizallamiento, las moléculas de ADN se rompen en pedazos más pequeños. ADN / ARN fragmentación es uno de los pasos de preparación de muestras importante que se requiere crear bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS).
  • Ultrasónico de corte de ADN utiliza las fuerzas de cavitación acústica para romper el ADN o ARN en trozos de 100 – pb 5 kb.
  • cizalladura ultrasónica permite la fragmentación del ADN preciso y adaptación a la longitud deseada de ADN.

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

Hielscher Ultrasonidos ofrece diversas soluciones basadas en la ecografía para el ADN, el ARN y el corte de la cromatina. Elegir entre un tipo de sonda ultrasonicators (por ejemplo UP100H) para sonicación directa usando una micropunta, o utilizar el VialTweeeter o la cuphorn ultrasónico para preparación de ADN indirecta de varias muestras simultáneamente. Hielscher ofrece el dispositivo ideal teniendo en cuenta sus necesidades: ya sea que se tiene 1 o hasta 10 muestras, los volúmenes de microlitro a volúmenes de litros – procesadores de ultrasonidos Hielscher están disponibles para satisfacer sus necesidades para preparar ADN, ARN y fragmentos de la cromatina en la longitud correcta. Reproducibilidad, fácil operación y control preciso permiten una biblioteca fiable para la secuenciación de próxima generación.
En contraste con la fragmentación del ADN enzimática, corte ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento mecánicas pura sin la adición de ningún producto químico. Por el ajuste preciso de los parámetros del proceso, cizallamiento ultrasónica produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (de plásmidos y de ADN genómico).
ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes de o después de una etapa de fragmentación.
parámetros de sonicación (potencia, ciclo de impulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) se pueden controlar de forma segura a través de la configuración del software.

Ventajas:

  • control preciso
  • ciclos de sonicación y el tiempo precisamente adaptables al tamaño de ADN deseado
  • fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • control de temperatura
  • rápido
  • resultados reproducibles
  • autoclavable
  • varias soluciones: Tipo sonda, VialTweeter y Cuphorn

Los protocolos para ultrasónico ADN Shearing

Para la inmunoprecipitación de la cromatina Ensayo

Brevemente, las células se plaquearon en placas de 60 mm de diámetro (400,000 por placa) y se transfectaron con ARNip de RhoA (como se describe); después de 72 h, se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 minutos a 37 ° C para unir proteínas al ADN. La reacción de reticulación se inactivó mediante la adición de un décimo de volumen de 1,25 mol / l de glicina, dando una concentración final de 125 mmol / l. Las células se lavaron dos veces con PBS helado, se resuspendieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [150 mmol / l de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 5 mmol / l de EDTA, 50 mmol / l de Tris-HCl (pH 8,0) )] que contiene 1 mmol / l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 ag / ml de aprotinina y 1 ag / ml de pepstatina A, y se mantuvo en hielo durante 30 minutos. Luego, los lisados ​​celulares se sonicaron en hielo con un Hielscher UP200S ecografía de ultrasonidos (3 x 40 s, la amplitud del 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonidos GmbH) hasta cromatinas reticulados fueron cizalladas para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pb. Una décima parte de lisado entero se utilizó para cuantificar la cantidad de ADN presente en diferentes muestras y considerado como “ADN total de entrada”. Los sobrenadantes se incubaron con ADN de esperma de salmón / proteína de agarosa-suspensión al 50% para reducir el fondo no específico. entonces inmunoprecipitación se realizó durante la noche a 4 ° C con 5 Ag de p65 anti-NF-NB (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes fueron suplementados con 5 mol / L de NaCl y se calentó durante la noche a 65 ° C para revertir proteínas de ADN enlaces cruzados. Los inmunocomplejos se trataron adicionalmente con DNasa y proteinasa RNasa libre de K, y el ADN se purificó por extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen de la iNOS humana (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador P2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Los estudios de expresión de EGFP

Para estudios de expresión, el p10 cepa de L. tarentolae :: recombinante F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromosómico SSU integrado, fue cultivada en los diversos medios como se describe anteriormente y adicionalmente suplementado con l 100 mg-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugó (2000 xg, 20 ° C, 10 min) y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%. El sedimento se resuspendió en tampón (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) y se desintegró mediante sonicación con el procesador ultrasónico UP400S (Aplicación de la energía ~ 400 Ws). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (6000 x g, 4 ° C, 5 min) y se analizó por dodecil sulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras según el método de Laemmli (1970) con 12,5% de geles de polyacralamide . EGFP expresión se examinó en la cultura agitado. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electroforética análisis de ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min ultrasonicación. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

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inmunoprecipitación de la cromatina

Ultrasonic UP100H disruptor celular (100W) para la lisis, la ruptura celular y el cizallamiento del ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina se realizó utilizando el chip-TITM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados fueron reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y la reacción de fijación se detuvo añadiendo 0.125 M de glicina durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS enfriado en hielo y se rasparon de la placa. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos sedimentadas se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 min y la cromatina se sometió a cizallamiento por sonicación, por ejemplo, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) al 25% de potencia 5 pulsos de 20 segundos cada uno en hielo en fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. La cromatina cortada se centrifugó y se recogió el sobrenadante. Para las inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de anticuerpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o NF-κB p50 (Abcam) o con conejo IgG (Laboratorios Zymed, South San Francisco, CA, EE. UU.), Como control negativo, durante la noche a 4 ° C con rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a las perlas magnéticas se recogieron usando un soporte magnético, se lavaron extensivamente, y los enlaces cruzados de proteína / ADN se invirtieron y el ADN se eluyó para el análisis de PCR en tiempo real. (Ristola et al. 2009)

preparación de ADN EHEC para el análisis de matriz de chips de

Disposición de los lisados ​​celulares y los ADN extraídos
Los sedimentos bacterianos en suspensión en PBS a la concentración final deseada fueron tratados con ecografía UP100H disruptor (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con una micropunta MS1 (1 mm de diámetro). La frecuencia de operación fue de 30 kHz y la potencia de salida efectiva fue de 100 W. Durante la operación, las muestras se enfriaron en un baño de agua helada, se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que para su posterior manejo, las muestras se sometieron a un tratamiento térmico (95 ° C, 5 min). Los lisados ​​celulares brutos se procesaron con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, la solución se sometió a agitación vorticial vigorosamente durante 15 segundos y se centrifugó a 15.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente (TA) a aproximadamente 22ºC. La fase acuosa superior que contiene el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un nuevo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, las muestras fueron sonicadas para fragmentar el ADN. El paso de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de fragmentación en el ADN genómico, las muestras se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa.
(…Las muestras sonicadas previamente durante 2,5 minutos se sometieron a una etapa de extracción después del tratamiento térmico y la centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, y luego se sometió a segunda sonicación durante 0 - 15 minutos. La electroforesis en gel de agarosa se usó para determinar la distribución del tamaño del ADN sometido a fragmentación ultrasónica posterior a la extracción (Fig. En la parte superior derecha). El ADN altamente fragmentado se hizo evidente a partir de la presencia de un frotis de ADN en lugar de bandas de alto peso molecular que se eliminaron de muestras sonicadas durante 2,5 minutos o más. La sonicación más prolongada redujo gradualmente las longitudes de los fragmentos a aproximadamente 150 - 600 pb, y la sonicación durante 15 min. Volvió a degradar estos fragmentos, como puede verse principalmente en la parte superior del frotis. Por lo tanto, el tamaño promedio del fragmento de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonicación y el tratamiento de 5 minutos permitió obtener los tamaños de fragmentos de ADN más adecuados para los ensayos de matriz de chips. Finalmente, se estableció el procedimiento de preparación del analito de ADN que comprendía los primeros 2 minutos de tratamiento ultrasónico, extracción de ADN (2x) y posterior sonicación de 5 minutos. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Ultrasonic  processor UP100H for DNA, RNA and chromatin shearing. (Click to enlarge!)Las células HEK293 se cultivaron como se describió anteriormente y se fijaron con disuccinimidil-glutarato 2 mM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se entrecruzó durante 10 minutos a temperatura ambiente usando 1% (v / v) de formaldehído y se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. La reacción de reticulación se detuvo mediante incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación con tripsina, las células se rasparon de la placa de cultivo celular y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (tubos de 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y Nonidet P-40 al 0,5% (v / v)), se incubó en hielo durante 10 minutos y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se sedimentaron por centrifugación (3500 xg, 5 min, 4 ° C) y se resuspendieron en tampón de núcleos (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, EDTA 10 mM y SDS al 1% (p / v)). Los núcleos fueron interrumpidos por sonicación con tres pulsos de 20 s en un sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un entorno de ciclo de 0,5 y la amplitud del 30%, produciendo fragmentos de ADN genómico con un tamaño mayor de 200 a 1.000 pb. Para CHIP, 50 g de DNA se diluyó 4 veces en tampón de inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, 1,1% (v / v) de Triton X-100, y 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

análisis modificación de las histonas por inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 106 las células se lavaron dos veces con PBS y se entrecruzaron en la placa de cultivo durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de reticulación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 48 ° C. Todos los tampones fueron preenfriados y contenían inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se rasparon. Los gránulos recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (SDS al 1%, EDTA 5 mM, Tris 50 mM pH 8) y se sometieron a ultrasonidos en un baño de etanol frío durante 10 ciclos al 100% de amplitud utilizando un sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). la fragmentación de la cromatina se visualizó en un gel de agarosa al 1%. fragmentos obtenidos estaban en el rango 200-500pb. cromatina soluble se obtuvo por centrifugación de las muestras sonicadas a 14.000 durante 10 minutos a 48 ° C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (1% Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM) y luego se dividió en alícuotas y se almacenó a 80 ° C hasta su uso. (Rodríguez et al. 2008)

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
VialTweeter 200 autónomo 0,5 1,5
UP50H 50 manual o en soporte 0,01 250
UP100H 100 manual o en soporte 0,01 500
UP200Ht 200 manual o en soporte 0,1 1000
UP200St 200 en soporte 0,1 1000
UP400St 400 en soporte 5,0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

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Literatura/Referencias

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Procesamiento de las muestras para el análisis basado en la matriz de chips de ADN de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). Las fábricas de células microbianas 7:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA silenciamiento revierte la resistencia a la doxorubicina en células de cáncer de colon humano. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): evaluación Método de extracción de ADN a partir de micelios Fusarium y trigo para down-stream en tiempo real cuantificación PCR y correlación con los niveles de micotoxinas . Revista de Métodos Microbiológicos 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterización del comportamiento de crecimiento de Leishmania tarentolae - un nuevo sistema de expresión para proteínas recombinantes. Revista de Microbiología Básica 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulación de Neph3 gen en los podocitos - papeles clave de factores de transcripción NF-KB y Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-amplia de seguimiento de no metilada de ADN Alu repite en células normales y cancerosas. Nucleic Acids Vol Investigación. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La proteína histidina tríada Hint1 desencadena la apoptosis independiente de su actividad enzimática. El Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. desde 27.356 hasta 27.366.


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