Cizallamiento ultrasónico del ADN

Durante el cizallamiento del ADN y el ARN, las moléculas largas de ADN se fragmentan en partes más pequeñas, un paso crucial en la preparación de muestras para la construcción de bibliotecas de secuenciación de nueva generación (NGS). El cizallamiento ultrasónico del ADN emplea las fuerzas de cavitación acústica para romper el ADN o el ARN en fragmentos de entre 100 bp y 5 kb. Este método permite controlar con precisión el tamaño de los fragmentos y ajustarlo a la longitud de ADN deseada para obtener resultados óptimos de secuenciación.

Cizallamiento del ADN mediante ultrasonicación

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones basadas en ultrasonidos para el cizallamiento del ADN, el ARN y la cromatina. Elija un sonicador de tipo sonda (p. ej., UP100H) para la sonicación directa mediante una micropunta, o utilice el VialTweeeter o el cuphorn ultrasónico para la preparación indirecta de ADN de varias muestras simultáneamente. Hielscher ofrece el equipo ideal según sus necesidades: tanto si trabaja con 1 muestra como con hasta 10 muestras, con volúmenes desde microlitros hasta litros, los sonicadores Hielscher satisfarán sus requisitos para preparar fragmentos de ADN, ARN y cromatina con la longitud adecuada. La reproducibilidad, la facilidad de uso y el control preciso permiten obtener una biblioteca fiable para la secuenciación de nueva generación.
A diferencia de la fragmentación enzimática del ADN, el cizallamiento ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento puramente mecánicas sin añadir sustancias químicas. Mediante el ajuste preciso de los parámetros del proceso, el cizallamiento ultrasónico produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (ADN plasmídico y genómico).
Los ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes o después de una etapa de fragmentación.
Los parámetros de sonicación (potencia, ciclo de pulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) pueden controlarse de forma segura mediante los ajustes del software.

Protocolos para el cizallamiento ultrasónico del ADN

Para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

Brevemente, las células se sembraron en placas de 60 mm de diámetro (400.000 por placa) y se transfectaron con siRNA de RhoA (como se ha descrito); tras 72 h, se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 min a 37 °C para entrecruzar las proteínas con el ADN. La reacción de entrecruzamiento se detuvo añadiendo una décima parte del volumen de glicina a 1,25 mol/L, lo que dio una concentración final de 125 mmol/L. Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, se resuspendieron en tampón para el ensayo de radioinmunoprecipitación [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] que contenía 1 mmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag/mL de aprotinina y 1 Ag/mL de pepstatina A, y se mantuvieron en hielo durante 30 min. A continuación, los lisados celulares se sonicaron en hielo con un sonicador ultrasónico Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hasta cizallar la cromatina entrecruzada y obtener fragmentos de ADN de entre 200 y 1.000 bp. Se utilizó una décima parte del lisado completo para cuantificar la cantidad de ADN presente en las distintas muestras y se consideró como «ADN total de entrada». Los sobrenadantes se incubaron con una suspensión al 50% de ADN de esperma de salmón/agarosa con proteína para reducir el fondo inespecífico. A continuación, la inmunoprecipitación se realizó durante la noche a 4 °C con 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes se suplementaron con NaCl a 5 mol/L y se calentaron durante la noche a 65 °C para revertir los entrecruzamientos proteína-ADN. Los inmunocomplejos se trataron posteriormente con proteinasa K libre de DNasa y RNasa, y el ADN se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia de la región promotora del gen iNOS humano (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudios de expresión de EGFP

Para los estudios de expresión, la cepa recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemania), con el gen de EGFP (proteína verde fluorescente mejorada) integrado en el locus cromosómico ssu, se cultivó en los distintos medios como se ha descrito anteriormente, suplementados además con 100 mg l^-1 de Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugaron (2000 × g, 20 °C, 10 min) y se lavaron con una solución de NaCl al 0,9%. El sedimento se resuspendió en tampón (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) y se desintegró mediante sonicación con el procesador ultrasónico UP400S (aplicación de energía ∼ 400 Ws). Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (6000 × g, 4 °C, 5 min) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, según el método de Laemmli (1970), con geles de polyacralamide al 12,5%. La expresión de EGFP se examinó en cultivo con agitación. (Fritsche et al. 2007)

Inmunoprecipitación de cromatina

El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó utilizando el ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados se entrecruzaron con formaldehído al 1% durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y la reacción de fijación se detuvo añadiendo glicina a 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS enfriado en hielo y se desprendieron de la placa mediante raspado. Las células se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis. Tras la centrifugación, los núcleos sedimentados se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 min y la cromatina se cizalló mediante sonicación, p. ej., con UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) al 25% de potencia, con 5 pulsos de 20 sec cada uno en hielo, para obtener fragmentos de aproximadamente 200–600 bp. A continuación, la cromatina cizallada se centrifugó y se recogió el sobrenadante. Para las inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de anticuerpos frente a Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o NF-κB p50 (Abcam), o con IgG de conejo (Zymed Laboratories) como control negativo, durante la noche a 4 °C con rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a perlas magnéticas se recogieron utilizando un soporte magnético, se lavaron exhaustivamente y se revirtieron los entrecruzamientos proteína/ADN; el ADN se eluyó para su análisis mediante PCR en tiempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparación de ADN de EHEC para el análisis mediante micromatrices de ADN

Preparación de lisados celulares y ADN extraído
Los sedimentos bacterianos suspendidos en PBS hasta la concentración final deseada se trataron con el disruptor ultrasónico UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con una micropunta MS1 (1 mm de diámetro). La frecuencia de funcionamiento fue de 30 kHz y la potencia de salida efectiva fue de 100 W. Durante el funcionamiento, las muestras se enfriaron en un baño de agua con hielo, se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que, para su manipulación posterior, se sometieron a un tratamiento térmico (95 °C, 5 min). Los lisados celulares crudos se procesaron con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, la solución se agitó en vórtex vigorosamente durante 15 s y se centrifugó a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (RT), alrededor de 22 °C. La fase acuosa superior que contenía el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un tubo Eppendorf estéril nuevo.
Posteriormente, las muestras se sonicaron para fragmentar el ADN. La etapa de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de la fragmentación sobre el ADN genómico, las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
(…) Las muestras sonicadas previamente durante 2,5 min se sometieron a una etapa de extracción tras el tratamiento térmico y la centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y, posteriormente, se sometió a una segunda sonicación durante 0 – 15 min. Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para determinar la distribución de tamaños del ADN sometido a fragmentación ultrasónica tras la extracción (Fig. en la parte superior derecha). La elevada fragmentación del ADN se puso de manifiesto por la presencia de un arrastre difuso de ADN en lugar de las bandas de alto peso molecular, que desaparecieron de las muestras sonicadas durante 2,5 min o más. Una sonicación más prolongada redujo gradualmente la longitud de los fragmentos hasta aproximadamente 150 – 600 bp, y la sonicación durante 15 min degradó aún más estos fragmentos, como se aprecia principalmente en la parte superior del arrastre difuso. Por tanto, el tamaño medio de los fragmentos de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonicación y el tratamiento de 5 min permitió obtener los tamaños de fragmentos de ADN más adecuados para los ensayos con micromatrices de ADN. Finalmente, se estableció el procedimiento de preparación del analito de ADN, que comprendía primero 2 min de tratamiento ultrasónico, la extracción de ADN (2×) y una sonicación posterior de 5 min. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Las células HEK293 se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se fijaron con glutarato de disuccinimidilo a 2 mM durante 45 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se entrecruzó durante 10 min a temperatura ambiente utilizando formaldehído al 1% (v/v) y se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. La reacción de entrecruzamiento se detuvo mediante incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Tras la incubación con tripsina, las células se desprendieron de la placa de cultivo celular mediante raspado y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl y 0,5% (v/v) Nonidet P-40), se incubó en hielo durante 10 min y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 °C) y se resuspendieron en tampón para núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA y 1% (w/v) SDS). Los núcleos se rompieron mediante sonicación con tres pulsos de 20-s en un sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) con un ajuste de ciclo de 0,5 y una amplitud del 30%, obteniéndose fragmentos de ADN genómico con un tamaño mayoritario de 200 – 1000 bp. Para ChIP, se diluyeron 50 g de ADN por un factor de 4 en tampón de inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 y 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análisis de modificaciones de histonas mediante inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 10⁶ células se lavaron dos veces con PBS y se entrecruzaron en la placa de cultivo durante 15 min a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de entrecruzamiento se detuvo añadiendo glicina a 0,125 M. Todas las etapas posteriores se realizaron a 48 °C. Todos los tampones se enfriaron previamente y contenían inhibidores de proteasas (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y después se desprendieron mediante raspado. Los sedimentos recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) y se sonicaron en un baño de etanol frío durante 10 ciclos al 100% de amplitud utilizando un sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). La fragmentación de la cromatina se visualizó en un gel de agarosa al 1%. Los fragmentos obtenidos se encontraban en el intervalo de 200–500pb. La cromatina soluble se obtuvo centrifugando las muestras sonicadas a 14.000 g durante 10 min a 48 °C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), se dividió en alícuotas y se almacenó a 80 °C hasta su uso. (Rodriguez et al. 2008)