Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante ADN y ARN de cizallamiento, las moléculas de ADN se rompen en pedazos más pequeños. ADN / ARN fragmentación es uno de los pasos de preparación de muestras importante que se requiere crear bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS).
  • Ultrasónico de corte de ADN utiliza las fuerzas de cavitación acústica para romper el ADN o ARN en trozos de 100 – pb 5 kb.
  • cizalladura ultrasónica permite la fragmentación del ADN preciso y adaptación a la longitud deseada de ADN.

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

Hielscher Ultrasonidos ofrece diversas soluciones basadas en la ecografía para el ADN, el ARN y el corte de la cromatina. Elegir entre un tipo de sonda ultrasonicators (por ejemplo UP100H) para sonicación directa usando una micropunta, o utilizar el VialTweeeter o la cuphorn ultrasónico para preparación de ADN indirecta de varias muestras simultáneamente. Hielscher ofrece el dispositivo ideal teniendo en cuenta sus necesidades: ya sea que se tiene 1 o hasta 10 muestras, los volúmenes de microlitro a volúmenes de litros – procesadores de ultrasonidos Hielscher están disponibles para satisfacer sus necesidades para preparar ADN, ARN y fragmentos de la cromatina en la longitud correcta. Reproducibilidad, fácil operación y control preciso permiten una biblioteca fiable para la secuenciación de próxima generación.
En contraste con la fragmentación del ADN enzimática, corte ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento mecánicas pura sin la adición de ningún producto químico. Por el ajuste preciso de los parámetros del proceso, cizallamiento ultrasónica produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (de plásmidos y de ADN genómico).
ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes de o después de una etapa de fragmentación.
parámetros de sonicación (potencia, ciclo de impulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) se pueden controlar de forma segura a través de la configuración del software.

Ventajas:

  • control preciso
  • ciclos de sonicación y el tiempo precisamente adaptables al tamaño de ADN deseado
  • fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • control de temperatura
  • rápido
  • resultados reproducibles
  • autoclavable
  • varias soluciones: Tipo sonda, VialTweeter y Cuphorn

Los protocolos para ultrasónico ADN Shearing

Para la inmunoprecipitación de la cromatina Ensayo

Briefly, cells were plated in 60mm-diameter dishes (400,000 per dish) and transfected with RhoA siRNA (as described); after 72 h, they were incubated with formaldehyde (final concentration, 1%) for 10 min at 37°C to cross-link proteins to DNA. The cross-linking reaction was quenched by the addition of one-tenth volume of 1.25 mol/L glycine, giving 125 mmol/L final concentration. Cells were washed twice with ice-cold PBS, resuspended in radioimmunoprecipitation assay buffer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] containing 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag/mL aprotinin, and 1 Ag/mL pepstatin A, and kept on ice for 30 min. Then, cell lysates were sonicated on ice with a Hielscher UP200S ecografía de ultrasonidos (3 x 40 s, la amplitud del 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonidos GmbH) hasta cromatinas reticulados fueron cizalladas para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pb. Una décima parte de lisado entero se utilizó para cuantificar la cantidad de ADN presente en diferentes muestras y considerado como “ADN total de entrada”. Los sobrenadantes se incubaron con ADN de esperma de salmón / proteína de agarosa-suspensión al 50% para reducir el fondo no específico. entonces inmunoprecipitación se realizó durante la noche a 4 ° C con 5 Ag de p65 anti-NF-NB (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes fueron suplementados con 5 mol / L de NaCl y se calentó durante la noche a 65 ° C para revertir proteínas de ADN enlaces cruzados. Los inmunocomplejos se trataron adicionalmente con DNasa y proteinasa RNasa libre de K, y el ADN se purificó por extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen de la iNOS humana (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador P2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Los estudios de expresión de EGFP

Para estudios de expresión, el p10 cepa de L. tarentolae :: recombinante F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromosómico SSU integrado, fue cultivada en los diversos medios como se describe anteriormente y adicionalmente suplementado con l 100 mg-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugó (2000 xg, 20 ° C, 10 min) y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%. El sedimento se resuspendió en tampón (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) y se desintegró mediante sonicación con el procesador ultrasónico UP400S (Aplicación de la energía ~ 400 Ws). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (6000 x g, 4 ° C, 5 min) y se analizó por dodecil sulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras según el método de Laemmli (1970) con 12,5% de geles de polyacralamide . EGFP expresión se examinó en la cultura agitado. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electroforética análisis de ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min ultrasonicación. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

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inmunoprecipitación de la cromatina

Ultrasonic UP100H disruptor celular (100W) para la lisis, la ruptura celular y el cizallamiento del ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina se realizó utilizando el chip-TITM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados fueron reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y la reacción de fijación se detuvo añadiendo 0.125 M de glicina durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS enfriado en hielo y se rasparon de la placa. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos sedimentadas se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 min y la cromatina se sometió a cizallamiento por sonicación, por ejemplo, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) at 25% power 5 pulses of 20 sec each on ice into fragments of approximately 200–600 bp. The sheared chromatin was then centrifuged and the supernatant was collected. For immunoprecipitations, 60 μl of chromatin was incubated with 1 μg of Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) or NF-κB p50 (Abcam) antibodies or with rabbit IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), as a negative control, overnight at 4°C with gentle rotation. Immunocomplexes bound to magnetic beads were collected using a magnetic stand, washed extensively, and the protein/DNA crosslinks were reversed and DNA eluted for real-time PCR analysis. (Ristola et al. 2009)

preparación de ADN EHEC para el análisis de matriz de chips de

Disposición de los lisados ​​celulares y los ADN extraídos
Los sedimentos bacterianos en suspensión en PBS a la concentración final deseada fueron tratados con ecografía UP100H disruptor (Hielscher GmbH, Germany) equipped with a microtip MS1 (1mm in diameter). The operating frequency was 30 kHz and effective output power was 100 W. During the operation, samples were cooled in an ice-water bath, mixed and centrifuged. The samples were utilized for flow cytometry studies, while for later handling, samples were subjected to a heat treatment (95°C, 5 min). The crude cell lysates were processed with a mixture of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1). An equal volume of this mix was added to the lysate sample, the solution was vortexed vigorously for 15 s and centrifuged at 15,000 x g for 2 min at room temperature (RT) around 22°C. The top aqueous phase containing the genomic DNA was carefully separated and collected in a new sterile Eppendorf tube.
Subsequently, samples were sonicated to fragment the DNA. The sonication step was realized in the same conditions as described above. To evaluate the fragmentation effects on the genomic DNA, samples were analyzed by using agarose gel electrophoresis.
(…) The samples sonicated previously for 2.5 min were subjected to an extraction step after heat treatment and centrifugation. DNA released was extracted two times with a phenol:chloroform:isoamyl alcohol mix, and afterwards subjected to second sonication for 0 – 15 min. Agarose gel electrophoresis was used to determine the size distribution of DNA subjected to post-extraction ultrasonic fragmentation (Fig. at the top right side). Highly fragmented DNA was evident from the presence of a DNA smear rather than high-molecular weight bands that were eliminated from samples sonicated for 2.5 min or longer. Longer sonication gradually reduced fragment lengths to approximately 150 – 600 bp, and sonication for 15 min further degraded these fragments, as can be seen mostly by the upper part of the smear. Thus, the average DNA fragment size gradually declined with ultrasonication time and the 5 min treatment allowed to obtain the sizes of DNA fragments most suitable for chip array assays. At last, the DNA analyte preparation procedure comprising first 2 min of ultrasonic treatment, DNA extraction (2×), and subsequent 5 min sonication, was established. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Ultrasonic UP100H procesador para el ADN, el ARN y el cizallamiento de la cromatina. (¡Click para agrandar!)HEK293 cells were cultured as described above and fixed with 2 mM disuccinimidyl-glutarate for 45 min at room temperature. Subsequently, the cells were washed twice with PBS. Chromatin was cross-linked for 10 min at room temperature using 1% (v/v) formaldehyde and washed twice with ice-cold PBS. The cross-linking reaction was stopped by incubation with glycine at a final concentration of 0.125 M for 5 min at room temperature. After incubation with trypsin, the cells were scraped from the cell culture dish and washed twice with PBS. The cell pellet was resuspended in lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, and 0.5% (v/v) Nonidet P-40), incubated on ice for 10 min, and homogenized with a Dounce homogenizer. Subsequently, nuclei were pelleted by centrifugation (3500 x g, 5 min, 4 °C) and resuspended in nuclei buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, and 1% (w/v) SDS). Nuclei were disrupted by sonication with three 20-s pulses in a sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un entorno de ciclo de 0,5 y la amplitud del 30%, produciendo fragmentos de ADN genómico con un tamaño mayor de 200 a 1.000 pb. Para CHIP, 50 g de DNA se diluyó 4 veces en tampón de inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, 1,1% (v / v) de Triton X-100, y 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

análisis modificación de las histonas por inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 106 cells were washed twice with PBS and cross-linked on the culture plate for 15 min at room temperature in the presence of 0.5% formaldehyde. Cross-linking reaction was stopped by adding 0.125 M glycine. All subsequent steps were carried out at 48°C. All buffers were pre-chilled and contained protease inhibitors (Complete Mini, Roche). Cells were washed twice with PBS and then scraped. Collected pellets were dissolved in 1 ml lysis buffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) and were sonicated in a cold ethanol bath for 10 cycles at 100% amplitude using a sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). la fragmentación de la cromatina se visualizó en un gel de agarosa al 1%. fragmentos obtenidos estaban en el rango 200-500pb. cromatina soluble se obtuvo por centrifugación de las muestras sonicadas a 14.000 durante 10 minutos a 48 ° C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (1% Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM) y luego se dividió en alícuotas y se almacenó a 80 ° C hasta su uso. (Rodríguez et al. 2008)

DispositivoPotencia [W]TipoVolumen [mL]
VialTweeter200autónomo0,51,5
UP50H50manual o en soporte0,01250
UP100H100manual o en soporte0,01500
UP200Ht200manual o en soporte0,11000
UP200St200en soporte0,11000
UP400St400en soporte5,02000
CupHorn200CupHorn, sonoreactor10200
GDmini2 200Celda de flujo estéril
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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter para la preparación de muestras por ultrasonidos

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Literatura/Referencias

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Procesamiento de las muestras para el análisis basado en la matriz de chips de ADN de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). Las fábricas de células microbianas 7:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA silenciamiento revierte la resistencia a la doxorubicina en células de cáncer de colon humano. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): evaluación Método de extracción de ADN a partir de micelios Fusarium y trigo para down-stream en tiempo real cuantificación PCR y correlación con los niveles de micotoxinas . Revista de Métodos Microbiológicos 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterización del comportamiento de crecimiento de Leishmania tarentolae - un nuevo sistema de expresión para proteínas recombinantes. Revista de Microbiología Básica 47, 2007. 384-393.
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  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-amplia de seguimiento de no metilada de ADN Alu repite en células normales y cancerosas. Nucleic Acids Vol Investigación. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La proteína histidina tríada Hint1 desencadena la apoptosis independiente de su actividad enzimática. El Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. desde 27.356 hasta 27.366.


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