Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante el ADN y el ARN de cizallamiento, las moléculas de ADN se dividen en trozos más pequeños. La fragmentación del ADN / ARN es uno de los pasos importantes de la preparación de la muestra requerida crear las bibliotecas para la secuencia siguiente (NGS).
  • Cisalamiento ultrasónico de ADN utiliza las fuerzas de la cavitación acústica para romper el ADN o el ARN en pedazos de 100 – 5kb pb.
  • El cizallamiento ultrasónico permite una fragmentación precisa del ADN y una adaptación a la longitud de ADN deseada.

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones basadas en ultrasonidos para el ADN, el ARN y el cizallamiento de cromatina. Elija entre un ultrasonido de tipo sonda (p. Ej. UP100H) para sonicación directa utilizando una microtipula, o utilice el VialTweeeter o el cuphorn ultrasónico para la preparación indirecta de ADN de varias muestras simultáneamente. Hielscher ofrece el dispositivo ideal teniendo en cuenta sus necesidades: si tiene 1 o hasta 10 muestras, volúmenes de microlitros a volúmenes de litros – Los procesadores ultrasónicos Hielscher están disponibles para satisfacer sus requerimientos para preparar fragmentos de ADN, ARN y cromatina a la longitud adecuada. La reproducibilidad, la fácil operación y el control preciso permiten una biblioteca fiable para la secuenciación de próxima generación.
En contraste con la fragmentación enzimática del ADN, el cizallamiento ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento mecánicas puras sin añadir ningún producto químico. Mediante el ajuste preciso de los parámetros del proceso, el corte por ultrasonidos produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (plásmido y ADN genómico).
Los ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes o después de una etapa de fragmentación.
Los parámetros de sonicación (potencia, impulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) se pueden controlar de forma segura a través de ajustes de software.

Ventajas:

  • Control preciso
  • Ciclos de sonicación y tiempo precisamente adaptable al tamaño de ADN deseado
  • Fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • control de temperatura
  • rápido
  • Resultados reproducibles
  • Autoclavable
  • Varias soluciones: Tipo de sonda, VialTweeter y Cuphorn

Protocolos para el Cizallamiento Ultrasónico de ADN

Para el Ensayo de Immunoprecipitación de Cromatina

Brevemente, las células se colocaron en placas de 60 mm de diámetro (400.000 por plato) y se transfectaron con ARNsi de RhoA (como se ha descrito); Después de 72 h, se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 minutos a 37 ° C para reticular proteínas a ADN. La reacción de reticulación se inactivó mediante la adición de un décimo volumen de glicina 1,25 mol / L, dando una concentración final de 125 mmol / l. Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, se resuspendieron en tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación [150 mmol / L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 5 mmol / L de EDTA, 50 mmol / L de Tris-HCl )] Que contiene 1 mmol / L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag / ml de aprotinina y 1 Ag / ml de pepstatina A, y se mantuvo en hielo durante 30 min. Luego, los lisados ​​celulares se sonicaron sobre hielo con una Hielscher UP200S Sonicador ultrasónico (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) hasta que se cortaron las cromatinas reticuladas para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pb. Se utilizó una décima parte del lisado entero para cuantificar la cantidad de ADN presente en diferentes muestras y se consideró como “ADN de entrada total”. Los sobrenadantes se incubaron con ADN de esperma de salmón / proteína agarosa-50% de suspensión para reducir el fondo no específico. La inmunoprecipitación se realizó entonces durante la noche a 4ºC con 5 Ag de p65 anti-NF-nB (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes se suplementaron con NaCl 5 mol / L y se calentaron durante la noche a 65 ° C para revertir los enlaces cruzados proteína-ADN. Los inmunocomplejos se trataron adicionalmente con proteinasa K libre de DNasa y RNasa, y el ADN se purificó mediante extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen iNOS humano (cebador p1: 5 beta - GAGGGCTTTCCCA - GAACCAAG - 3; cebador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG - CAGTTCCAG - 3 delta). (Doublier et al., 2008)

EGFP-estudios de expresión

Para los estudios de expresión, se cultivó la cepa recombinante L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (Proteína Fluorescente Verde Mejorada), ssu integrado cromosómica, en los diversos medios como se ha descrito anteriormente y Adicionalmente suplementado con 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugaron (2000 x g, 20 ◦ C, 10 min) y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%. El pellet se resuspendió en tampón (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) y se desintegró mediante sonificación con el procesador ultrasónico UP400S (Aplicación de energía ~ 400 Ws). Los restos celulares se separaron mediante centrifugación (6000 x g, 4ºC, 5 min) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras según el método de Laemmli (1970) con 12,5% de geles de poliacralamida . La expresión de EGFP se examinó en cultivo agitado. (Fritsche et al., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Los análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 se sometieron a ultrasonicación de 0 - 15 min. L indica la Escala de ADN. (Basselet et al., 2008)

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Inmunoprecipitación de cromatina

Disruptor ultrasónico de células UP100H (100W) para lisis, disrupción celular y corte de ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó usando el chip-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados se reticularon con formaldehído al 1% durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y la reacción de fijación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS enfriado con hielo y se rasparon del plato. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos sedimentados se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 min y la cromatina se cortó mediante sonicación, por ejemplo UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) a un 25% de potencia 5 pulsos de 20 segundos cada uno en hielo en fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. La cromatina cortada se centrifugó a continuación y se recogió el sobrenadante. Para inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de anticuerpos Sp1 (Santa Cruz Biotecnología, Santa Cruz, CA, EE.UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) o NF-κB p50 (Abcam) o con conejo IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EE.UU.), como control negativo, durante la noche a 4ºC con rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a perlas magnéticas se recogieron utilizando un soporte magnético, se lavaron extensamente, y los enlaces cruzados proteína / ADN se invirtieron y el ADN se eluyó para análisis de PCR en tiempo real. (Ristola et al., 2009)

Preparación de ADN EHEC para análisis de array de chips

Disposición de lisados ​​celulares y ADN extraídos
Los sedimentos bacterianos suspendidos en PBS hasta la concentración final deseada se trataron con Disruptor ultrasónico UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con una micro-punta MS1 (1 mm de diámetro). La frecuencia de operación fue de 30 kHz y la potencia de salida efectiva fue de 100 W. Durante la operación, las muestras se enfriaron en un baño de hielo-agua, se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que para su manipulación posterior, las muestras se sometieron a un tratamiento térmico (95ºC, 5 min). Los lisados ​​celulares crudos se procesaron con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, se agitó vigorosamente la solución durante 15 sy se centrifugó a 15.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente (RT) alrededor de 22ºC. La fase acuosa superior que contenía el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un nuevo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, se sonicaron muestras para fragmentar el ADN. La etapa de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de la fragmentación en el ADN genómico, las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
(…). Las muestras sonicadas previamente durante 2,5 min fueron sometidas a una etapa de extracción después de tratamiento térmico y centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, y después se sometió a segunda sonicación durante 0 - 15 min. La electroforesis en gel de agarosa se usó para determinar la distribución de tamaño del ADN sometido a fragmentación ultrasónica posterior a la extracción (Fig. En la parte superior derecha). El ADN altamente fragmentado era evidente por la presencia de un frotis de ADN en lugar de bandas de alto peso molecular que se eliminaron de las muestras sonicadas durante 2,5 minutos o más. La sonicación más larga redujo gradualmente las longitudes de los fragmentos hasta aproximadamente 150 - 600 pb, y la sonicación durante 15 min degradó aún más estos fragmentos, como puede verse principalmente en la parte superior del frotis. Por lo tanto, el tamaño medio del fragmento de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonidos y el tratamiento de 5 min permitió obtener los tamaños de fragmentos de ADN más adecuados para ensayos de conjuntos de chips. Por último, se estableció el procedimiento de preparación del analito de ADN que comprende los primeros 2 min de tratamiento con ultrasonidos, extracción de ADN (2 x) y subsecuente ultrasonación de 5 min. (Basselet et al., 2008)

Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP)

Procesador ultrasónico UP100H para el corte de ADN, ARN y cromatina. (¡Click para agrandar!)Las células HEK293 se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se fijaron con disuccinimidil-glutarato 2 mM durante 45 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se reticuló durante 10 minutos a temperatura ambiente usando formaldehído al 1% (v / v) y se lavó dos veces con PBS enfriado con hielo. La reacción de reticulación se detuvo por incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la incubación con tripsina, las células se rasparon del plato de cultivo celular y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (Pipes 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y Nonidet P-40 al 0,5% (v / v)), se incubó en hielo durante 10 min y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación (3500 xg, 5 min, 4ºC) y se resuspendieron en tampón de núcleos (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, EDTA 10 mM y SDS al 1% (p / v)). Los núcleos se interrumpieron por sonicación con tres pulsos de 20 segundos en una Sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un ajuste del ciclo 0,5 y amplitud del 30%, dando fragmentos de ADN genómico con un tamaño de volumen de 200 - 1000 pb. Para ChIP, se diluyó 4 veces 50 g de ADN en tampón de inmunoprecipitación (Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, Triton X-100 al 1,1% (v / v) y 0,01% (p / V) SDS). (Weiske et al., 2006)

Análisis de modificación histona por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 106 Las células se lavaron dos veces con PBS y se reticularon en la placa de cultivo durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de reticulación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M. Todas las etapas subsiguientes se llevaron a cabo a 48 ° C. Todos los tampones fueron pre-refrigerados y contenían inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se rasparon. Los gránulos recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (SDS al 1%, EDTA 5 mM, Tris 50 mM pH 8) y se sonicaron en un baño de etanol frío durante 10 ciclos al 100% de amplitud usando un Sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). La fragmentación de cromatina se visualizó en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos obtenidos estaban en el intervalo de 200-500 pb. La cromatina soluble se obtuvo por centrifugación de las muestras sonicadas a 14.000 g durante 10 min a 48 ° C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, Tris 20 mM pH 8, NaCl 150 mM) luego se dividió en partes alícuotas y se almacenó a 80 ° C hasta su uso. (Rodriguez et al., 2008)

DispositivoPotencia [W]TipoVolumen [mL]
VialTweeter200autónomo0,51,5
UP50H50manual o en soporte0,01250
UP100H100manual o en soporte0,01500
UP200Ht200manual o en soporte0,11000
UP200St200en soporte0,11000
UP400St400en soporte5,02000
CupHorn200CupHorn, sonoreactor10200
GDmini2 200Celda de flujo estéril
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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

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Literatura/Referencias

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Procesamiento de muestras para el análisis basado en matriz de ADN de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). Fábricas de células microbianas 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): Silenciamiento RhoA Reverte la Resistencia a Doxorrubicina en Células de Cáncer de Colon Humano. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Evaluación de métodos de extracción de ADN de Fusarium a partir de micelios y trigo para la cuantificación de la PCR en tiempo real y correlación con los niveles de micotoxinas . Revista de Métodos Microbiológicos 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterización del comportamiento de crecimiento de Leishmania tarentolae - un nuevo sistema de expresión de proteínas recombinantes. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384 - 393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Galés GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulación del gen Neph3 en podocitos - papeles clave de los factores de transcripción NF-κB y Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Seguimiento a todo el genoma de ADN no metilado Se repite en células normales y cancerosas. Nucleic Acids Research Vol. 36, Nº 3, 2008. 770 - 784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La Histidina Triad Protein Hint1 desencadena la apoptosis independiente de su actividad enzimática. El Diario de Química Biológica. Vol. 281, Nº 37, 2006. 27356 - 27366.


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