Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante la fragmentación del ADN y el ARN, las moléculas de ADN se rompen en trozos más pequeños. La fragmentación del ADN/ARN es uno de los pasos importantes de la preparación de muestras necesarios para crear bibliotecas para la secuenciación de nueva generación (NGS).
  • El cizallamiento ultrasónico del ADN utiliza las fuerzas de la cavitación acústica para romper el ADN o el ARN en trozos de 100 – 5kb pb.
  • El cizallamiento ultrasónico permite fragmentar el ADN con precisión y adaptarlo a la longitud deseada.

Cizallamiento del ADN mediante ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones basadas en ultrasonidos para el cizallamiento de ADN, ARN y cromatina. Elija entre un ultrasonicador tipo sonda (p. ej. UP100H) para la sonicación directa utilizando una micropunta, o utilice el VialTweeeter o el cuphorn ultrasónico para la preparación indirecta de ADN de varias muestras simultáneamente. Hielscher le ofrece el aparato ideal en función de sus necesidades: si tiene 1 o hasta 10 muestras, volúmenes desde microlitros hasta litros... – Los procesadores ultrasónicos de Hielscher están disponibles para satisfacer sus necesidades de preparación de fragmentos de ADN, ARN y cromatina con la longitud adecuada. La reproducibilidad, el fácil manejo y el control preciso permiten obtener una biblioteca fiable para la secuenciación de próxima generación.
A diferencia de la fragmentación enzimática del ADN, el cizallamiento por ultrasonidos aplica fuerzas de cizallamiento puramente mecánicas sin añadir ningún producto químico. Mediante el ajuste preciso de los parámetros del proceso, el cizallamiento ultrasónico produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (plásmido y ADN genómico).
Los ácidos nucleicos purificados pueden amplificarse antes o después de una etapa de fragmentación.
Los parámetros de sonicación (potencia, ciclo de impulsos / ráfagas, tiempo y temperatura) pueden controlarse de forma segura mediante ajustes de software.

Ventajas:

  • control preciso
  • ciclos y tiempo de sonicación adaptables con precisión al tamaño de ADN deseado
  • fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • control de temperatura
  • Rápida
  • resultados reproducibles
  • Autoclavable
  • varias soluciones: tipo sonda, VialTweeter y CupHorn

Protocolos para el cizallamiento ultrasónico del ADN

Para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

Brevemente, las células se colocaron en placas de 60 mm de diámetro (400.000 por placa) y se transfectaron con ARNsi RhoA (como se describe); después de 72 h, se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 min a 37°C para entrecruzar las proteínas con el ADN. La reacción de entrecruzamiento se apagó añadiendo una décima parte del volumen de 1,25 mol/L de glicina, lo que dio una concentración final de 125 mmol/L. Las células se lavaron dos veces con hielo y se lavaron con agua. Las células se lavaron dos veces con PBS helado, se resuspendieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] que contenía 1 mmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag/mL de aprotinina y 1 Ag/mL de pepstatina A, y se mantuvieron en hielo durante 30 min. A continuación, los lisados celulares se sonicaron en hielo con un Hielscher UP200S sonicador de ultrasonidos (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hasta que las cromatinas reticuladas se cizallaron para producir fragmentos de ADN de entre 200 y 1.000 pb. Se utilizó una décima parte de todo el lisado para cuantificar la cantidad de ADN presente en las distintas muestras y se consideró como “ADN total de entrada”. Los sobrenadantes se incubaron con ADN de esperma de salmón/agarosa proteica al 50% para reducir el fondo inespecífico. La inmunoprecipitación se realizó entonces durante la noche a 4°C con 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) o sin anticuerpo (control negativo). Estos sobrenadantes se suplementaron con 5 mol/L NaCl y se calentaron durante la noche a 65°C para revertir los enlaces cruzados proteína-ADN. Los inmunocomplejos se trataron posteriormente con proteinasa K libre de DNasa y RNasa, y el ADN se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen de la iNOS humana (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudios de expresión de EGFP

Para los estudios de expresión, la cepa recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromosómicamente ssu integrado, se cultivó en los distintos medios descritos anteriormente y se suplementó adicionalmente con 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugaron (2000 × g, 20°C, 10 min) y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%. El pellet se resuspendió en tampón (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) y se desintegró por sonificación con el procesador ultrasónico UP400S (aplicación de energía ∼ 400 Ws). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (6000 × g, 4°C, 5 min) y se analizaron por electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico - poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones reductoras según el método de Laemmli (1970) con geles de poliacralamida al 12,5%. La expresión de EGFP se examinó en cultivo agitado. (Fritsche et al. 2007)

La fragmentación ultrasónica del ADN se utiliza con frecuencia como paso de preparación de muestras en la secuenciación de próxima generación (NGS)

Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min de ultrasonidos. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

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inmunoprecipitación de cromatina

Disruptor celular ultrasónico UP100H (100W) para lisis, disrupción celular y cizallamiento de ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina se realizó con el método ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, podocitos humanos diferenciados se reticularon con formaldehído al 1% durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS helado y la reacción de fijación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron de nuevo con PBS helado y se rasparon de la placa. Se centrifugaron las células y se resuspendieron en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos sedimentados se resuspendieron en el tampón de cizallamiento, se incubaron en hielo durante 30 minutos y la cromatina se cizalló por sonicación, p.ej. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) al 25% de potencia 5 pulsos de 20 seg cada uno en hielo en fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. A continuación, se centrifugó la cromatina cizallada y se recogió el sobrenadante. Para las inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de anticuerpos contra Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o NF-κB p50 (Abcam) o con IgG de conejo (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EE.UU.), como control negativo, durante la noche a 4 °C con rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a las perlas magnéticas se recogieron utilizando un soporte magnético, se lavaron abundantemente y se invirtieron los enlaces cruzados proteína/ADN y se eluyó el ADN para el análisis de PCR en tiempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparación del ADN de EHEC para el análisis mediante chip array

Disposición de lisados celulares y ADN extraído
Los pellets bacterianos suspendidos en PBS hasta la concentración final deseada se trataron con disruptor de ultrasonidos UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con una micropunta MS1 (1 mm de diámetro). La frecuencia de funcionamiento era de 30 kHz y la potencia de salida efectiva era de 100 W. Durante la operación, las muestras se enfriaban en un baño de agua helada, se mezclaban y se centrifugaban. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que para su posterior manipulación, las muestras se sometieron a un tratamiento térmico (95°C, 5 min). Los lisados celulares crudos se procesaron con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, se agitó enérgicamente la solución en un vórtex durante 15 s y se centrifugó a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (TA) en torno a 22°C. La fase acuosa superior que contenía el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un nuevo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, las muestras se sometieron a sonicación para fragmentar el ADN. El paso de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de la fragmentación en el ADN genómico, las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
(…) Las muestras sonicadas previamente durante 2,5 min se sometieron a una etapa de extracción tras tratamiento térmico y centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, y posteriormente se sometió a una segunda sonicación durante 0 - 15 min. Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para determinar la distribución de tamaños del ADN sometido a fragmentación ultrasónica tras la extracción (Fig. arriba a la derecha). El ADN altamente fragmentado se hizo evidente por la presencia de una mancha de ADN en lugar de bandas de alto peso molecular que se eliminaron de las muestras sonicadas durante 2,5 min o más. Una sonicación más prolongada redujo gradualmente la longitud de los fragmentos hasta aproximadamente 150 - 600 pb, y la sonicación durante 15 min degradó aún más estos fragmentos, como puede verse sobre todo en la parte superior del frotis. Así, el tamaño medio de los fragmentos de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonicación y el tratamiento de 5 min permitió obtener los tamaños de fragmentos de ADN más adecuados para los ensayos de chip array. Por último, se estableció el procedimiento de preparación del analito de ADN que comprende los primeros 2 min de tratamiento ultrasónico, la extracción del ADN (2×) y la posterior sonicación de 5 min. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)

Procesador ultrasónico UP100H para el cizallamiento de ADN, ARN y cromatina. (¡Haga clic para ampliar!)Las células HEK293 se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se fijaron con disuccinimidil-glutarato 2 mM durante 45 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se reticuló durante 10 minutos a temperatura ambiente con formaldehído al 1% (v/v) y se lavó dos veces con PBS helado. La reacción de reticulación se detuvo mediante incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente. Tras la incubación con tripsina, se rasparon las células de la placa de cultivo celular y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (Pipas 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y Nonidet P-40 0,5% (v/v)), se incubó en hielo durante 10 min y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se separaron por centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 °C) y se resuspendieron en tampón de núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA y 1% (p/v) SDS). Los núcleos se disgregaron mediante sonicación con tres pulsos de 20 s en un Sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) con un ajuste de ciclo 0,5 y amplitud del 30%, obteniéndose fragmentos de ADN genómico con un tamaño global de 200 - 1000 pb. Para el ChIP, 50 g de ADN se diluyeron 4 veces en tampón de inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 y 0,01% (p/v) SDS) (Weiske et al. 2006).

Análisis de modificación de histonas mediante inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 106 Las células se lavaron dos veces con PBS y se reticularon en la placa de cultivo durante 15 min a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de reticulación se detuvo añadiendo glicina 0,125 M. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 48°C. Todos los tampones se enfriaron previamente y contenían inhibidores de la proteasa (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se rasparon. Los pellets recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) y se sonicaron en un baño de etanol frío durante 10 ciclos al 100% de amplitud utilizando un Sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). La fragmentación de la cromatina se visualizó en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos obtenidos estaban en el rango 200-500pb. La cromatina soluble se obtuvo centrifugando las muestras sonicadas a 14.000g durante 10 min a 48°C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), se alicuotó y se almacenó a 80°C hasta su uso. (Rodríguez et al. 2008)

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
UIP400MTP 400 para microplacas de 6 3465 pozos
VialTweeter 200 autónomo 0,5 1,5
UP50H 50 manual o en soporte 0,01 250
UP100H 100 manual o en soporte 0,01 500
UP200Ht 200 manual o en soporte 0,1 1000
UP200St 200 en soporte 0,1 1000
UP400St 400 en soporte 5,0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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El VialTweeter de Hielscher es ideal para la preparación simultánea de múltiples muestras.

VialTweeter para la preparación de muestras por ultrasonidos, por ejemplo fragmentación del plásmido (ADNp).

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Este vídeo del homogeneizador ultrasónico UP100H muestra su diseño compacto y sus versátiles aplicaciones, como la dispersión, homogeneización, mezcla, desgasificación o emulsificación.

Ultrasonicator UP100H (100 vatios) - Homogeneizador ultrasónico compacto

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El cizallamiento ultrasónico del ADN se basa en la cavitación acústica y sus fuerzas de cizallamiento hidrodinámicas

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