Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

  • Durante el corte del ADN y el ARN, las moléculas de ADN se rompen en pedazos más pequeños. La fragmentación de ADN/ARN es uno de los pasos importantes en la preparación de muestras que se requieren para crear bibliotecas para la secuenciación de la próxima generación (NGS).
  • La cizalladura ultrasónica del ADN utiliza las fuerzas de la cavitación acústica para romper el ADN o el ARN en trozos de 100 – 5kb bp.
  • El cizallamiento ultrasónico permite la fragmentación precisa del ADN y la adaptación a la longitud deseada del ADN.

Fragmentación de ADN por ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones basadas en ultrasonidos para el corte de ADN, ARN y cromatina. Elija entre un ultrasonido tipo sonda (por ejemplo, UP100H) para la sonicación directa utilizando un microtip, o utilice el VialTweeeter o el cuphorn ultrasónico para la preparación indirecta de ADN de varias muestras simultáneamente. Hielscher le ofrece el dispositivo ideal para sus necesidades: si tiene 1 o hasta 10 muestras, volúmenes desde microlitros hasta litros. – Los procesadores ultrasónicos de Hielscher están disponibles para satisfacer sus necesidades de preparación de fragmentos de ADN, ARN y cromatina con la longitud adecuada. La reproducibilidad, la facilidad de uso y el control preciso permiten una biblioteca fiable para la secuenciación de próxima generación.
A diferencia de la fragmentación enzimática del ADN, el cizallamiento ultrasónico aplica fuerzas de cizallamiento puramente mecánicas sin añadir ningún producto químico. Mediante el ajuste preciso de los parámetros de proceso, el cizallamiento ultrasónico produce fragmentos de ADN de alto peso molecular (plásmido y ADN genómico).
Los ácidos nucleicos purificados pueden ser amplificados antes o después de un paso de fragmentación.
Los parámetros de sonicación (potencia, ciclo de pulso / ráfagas, tiempo y temperatura) pueden controlarse de forma segura mediante ajustes de software.

Ventajas:

  • control preciso
  • ciclos de sonicación y tiempo adaptables con precisión al tamaño de ADN deseado
  • fragmentos de ADN de alto peso molecular
  • regulación de temperatura
  • Rápida
  • resultados reproducibles
  • Autoclavable
  • varias soluciones: Tipo de sonda, VialTweeter y CupHorn

Protocolos para la cizalladura ultrasónica del ADN

Para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

Brevemente, las células fueron chapadas en platos de 60 mm de diámetro (400.000 por plato) y transfectadas con RhoA siRNA (como se describe); después de 72 h, fueron incubadas con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 min a 37°C para entrecruzar las proteínas con el ADN. La reacción de reticulación se amortiguó mediante la adición de una décima parte del volumen de glicina de 1.25 mol/L, dando como resultado una concentración final de 125 mmol/L. Las células se lavaron dos veces con PBS frío, se resuspendieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación[150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo de 1 mmol/L, 1 Ag/mL de aprotinina, 1 Ag/mL y 1 Ag/mL de pepstatina A, y se mantuvieron congeladas durante 30 minutos. Luego, los lisados celulares se sonatearon en el hielo con un Hielscher UP200S ultrasonido (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) hasta que las cromatinas reticuladas fueron cortadas para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pb. Una décima parte del lisado entero se utilizó para cuantificar la cantidad de ADN presente en diferentes muestras y se consideró como “entrada total ADN”. Los sobrenadantes se incubaron con lodos de ADN de esperma de salmón/agarración de proteínas al 50% para reducir los antecedentes no específicos. La inmunoprecipitación se realizó durante la noche a 4°C con 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) o sin anticuerpos (control negativo). Estos sobrenadantes se complementaron con NaCl 5 mol/L y se calentaron durante la noche a 65°C para revertir los enlaces cruzados de proteína-ADN. Los inmunocomplejos fueron tratados con proteinasa K libre de DNasa y RNasa, y el ADN fue purificado por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen humano iNOS (p1 cebador: 5¶-GAGGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 cebador: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudios de expresión EGFP

Para estudios de expresión, la cepa recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemania) con el gen para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu cromosómico integrado, fue cultivada en los diversos medios como se describió anteriormente y adicionalmente complementada con 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemania). Durante el cultivo, se tomaron muestras de 1 ml, se centrifugaron (2000 × g, 20°C, 10 min) y se lavaron con una solución de NaCl al 0,9%. El pellet fue resuspendido en tampón (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) y desintegrado por sonificación con el procesador ultrasónico. UP400S (aplicación de energía ∼ 400 Ws). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (6000 × g, 4°C, 5 min) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) con dodecilo sódico en condiciones reductoras, según el método de Laemmli (1970) con geles de poliacralamida al 12,5%. La expresión de EGFP fue examinada en un cultivo agitado. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometidos a ultrasonidos de 0 - 15 min. L indica la escala de ADN. (Basselet et al. 2008)

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Inmunoprecipitación de la cromatina

Interruptor celular ultrasónico UP100H (100W) para lisis, disrupción celular y cizallamiento del ADN.El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó utilizando el ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) según las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, los podocitos humanos diferenciados fueron entrecruzados con formaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS frío y la reacción de fijación se detuvo añadiendo 0,125 M de glicina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaban de nuevo con PBS frío y frío y se raspaban del plato. Las células fueron peletizadas por centrifugación y resuspendidas en el tampón de lisis. Después de la centrifugación, los núcleos peletizados fueron resuspendidos en el tampón de cizallamiento, incubados en hielo durante 30 minutos y la cromatina fue cizallada por sonicación, p.ej. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) al 25% de potencia 5 impulsos de 20 segundos cada uno sobre hielo en fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. Luego se centrifugó la cromatina cortada y se recogió el sobrenadante. Para inmunoprecipitaciones, se incubó 60 μl de cromatina con 1 μg de Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) o NF-κB p50 (Abcam) anticuerpos o con IgG de conejo (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EUA), como control negativo, durante la noche a 4°C con rotación suave. Los inmunocomplejos unidos a las perlas magnéticas se recogieron utilizando un soporte magnético, se lavaron extensamente, y los enlaces cruzados de proteína/ADN se invirtieron y el ADN se eluyó para el análisis de PCR en tiempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparación de ADN EHEC para el análisis de matrices de chips

Disposición de los lisados celulares y de los ADN extraídos
Los gránulos bacterianos suspendidos en PBS a la concentración final deseada fueron tratados con disruptor de ultrasonido UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado con un microtip MS1 (1mm de diámetro). La frecuencia de funcionamiento era de 30 kHz y la potencia de salida efectiva era de 100 W. Durante la operación, las muestras se enfriaron en un baño de hielo y agua, se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo, mientras que para su posterior manipulación se sometieron a un tratamiento térmico (95°C, 5 min). Los lisados celulares crudos fueron procesados con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se añadió un volumen igual de esta mezcla a la muestra de lisado, la solución se agitó enérgicamente durante 15 s y se centrifugó a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (RT) alrededor de 22°C. La fase acuosa superior que contiene el ADN genómico se separó cuidadosamente y se recogió en un nuevo tubo estéril de Eppendorf.
Posteriormente, se tomaron muestras para fragmentar el ADN. El paso de sonicación se realizó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para evaluar los efectos de la fragmentación en el ADN genómico, se analizaron muestras mediante electroforesis en gel de agarosa.
(…) Las muestras previamente sonadas durante 2,5 minutos fueron sometidas a un paso de extracción después del tratamiento térmico y la centrifugación. El ADN liberado se extrajo dos veces con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, y luego se sometió a una segunda sonicación durante 0 - 15 min. La electroforesis en gel de agarosa se utilizó para determinar la distribución de tamaño del ADN sujeto a la fragmentación ultrasónica posterior a la extracción (Fig. en la parte superior derecha). El ADN altamente fragmentado fue evidente por la presencia de un frotis de ADN en lugar de bandas de alto peso molecular que fueron eliminadas de las muestras sometidas a ultrasonido durante 2,5 minutos o más. La sonicación más larga redujo gradualmente la longitud de los fragmentos a aproximadamente 150 - 600 pb, y la sonicación durante 15 minutos degradó aún más estos fragmentos, como se puede ver principalmente en la parte superior del frotis. Así, el tamaño promedio de los fragmentos de ADN disminuyó gradualmente con el tiempo de ultrasonido y el tratamiento de 5 minutos permitió obtener los tamaños de fragmentos de ADN más adecuados para los ensayos de matriz de chips. Finalmente, se estableció el procedimiento de preparación del analito de ADN, que comprende los dos primeros minutos de tratamiento ultrasónico, la extracción de ADN (2×) y la subsiguiente minerosión. (Basselet et al. 2008)

Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)

Procesador ultrasónico UP100H para el corte de ADN, ARN y cromatina. (Haga clic para ampliar!)Las células HEK293 se cultivaron como se describió anteriormente y se fijaron con 2 mM de disuccinimidil-glutarato durante 45 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS. La cromatina se reticuló durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando formaldehído al 1% (v/v) y se lavó dos veces con PBS frío. La reacción de reticulación se detuvo mediante incubación con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación con tripsina, las células fueron raspadas del plato de cultivo celular y lavadas dos veces con PBS. El sedimento celular fue resuspendido en tampón de lisis (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, y 0.5% (v/v) Nonidet P-40), incubado en hielo durante 10 min, y homogeneizado con un homogeneizador Dounce. Posteriormente, los núcleos se peletizaron por centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 °C) y se resuspendieron en tampón de núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, y 1% (p/v) SDS). Los núcleos fueron interrumpidos por sonicación con tres pulsos de 20-s en un Sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) en un ciclo de 0,5 y una amplitud del 30%, produciendo fragmentos de ADN genómico con un tamaño de 200 - 1000 pb. Para el ChIP, 50 g de ADN se diluyeron 4 veces en tampón de inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 y 0,01% (p/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análisis de modificación de histonas por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 106 se lavaron dos veces con PBS y se reticularon en la placa de cultivo durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de formaldehído al 0,5%. La reacción de reticulación se detuvo añadiendo 0,125 M de glicina. Todos los pasos siguientes se realizaron a 48°C. Todos los tampones estaban preenfriados y contenían inhibidores de la proteasa (Complete Mini, Roche). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se rasparon. Los gránulos recogidos se disolvieron en 1 ml de tampón de lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) y se sometieron a un baño de etanol en frío durante 10 ciclos a una amplitud del 100% utilizando una Sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). La fragmentación de la cromatina se visualizó en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos obtenidos estaban en el rango de 200-500pb. La cromatina soluble se obtuvo centrifugando las muestras sonorizadas a 14.000 g durante 10 minutos a 48°C. La fracción soluble se diluyó 1/10 en tampón de dilución (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), se alicuotó y se almacenó a 80°C hasta su uso. (Rodríguez et al. 2008)

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
VialTweeter 200 autónomo 0,5 1,5
UP50H 50 manual o en soporte 0,01 250
UP100H 100 manual o en soporte 0,01 500
UP200Ht 200 manual o en soporte 0,1 1000
UP200St 200 en soporte 0,1 1000
UP400St 400 en soporte 5,0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

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Literatura/Referencias

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Procesamiento de muestras para el análisis de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) a partir de una matriz de chips de ADN. Fábricas de células microbianas 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): El silenciamiento RhoA revierte la resistencia a la doxorrubicina en las células cancerosas del colon humano. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Evaluación del método de extracción de ADN de Fusarium de micelios y trigo para la cuantificación en tiempo real de la PCR y su correlación con los niveles de micotoxinas. Journal of Microbiological Methods 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Caracterización del comportamiento de crecimiento de Leishmania tarentolae - un nuevo sistema de expresión para proteínas recombinantes. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulación del gen Neph3 en podocitos - papeles clave de los factores de transcripción NF-κB y Sp1. BMC Biología Molecular 10:83, 2009.
  • Rodríguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Muñoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Seguimiento a nivel genómico de las repeticiones de ADN Alu no metilado en células normales y cancerosas. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): La proteína Histidine Triad Hint1 desencadena la apoptosis independientemente de su actividad enzimática. La Revista de Química Biológica. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.


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