Preparación ultrasónica de muestras para ensayos ELISA

Los ensayos como ELISA se utilizan ampliamente para el diagnóstico in vitro, la detección de proteínas relacionadas con enfermedades y el control de calidad (p. ej., la vigilancia de alérgenos alimentarios). La preparación ultrasónica de muestras es una técnica rápida, fiable y reproducible para lisar células y aislar proteínas intracelulares, ADN, ARN y orgánulos. Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones ultrasónicas para preparar cómodamente muestras individuales, múltiples viales, placas de microtitulación y placas de 96 pocillos.

ELISA – Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas

ELISA significa ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas y es una técnica de análisis bioquímico ampliamente utilizada que pertenece a la categoría de los ensayos de unión a ligandos. En ELISA, se añade una muestra líquida a una fase sólida estacionaria con propiedades de unión específicas. Normalmente, la fase sólida estacionaria se aplica como recubrimiento de una placa de pocillos o placa ELISA. A continuación, se añaden secuencialmente diversos reactivos líquidos, se realizan incubaciones y lavados, de modo que finalmente se produce un cambio óptico (p. ej., la aparición de color debido al producto de una reacción enzimática) en el líquido final del pocillo. El cambio óptico permite medir la cantidad del analito mediante una denominada «lectura» cuantitativa. Para esta lectura cuantitativa, se utiliza un espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro para detectar y medir la intensidad de la luz transmitida. La sensibilidad de detección depende de la amplificación de la señal durante las reacciones analíticas. Dado que las reacciones enzimáticas son procesos de amplificación bien estudiados y fiables, se utilizan enzimas para generar la señal. Las enzimas se unen a los reactivos de detección en proporciones fijas para permitir una cuantificación precisa, lo que también explica la denominación «ligado a enzimas» del ensayo por inmunoadsorción.
Como los ensayos ELISA se realizan en placas de microtitulación / placas de 96 pocillos, ELISA se conoce como una técnica de ensayo basada en placas y se utiliza, por ejemplo, en el diagnóstico clínico in vitro, la investigación y el desarrollo de fármacos, entre otros ámbitos, para detectar y cuantificar anticuerpos, péptidos, proteínas y hormonas.
La técnica ELISA se utiliza con frecuencia como herramienta de diagnóstico en medicina, biotecnología y fitopatología, y también constituye una importante medida de control de calidad en múltiples industrias.

Preparación ultrasónica de muestras antes de ELISA

Antes de realizar el ensayo ELISA, las muestras requieren etapas de preparación como la lisis celular y la extracción de proteínas intracelulares, ADN, ARN, etc. La ventaja de la lisis celular y el aislamiento de proteínas mediante ultrasonidos reside en su elevada eficiencia, fiabilidad y reproducibilidad. Todos estos factores son importantes para obtener diagnósticos y resultados de investigación de alta calidad

Protocolo de lisis celular ultrasónica previa a ELISA

• Para cultivos celulares: Antes de la lisis celular ultrasónica, centrifugue las células durante 5 mins a 270 x g en una microcentrífuga. Retire el sobrenadante por aspiración y resuspenda las células en 30 – 100 μL de tampón RIPA. A continuación, incube el sedimento celular sobre hielo durante 30 min.
• La muestra celular ya está lista para la lisis ultrasónica:
  Utilice un ultrasonicador de sonda (p. ej., UP200Ht con la sonda S26d2) o un equipo ultrasónico para múltiples muestras (p. ej., VialTweeter para la sonicación simultánea de hasta 10 viales o el UIP400MPT para placas de microtitulación / placas de 96 pocillos), según la cantidad de muestras que necesite preparar.
  Para la sonicación de una sola muestra con un equipo de sonda, coloque las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
• Configure previamente la duración del tratamiento ultrasónico, el aporte total de energía, el modo de ciclos y/o los límites de temperatura en el menú digital del ultrasonicador. Esto garantiza una sonicación muy fiable y repetibilidad.
• Introduzca el sonotrodo y encienda el equipo ultrasónico. Desplace suavemente la micropunta de la sonda ultrasónica por la muestra para sonicarla de manera uniforme.
  En la mayoría de las células, la lisis ultrasónica se completará tras 2 – 4 ciclos de sonicación de 10 sec.
• Tras la sonicación, retire el sonotrodo de la muestra. Las muestras deben incubarse sobre hielo durante 5 min. A continuación, centrifugue a 10.000 x g durante 20 min para sedimentar los restos celulares. Transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de microcentrífuga. Etiquete los analitos y consérvelos a -20 °C.
• El sonotrodo ultrasónico puede limpiarse frotándolo adecuadamente con alcohol o mediante sonicación en un vaso de precipitados lleno de alcohol, p. ej., etanol al 70%. Todas las sondas ultrasónicas fabricadas en titanio pueden esterilizarse en autoclave.

• Enjuague el tejido con PBS enfriado en hielo (0,01M, pH=7,4) para eliminar por completo el exceso de sangre hemolizada.
• Pese el tejido (riñón, corazón, pulmón, bazo, etc.) y macérelo en pequeños fragmentos, que se homogeneizan en PBS. El volumen de PBS necesario depende del peso del tejido. Como regla general, 1 g de tejido requiere aproximadamente 9 mL de PBS. Se recomienda añadir un inhibidor de proteasas al PBS. (Como alternativa, puede utilizarse RIPA o un tampón de lisis hipotónico que contenga una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas.)
• Según el tamaño del tejido, un breve tratamiento en vórtex (aprox. 1–2 min. en pulsos de 15 sec.) puede resultar útil como pretratamiento.
• Monte una micropunta, p. ej., S26d2, en el ultrasonicador. Coloque el tubo de muestra que contiene el tejido en un baño de hielo.
• Sonique la muestra con el ultrasonicador, p. ej., UP200St (80% de amplitud), durante 1 min. en modo pulsado (15sec de funcionamiento, 15sec de pausa). Mantenga la muestra en el baño de hielo.
• A continuación, los homogeneizados se centrifugan para obtener fracciones específicas (citosólicas, nucleares, mitocondriales o lisosomales) con el fin de enriquecer la proteína para su análisis. Al centrifugar la muestra durante 5 minutos a 5000×g, se recupera el sobrenadante.

Control fiable de la temperatura durante la sonicación

La temperatura es un factor crucial que influye en el proceso y resulta especialmente importante para el tratamiento de muestras biológicas, p. ej., para evitar la degradación térmica de las proteínas. Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse adecuadamente al utilizar los equipos de Hielscher Ultrasonics. Le presentamos diversas opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras durante su preparación preanalítica con un ultrasonicador de sonda o con VialTweeter.

1. Supervisión de la temperatura de la muestra: todos los procesadores ultrasónicos digitales de Hielscher están equipados con software inteligente y un sensor de temperatura conectable. Conecte el sensor de temperatura al equipo ultrasónico (p. ej., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicador de placas multipocillo UIP400MTP) e introduzca la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. Mediante la pantalla táctil digital a color, puede establecer en el menú del procesador ultrasónico un intervalo de temperatura específico para la sonicación de su muestra. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y permanecerá en pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda al valor inferior del intervalo de temperatura ∆ establecido. A continuación, la sonicación se reanudará automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
2. En la unidad ultrasónica para múltiples muestras VialTweeter, el bloque de titanio que sostiene los tubos de muestra puede enfriarse previamente. Coloque el bloque VialTweeter (¡solo el sonotrodo, sin el transductor!) en el frigorífico o el congelador; enfriar previamente el bloque de titanio ayuda a retrasar el aumento de temperatura de la muestra. Si es posible, también puede enfriarse previamente la propia muestra.
3. Utilice un baño de hielo o hielo seco para refrigerar durante la sonicación. Coloque el tubo o los tubos de muestra en un baño de hielo durante la sonicación. Para VialTweeter, utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque VialTweeter sobre el hielo seco para que el calor se disipe rápidamente.

Clientes de todo el mundo utilizan los ultrasonicadores de sonda de Hielscher, así como las unidades de sonicación para múltiples muestras VialTweeter y UIP400MTP, en su trabajo diario de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura de los procesadores Hielscher, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. ¡La preparación ultrasónica de muestras con las soluciones ultrasónicas de Hielscher proporciona resultados muy fiables y reproducibles!
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