Tecnología de ultrasonido de Hielscher

Preparación de muestras ultrasónicas para ensayos ELISA

Los ensayos como el ELISA se utilizan ampliamente para el diagnóstico in vitro, la detección de proteínas relacionadas con enfermedades y el control de calidad (por ejemplo, la vigilancia de los alérgenos alimentarios). La preparación de muestras por ultrasonido es una técnica rápida, fiable y reproducible para lisar células y aislar proteínas intracelulares, ADN, ARN y orgánulos. Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones ultrasónicas para la preparación conveniente de muestras individuales, viales múltiples, así como para placas microtiter y placas de 96 pocillos.

ELISA – Ensayo de inmunoabsorción ligado a las enzimas

ELISA significa ensayo inmunoenzimático y es una técnica de análisis bioquímico muy utilizada en la categoría de los ensayos de unión de ligandos. En el ELISA, se añade una muestra líquida a una fase sólida estacionaria con propiedades de unión especiales. Normalmente, la fase sólida estacionaria se aplica como recubrimiento a una placa de pozo o placa ELISA. Luego, se añaden secuencialmente varios reactivos líquidos, se incuban y se lavan, de modo que finalmente se produce un cambio óptico (por ejemplo, desarrollo de color por el producto de una reacción enzimática) en el líquido final del pozo. El cambio óptico permite medir la cantidad del analito por medio de un llamado “...leyendo". Para la lectura cuantitativa, se utiliza un espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro para detectar y medir la intensidad de la luz transmitida. La sensibilidad de la detección se ve influida por la amplificación de la señal durante las reacciones analíticas. Dado que las reacciones enzimáticas están bien investigadas y los procesos de amplificación son fiables, se utilizan enzimas para crear la señal. Las enzimas están vinculadas a los reactivos de detección en proporciones fijas para permitir una cuantificación precisa, lo que explica también el nombre de ensayo inmunoenzimático "vinculado a las enzimas".
Como los ensayos ELISA se realizan en placas microtiter / placas de 96 pocillos, se conoce como técnica de ensayo en placa y se utiliza, por ejemplo, en el diagnóstico clínico in vitro, la investigación, el desarrollo de medicamentos, etc. para detectar y cuantificar anticuerpos, péptidos, proteínas y hormonas.
La técnica ELISA se utiliza con frecuencia como herramienta de diagnóstico en medicina, biotecnología, patología vegetal y también es una importante medida de control de calidad en múltiples industrias.

Equipo completo del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter con el procesador ultrasónico UP200St

La unidad de preparación de muestras ultrasónicas VialTweeter se utiliza para la lisis celular y la extracción de proteínas antes de los ensayos ELISA

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Preparación de la muestra ultrasónica antes de la prueba ELISA

Antes de que se pueda realizar el ensayo ELISA, las muestras requieren pasos de preparación como la lisis celular y la extracción de proteínas intracelulares, ADN, ARN, etc. La ventaja de la lisis celular y el aislamiento de proteínas por ultrasonidos es su alta eficiencia, fiabilidad y reproducibilidad. Todos estos factores son importantes para obtener diagnósticos y resultados de investigación de alta calidad

Ventajas de la lisis ultrasónica antes del ELISA

  • Tratamiento homogéneo de las muestras
  • Lisis completa
  • Extracción completa de proteínas (por ejemplo, anticuerpos, ADN)
  • Adaptación óptima al tipo de célula
  • Para cualquier tamaño de muestra
  • reproducibles
  • Temperatura controlada
  • Protocolo automático de datos en la tarjeta SD

Protocolo para la Lisis Celular Ultrasónica Pre-ELISA

Sonda de tipo insonifier UP200St para la lisis

  • Para cultivos celulares: Antes de la lisis celular ultrasónica, centrifuga las células durante 5 minutos a 270 x g en una microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender las células en 30 - 100 μL de tampón RIPA. Luego, incubar el pellet de células en hielo durante 30 min.
  • Ahora, la muestra de células está lista para la lisis ultrasónica:
    Usar un ultrasonido de tipo sonda (por ejemplo. UP200Ht con sonda S26d2) o un dispositivo ultrasónico multimuestra (por ejemplo, el VialTweeter para la sonicación simultánea de hasta 10 viales o el UIP400MPT para placas microtiter / placas de 96 pocillos), dependiendo de la cantidad de muestras que necesite preparar.
    Para la sonicación tipo sonda de una sola muestra, coloque las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  • Preestablezca la duración del ultrasonido, la entrada de energía total, el modo de ciclo y/o los límites de temperatura en el menú digital del ultrasonido. Esto asegura una sonicación y repetibilidad altamente fiable.
  • Inserte el sonotrodo y encienda el dispositivo ultrasónico. Mueva suavemente la micro punta de la sonda ultrasónica a través de la muestra para sonicar la muestra de manera uniforme.
    Para la mayoría de las células, la lisis ultrasónica se completará después de 2 a 4 ciclos de 10 segundos de sonicación.
  • Después de la sonicación, retire el sonotrodo de la muestra. Las muestras deben ser incubadas en hielo durante 5 minutos. Luego, centrifugarlas a 10.000 x g durante 20 min para pelear los restos. Transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de microcentrífuga. Etiquete los analitos y guárdelos a -20°C.
  • El sonotrodo ultrasónico puede limpiarse limpiándolo adecuadamente con alcohol o sonicarlo en un vaso de precipitados lleno de alcohol, por ejemplo, con un 70% de etanol. Todas las sondas ultrasónicas hechas de titanio son autoclavables.

Para los Homogeneizados de Tejidos:

  • Enjuague el tejido con PBS frío (0.01M, pH=7.4) para remover el exceso de sangre de la hemólisis a fondo.
  • Pesar el tejido (riñón, corazón, pulmón, bazo, etc.) y macerarlo en pequeños trozos, que se homogeneizan en PBS. El volumen de PBS requerido está relacionado con el peso del tejido. Como regla general, 1g de tejido requiere aproximadamente 9mL de PBS. Se recomienda añadir algún inhibidor de la proteasa al PBS. (RIPA o tampón de lisis hipotónica que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa puede ser usado alternativamente).
  • Dependiendo del tamaño del tejido, un tratamiento corto del vórtice (aprox. 1-2 min. en pulsos de 15 seg.) puede ser útil para pretratar el tejido.
  • Monta una micro punta, por ejemplo S26d2, en tu ultrasonido. Coloque el tubo de muestra con el tejido en un baño de hielo.
  • Sonique la muestra con su ultrasonido, por ejemplo, UP200St (80% de amplitud) durante 1 min. en modo de pulso (15seg. encendido, 15seg. pausa). Mantenga la muestra en el baño de hielo.
  • Los homogeneizados son luego centrifugados para obtener grupos específicos (citosólico, nuclear, mitocondrial o lisosómico) con el fin de enriquecer la proteína para su análisis. Centrifugando la muestra durante 5 minutos a 5000×g, se recupera el sobrenadante.
El sonotrodo MTP-24-8-96 tiene ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pozos de las placas microtiter.

El sonotrodo MTP-24-8-96 tiene ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pozos de las placas microtiter.

Control fiable de la temperatura durante la sonicación

La temperatura es un factor crucial que influye en el proceso y que es especialmente importante para el tratamiento de las muestras biológicas, por ejemplo, para evitar la degradación térmica de las proteínas. Como todas las técnicas de preparación de muestras mecánicas, la sonicación crea calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse bien cuando se utilizan los dispositivos de ultrasonidos de Hielscher. Le presentamos varias opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con un ultrasonido de tipo sonda o el VialTweeter de forma preanalítica.

  1. Monitorización de la temperatura de la muestra: Todos los procesadores ultrasónicos digitales de Hielscher están equipados con un software inteligente y un sensor de temperatura enchufable. Enchufa el sensor de temperatura en el dispositivo ultrasónico (por ejemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) e inserte la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. A través de la pantalla táctil digital de color, puede establecer en el menú del procesador de ultrasonidos un rango de temperatura específico para su sonicación de la muestra. El ultrasonido se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y hará una pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda al valor más bajo de la temperatura establecida ∆. Entonces la sonicación se inicia automáticamente de nuevo. Esta característica inteligente evita la degradación inducida por el calor.
  2. En cuanto a la unidad ultrasónica de muestras múltiples VialTweeter, el bloque de titanio, que contiene los tubos de muestra, puede ser preenfriado. Poner el bloque del VialTweeter (¡sólo el sonotrodo sin transductor!) en la nevera o el congelador para preenfriar el bloque de titanio ayuda a posponer el aumento de temperatura de la muestra. Si es posible, la muestra misma puede ser preenfriada también.
  3. Use un baño de hielo o hielo seco para enfriar durante la sonicación. Coloque su(s) tubo(s) de muestra durante la sonicación en un baño de hielo. Para el VialTweeter, utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo seco para que el calor se pueda disipar rápidamente.

Clientes de todo el mundo utilizan los ultrasonidos de sonda de Hielscher, así como las unidades de sonicación de muestras múltiples VialTweeter y UIP400MTP para su trabajo diario de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura de los procesadores de Hielscher, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. La preparación de muestras por ultrasonidos con las soluciones de ultrasonidos de Hielscher proporciona resultados altamente fiables y reproducibles!

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Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.

Literatura / Referencias



Información interesante

Tipos de ELISA

Hay varios tipos de ELISA, que se distinguen por su principio de funcionamiento. Se conocen como ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA de sándwich, ELISA de competición y ELISA inverso. A continuación presentamos una visión general de los distintos tipos de ELISA y sus principales características y diferencias.
El ELISA puede realizarse en un formato cualitativo o cuantitativo. Los resultados cualitativos proporcionan un simple resultado positivo o negativo, mientras que en el ELISA cuantitativo la densidad óptica (DO) de la muestra se compara con una curva estándar, que suele ser una dilución en serie de una solución de concentración conocida de la molécula objetivo.

ELISA directo

El ELISA directo es la forma de ensayo más simple de Elisa, en la que sólo se utiliza un anticuerpo primario etiquetado con enzimas y no se requieren anticuerpos secundarios. El anticuerpo primario marcado con enzimas se une directamente al objetivo, es decir, al antígeno. La solución de antígeno tamponada se añade a cada pozo de una placa microtiter (normalmente placas de 96 pozos, placas ELISA), donde se adhiere a la superficie plástica mediante interacciones de carga. Cuando la enzima unida al anticuerpo primario reacciona con su sustrato, produce una señal visible que puede medirse con un espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro.

ELISA indirecto

Para el test ELISA indirecto, se requiere tanto un anticuerpo primario como un anticuerpo secundario. Sin embargo, a diferencia del ELISA directo, no el anticuerpo primario, sino el secundario está etiquetado con una enzima. El antígeno se inmoviliza en la placa del pozo y se une al anticuerpo primario. Posteriormente, el anticuerpo secundario marcado con una enzima se une al anticuerpo primario. Finalmente, la enzima ligada al anticuerpo secundario reacciona con su sustrato para producir una señal visible que puede ser detectada.

Sándwich ELISA

Mientras que en las pruebas ELISA directas e indirectas, el antígeno se inmoviliza y se recubre con la superficie de la placa del pozo, en el ELISA sándwich el anticuerpo se inmoviliza en la superficie plástica de la placa ELISA. Los anticuerpos inmovilizados en el ELISA sándwich se conocen como anticuerpos de captura. Además de los anticuerpos de captura, en el sándwich ELISA también se requieren los llamados anticuerpos de detección. Los anticuerpos de detección incluyen un anticuerpo de detección primario no etiquetado y un anticuerpo de detección secundario etiquetado con enzimas.
Paso a paso, el antígeno de interés se une al anticuerpo de captura inmovilizado a la placa. Luego, el anticuerpo de detección primaria se une al antígeno. Después, el anticuerpo de detección secundaria se une al anticuerpo de detección primaria. En el último paso de la reacción, la enzima reacciona con su sustrato para producir una señal visible que puede ser detectada ópticamente.

ELISA competitivo

El ELISA competitivo, también conocido como ELISA de inhibición, es el tipo de ELISA más complejo porque implica el uso de un antígeno inhibidor. Cada uno de los tres formatos, ELISA directo, indirecto y sándwich, puede adaptarse al formato de ELISA competitivo. En el ELISA competitivo, el antígeno inhibidor y el antígeno de interés compiten por la unión al anticuerpo primario.
Para el ELISA competitivo, el anticuerpo sin etiquetar se incuba en presencia de su antígeno, es decir, la muestra. Estos complejos anticuerpo/antígeno unidos se añaden entonces a un pozo recubierto de antígeno.
La placa se lava, de modo que los anticuerpos no ligados se eliminan. El ELISA competitivo tiene su nombre debido al hecho de que cuanto más antígeno hay en la muestra, más complejos de antígeno-anticuerpo se forman. Esto significa que hay menos anticuerpos no ligados disponibles para unirse al antígeno en el pozo y los antígenos deben competir por un anticuerpo disponible. Se añade un anticuerpo secundario, que coincide con el anticuerpo primario. Este segundo anticuerpo se une a la enzima. Cuando se añade el sustrato, las enzimas restantes producen una señal cromogénica o fluorescente.
En este punto, la reacción se detiene para evitar la eventual saturación de la señal.
Algunos kits ELISA de la competencia incluyen un antígeno ligado a las enzimas en lugar de un anticuerpo ligado a las enzimas. El antígeno etiquetado compite por los sitios de unión del anticuerpo primario con el antígeno de la muestra (sin etiquetar). Cuanto menos antígeno haya en la muestra, más antígeno etiquetado se retiene en el pozo y más fuerte es la señal.

ELISA inversa

El ELISA inverso no utiliza placas de pozo, pero deja los antígenos suspendidos en el líquido de prueba. El test ELISA inverso mide la cantidad de anticuerpo unido a través del antígeno. Fue desarrollado específicamente para detectar e investigar la proteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental y cómo es capaz de encontrar anticuerpos específicos del virus.

Marcador enzimático utilizado para ELISA

En la lista que figura a continuación se indican los marcadores enzimáticos más comunes utilizados en los ensayos ELISA, que permiten medir los resultados del ensayo una vez terminado.

  • La OPD (o-fenilendiamina dihidrocloruro) se convierte en ámbar para detectar la HRP (peroxidasa de rábano), que suele utilizarse como proteína conjugada.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbencidina) se vuelve azul al detectar el HRP y se vuelve amarillo tras la adición de ácido sulfúrico o fosfórico.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]-sal de diamonio) se pone verde al detectar HRP.
  • El PNPP (p-nitrofenil fosfato, sal disódica) se vuelve amarillo al detectar la fosfatasa alcalina.