Preparación ultrasónica de muestras para ensayos ELISA

Ensayos como ELISA se utilizan ampliamente para diagnósticos in vitro, detección de proteínas relacionadas con enfermedades y control de calidad (por ejemplo, seguimiento de alérgenos alimentarios). La preparación de muestras por ultrasonidos es una técnica rápida, fiable y reproducible para lisar células y aislar proteínas intracelulares, ADN, ARN y orgánulos. Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones ultrasónicas para la preparación cómoda de muestras individuales, viales múltiples, así como para placas microtiter y placas de 96 pocillos.

ELISA – Ensayo inmunoenzimático

ELISA significa ensayo inmunoenzimático y es una técnica de análisis bioquímico muy utilizada de la categoría de los ensayos de unión a ligandos. En ELISA, se añade una muestra líquida a una fase sólida estacionaria con propiedades de unión especiales. Normalmente, la fase sólida estacionaria se aplica como recubrimiento a una placa de pocillos o placa ELISA. A continuación, se añaden secuencialmente varios reactivos líquidos, se incuban y se lavan, de modo que finalmente se produce un cambio óptico (por ejemplo, desarrollo de color por el producto de una reacción enzimática) en el líquido final en el pocillo. El cambio óptico permite medir la cantidad de analito mediante la llamada medición cuantitativa. “lectura". Para la lectura cuantitativa, se utiliza un espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro para detectar y medir la intensidad de la luz transmitida. La sensibilidad de la detección se ve influida por la amplificación de la señal durante las reacciones analíticas. Dado que las reacciones enzimáticas son procesos de amplificación bien investigados y fiables, se utilizan enzimas para crear la señal. Las enzimas se unen a los reactivos de detección en proporciones fijas para permitir una cuantificación precisa, lo que explica también el nombre de ensayo inmunoenzimático.
Como los ensayos ELISA se realizan en placas microtiter / placas de 96 pocillos, se conoce como técnica de ensayo en placa y se utiliza, por ejemplo, en diagnóstico clínico in vitro, investigación, desarrollo de fármacos, etc. para detectar y cuantificar anticuerpos, péptidos, proteínas y hormonas.
La técnica ELISA se utiliza con frecuencia como herramienta de diagnóstico en medicina, biotecnología, fitopatología y es también una importante medida de control de calidad en múltiples industrias.

Equipo completo del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter con el procesador ultrasónico UP200St

La unidad ultrasónica de preparación de muestras VialTweeter se utiliza para la lisis celular y la extracción de proteínas antes de los ensayos ELISA

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Preparación ultrasónica de muestras antes de ELISA

Antes de poder realizar el ensayo ELISA, las muestras requieren pasos de preparación como la lisis celular y la extracción de proteínas intracelulares, ADN, ARN, etc. La ventaja de la lisis celular ultrasónica y el aislamiento de proteínas es su alta eficacia, fiabilidad y reproducibilidad. Todos estos factores son importantes para obtener diagnósticos y resultados de investigación de alta calidad.

Ventajas de la lisis ultrasónica antes de ELISA

  • Tratamiento homogéneo de las muestras
  • Lisis completa
  • Extracción completa de proteínas (por ejemplo, anticuerpos, ADN)
  • Adaptación óptima al tipo de célula
  • Para cualquier tamaño de muestra
  • reproducible
  • temperatura controlada
  • Protocolización automática de datos en tarjeta SD

 

Este tutorial explica qué tipo de sonicador es el mejor para sus tareas de preparación de muestras como lisis, disrupción celular, aislamiento de proteínas, fragmentación de ADN y ARN en laboratorios, análisis e investigación. Elija el tipo de sonicador ideal para su aplicación, volumen de muestra, número de muestras y rendimiento. Hielscher Ultrasonics tiene el homogeneizador ultrasónico ideal para usted.

Cómo encontrar el sonicador perfecto para la disrupción celular y la extracción de proteínas en ciencia y análisis

Vídeo en miniatura

 

Protocolo para la lisis celular ultrasónica previa al ELISA

  • Para cultivos celulares: Antes de la lisis celular ultrasónica, centrifugar las células durante 5 minutos a 270 x g en una microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender las células en 30 - 100 μL de tampón RIPA. A continuación, incubar el sedimento celular en hielo durante 30 min.
  • Ahora, la muestra celular está lista para la lisis ultrasónica:
    Utilizar un ultrasonicador de tipo sonda (p. ej. UP200Ht con sonda S26d2) o un dispositivo ultrasónico multimuestra (por ejemplo, VialTweeter para la sonicación simultánea de hasta 10 viales o el UIP400MPT para placas microtiter / placas de 96 pocillos) en función de la cantidad de muestras que necesite preparar.
    Para la sonicación tipo sonda de una sola muestra, coloque las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  • Predefina la duración de los ultrasonidos, la entrada total de energía, el modo de ciclo y/o los límites de temperatura en el menú digital del ultrasonicador. Esto garantiza una sonicación y repetibilidad altamente fiables.
  • Inserte el sonotrodo y encienda el aparato de ultrasonidos. Mueva suavemente la micropunta de la sonda ultrasónica a través de la muestra para sonicarla uniformemente.
    Para la mayoría de las células, la lisis ultrasónica se completará después de 2 -4 ciclos de sonicación de 10 segundos.
  • Tras la sonicación, retire el sonotrodo de la muestra. Las muestras deben incubarse en hielo durante 5 min. A continuación, centrifugar a 10.000 x g durante 20 min para precipitar los restos. Transferir los sobrenadantes a un nuevo tubo de microcentrífuga. Etiquete los analitos y guárdelos a -20°C.
  • El sonotrodo ultrasónico puede limpiarse pasándole un paño con alcohol o sonicándolo en un vaso de precipitados lleno de alcohol, por ejemplo, etanol al 70%. Todas las sondas ultrasónicas de titanio son esterilizables en autoclave.
Los ultrasonidos de tipo sonda, como el UP200St, son homogeneizadores de tejidos fiables y muy utilizados para la preparación de muestras en genética, por ejemplo, para la lisis de E. coli.

Extracción de proteínas de células E.coli con el sonda ultrasónica UP200St

Para homogeneizados de tejidos:

  • Aclarar el tejido con PBS frío (0,01M, pH=7,4) para eliminar bien el exceso de sangre hemolizada.
  • Pesar el tejido (riñón, corazón, pulmón, bazo, etc.) y macerarlo en pequeños trozos, que se homogeneizan en PBS. El volumen de PBS necesario está relacionado con el peso del tejido. Como regla general, 1g de tejido requiere aproximadamente 9mL de PBS. Se recomienda añadir algún inhibidor de proteasas al PBS. (Como alternativa, se puede utilizar el tampón de lisis RIPA o hipotónico que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas).
  • Dependiendo del tamaño del tejido, puede ser útil un tratamiento corto con vórtex (aprox. 1-2 min. en pulsos de 15 seg.) para pretratar el tejido.
  • Monte una micropunta, por ejemplo S26d2, en su ultrasonicador. Coloque el tubo de muestra con el tejido en un baño de hielo.
  • Sonicar la muestra con su ultrasonicador, p. ej. UP200St (amplitud 80%) durante 1 min. en modo pulso (15seg encendido, 15seg pausa). Mantener la muestra en el baño de hielo.
  • A continuación, los homogeneizados se centrifugan para obtener pools específicos (citosólico, nuclear, mitocondrial o lisosomal) con el fin de enriquecer la proteína para su análisis. Centrifugando la muestra durante 5 minutos a 5000×g, se recupera el sobrenadante.
El sonotrodo MTP-24-8-96 dispone de ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pocillos de placas de microtitulación.

El sonotrodo MTP-24-8-96 dispone de ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pocillos de placas de microtitulación.

Control fiable de la temperatura durante la sonicación

La temperatura es un factor crucial que influye en el proceso y es especialmente importante para el tratamiento de muestras biológicas, por ejemplo, para evitar la degradación térmica de las proteínas. Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse bien cuando se utilizan los dispositivos de Hielscher Ultrasonics. Le presentamos varias opciones para monitorizar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara preanalíticamente con un ultrasonicador tipo sonda o con el VialTweeter.

  1. Control de la temperatura de la muestra: Todos los procesadores ultrasónicos digitales de Hielscher están equipados con un software inteligente y un sensor de temperatura enchufable. Conecte el sensor de temperatura al dispositivo ultrasónico (p. ej, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) e inserte la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. A través de la pantalla táctil digital en color, puede establecer en el menú del procesador de ultrasonidos un rango de temperatura específico para la sonicación de la muestra. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y hará una pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda hasta el valor inferior del ∆ de temperatura establecido. A continuación, la sonicación se reinicia automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
  2. En cuanto a la unidad ultrasónica multimuestra VialTweeter, el bloque de titanio, que contiene los tubos de muestra, puede preenfriarse. Poner el bloque VialTweeter (¡sólo el sonotrodo sin transductor!) en el frigorífico o congelador para preenfriar el bloque de titanio ayuda a posponer el aumento de temperatura en la muestra. Si es posible, también se puede preenfriar la propia muestra.
  3. Utilice un baño de hielo o hielo seco para enfriar durante la sonicación. Coloque su(s) tubo(s) de muestra durante la sonicación en un baño de hielo. Para el VialTweeter, utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo seco para que el calor pueda disiparse rápidamente.

Clientes de todo el mundo utilizan los ultrasonidos con sonda de Hielscher, así como las unidades de sonicación multimuestra VialTweeter y UIP400MTP para su trabajo diario de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura de los procesadores Hielscher, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. La preparación de muestras por ultrasonidos con las soluciones de ultrasonidos de Hielscher ofrece resultados altamente fiables y reproducibles.

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Los homogeneizadores ultrasónicos de alto cizallamiento se utilizan en procesos de laboratorio, de sobremesa, piloto e industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.



Literatura / Referencias

Información interesante

Tipos de ELISA

Existen varios tipos de ELISA, que se distinguen por su principio de funcionamiento. Se conocen como ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA sándwich, ELISA competitivo y ELISA inverso. A continuación le presentamos un resumen de los distintos tipos de ELISA y sus principales características y diferencias.
Las pruebas ELISA pueden realizarse en formato cualitativo o cuantitativo. Los resultados cualitativos proporcionan un simple resultado positivo o negativo, mientras que en el ELISA cuantitativo la densidad óptica (DO) de la muestra se compara con una curva estándar, que suele ser una dilución en serie de una solución de concentración conocida de la molécula diana.

ELISA directo

El ELISA directo es la forma de ensayo más sencilla de Elisa, en la que sólo se utiliza un anticuerpo primario marcado con enzimas y no se requieren anticuerpos secundarios. El anticuerpo primario marcado con enzimas se une directamente a la diana, es decir, al antígeno. La solución de antígeno tamponada se añade a cada pocillo de una placa microtiter (normalmente placas de 96 pocillos, placas ELISA), donde se adhiere a la superficie de plástico mediante interacciones de carga. Cuando la enzima unida al anticuerpo primario reacciona con su sustrato, produce una señal visible que puede medirse mediante espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro.

ELISA indirecto

Para la prueba ELISA indirecta se necesitan tanto un anticuerpo primario como un anticuerpo secundario. Sin embargo, a diferencia de la prueba ELISA directa, no se marca con una enzima el anticuerpo primario, sino el secundario. El antígeno se inmoviliza en la placa de pocillos y se une al anticuerpo primario. Posteriormente, el anticuerpo secundario marcado con enzima se une al anticuerpo primario. Por último, la enzima unida al anticuerpo secundario reacciona con su sustrato para producir una señal visible que puede detectarse.

ELISA en sándwich

Mientras que en las pruebas ELISA directas e indirectas, el antígeno está inmovilizado y recubierto en la superficie de la placa de pocillos, en las pruebas ELISA tipo sándwich el anticuerpo está inmovilizado en la superficie de plástico de la placa ELISA. Los anticuerpos inmovilizados en ELISA sándwich se conocen como anticuerpos de captura. Además de los anticuerpos de captura, en el ELISA tipo sándwich también se requieren los llamados anticuerpos de detección. Los anticuerpos de detección incluyen un anticuerpo de detección primario no marcado y un anticuerpo de detección secundario marcado con enzimas.
Paso a paso, el antígeno de interés se une al anticuerpo de captura inmovilizado en la placa. A continuación, el anticuerpo de detección primario se une al antígeno. A continuación, el anticuerpo de detección secundario se une al anticuerpo de detección primario. En el último paso de la reacción, la enzima reacciona con su sustrato para producir una señal visible que puede detectarse ópticamente.

ELISA competitivo

El ELISA competitivo, también conocido como ELISA de inhibición, es el tipo de ELISA más complejo porque implica el uso de un antígeno inhibidor. Cada uno de los tres formatos, ELISA directo, indirecto y sándwich, puede adaptarse al formato ELISA competitivo. En el ELISA competitivo, el antígeno inhibidor y el antígeno de interés compiten por unirse al anticuerpo primario.
En el ELISA competitivo, el anticuerpo no marcado se incuba en presencia de su antígeno, es decir, de la muestra. A continuación, estos complejos anticuerpo/antígeno unidos se añaden a un pocillo recubierto de antígeno.
La placa se lava para eliminar los anticuerpos no unidos. El ELISA competitivo debe su nombre al hecho de que cuanto más antígeno hay en la muestra, más complejos antígeno-anticuerpo se forman. Esto significa que hay menos anticuerpos no unidos disponibles para unirse al antígeno en el pocillo y los antígenos deben competir por un anticuerpo disponible. Se añade un anticuerpo secundario, que coincide con el anticuerpo primario. Este segundo anticuerpo se une a la enzima. Cuando se añade el sustrato, las enzimas restantes producen una señal cromogénica o fluorescente.
En este punto, la reacción se detiene para evitar la eventual saturación de la señal.
Algunos kits ELISA competitivos incluyen un antígeno marcado con una enzima en lugar de un anticuerpo marcado con una enzima. El antígeno marcado compite por los sitios de unión del anticuerpo primario con el antígeno de la muestra (no marcado). Cuanto menos antígeno haya en la muestra, más antígeno marcado quedará retenido en el pocillo y más fuerte será la señal.

ELISA inverso

La prueba ELISA inversa no utiliza placas de pocillos, sino que deja los antígenos suspendidos en el líquido de prueba. La prueba ELISA inversa mide la cantidad de anticuerpo unido a través del antígeno. Se desarrolló específicamente para detectar e investigar la proteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental y cómo es capaz de encontrar anticuerpos específicos del virus.

Marcador enzimático utilizado para ELISA

En la lista siguiente figuran los marcadores enzimáticos más comunes utilizados en los ensayos ELISA, que permiten medir los resultados del ensayo una vez finalizado.

  • La OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina) se vuelve ámbar para detectar la HRP (peroxidasa de rábano picante), que suele utilizarse para conjugar proteínas.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbencidina) se vuelve azul al detectar la HRP y se vuelve amarilla tras la adición de ácido sulfúrico o fosfórico.
  • ABTS (2,2′-Sal de azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]-diamonio) se vuelve verde al detectar la HRP.
  • PNPP (p-Nitrofenil Fosfato, Sal Disódica) se vuelve amarillo al detectar la fosfatasa alcalina.

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