Fragmentación ultrasónica del ADN para la secuenciación de nueva generación

La secuenciación de próxima generación (NGS) requiere el cizallamiento y la fragmentación fiables del ADN genómico para secuenciar cadenas de ADN genómico y crear bibliotecas genómicas. La fragmentación controlada del ADN en fragmentos de ADN es un paso esencial de la preparación de muestras necesario antes de secuenciar el ADN. La ultrasonicación ha demostrado ser una técnica eficaz y fiable para la fragmentación de ADN de cierta longitud. Los protocolos de fragmentación ultrasónica del ADN consiguen resultados de fragmentación reproducibles. Los ultrasonicadores de Hielscher son capaces de producir una amplia gama de distribuciones de tamaños de fragmentos de ADN genómico, controlables con precisión mediante los parámetros de funcionamiento. Dado que los sistemas de fragmentación de ADN por ultrasonidos de Hielscher están disponibles para viales individuales y múltiples, así como para microplacas, la preparación de las muestras resulta muy eficiente.

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Sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento: El UIP400MTP sonicula uniformemente muestras en placas multipocillo, placas microtiter y placas de 96 pocillos disgregando células, extrayendo proteínas, fragmentando ADN, ARN y fibrillas de alfa-sinucleína.

El sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento sonicará uniformemente las muestras en placas multipocillo, placas microtiter y placas de 96 pocillos.

Ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN

  • resultados repetibles / reproducibles
  • ajustable con precisión para obtener una longitud de fragmento determinada
  • Tratamiento rápido
  • resultados coherentes de fragmentación del ADN
  • dispositivos para cualquier volumen de muestra (por ejemplo, múltiples viales o microplacas)
  • alto rendimiento
  • control preciso de la temperatura
  • manejo sencillo y fácil

Secuenciación de próxima generación: Fragmentación ultrasónica del ADN para la preparación de bibliotecas

Para llevar a cabo una secuenciación de próxima generación, deben realizarse los tres pasos básicos de (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de la biblioteca, el ADN se fragmenta, después los extremos de los fragmentos se reparan (pulen) añadiendo una única base de adenina y los fragmentos objetivo se convierten en ADN de doble cadena. Por último, se unen los denominados adaptadores mediante ligación, PCR o marcación, de modo que el producto final de ADN de la biblioteca pueda cuantificarse para la secuenciación.
Fragmentación del ADN mediante sonicación: Especialmente en el caso de tecnologías de secuenciación de lectura corta como Illumina, que no pueden leer fácilmente fragmentos de ADN más largos, los soportes de ADN deben fragmentarse hasta un tamaño determinado que puede conseguirse de forma fiable mediante ultrasonidos.
La ultrasonicación puede utilizarse de forma fiable para la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina.

Secuenciación de nueva generación – Preparación de la biblioteca

La fragmentación ultrasónica del ADN se emplea habitualmente en la preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN para plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS). Esta técnica se utiliza para romper las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños de un rango de tamaño deseado, lo que facilita los pasos posteriores en la preparación de bibliotecas. La fragmentación ultrasónica del ADN suele ser necesaria durante el paso de preparación de bibliotecas de los flujos de trabajo de NGS para fragmentar el ADN genómico en fragmentos más pequeños adecuados para el procesamiento y la secuenciación posteriores. Desempeña un papel crucial para garantizar el éxito del experimento de secuenciación al generar fragmentos de ADN del rango de tamaño adecuado para la plataforma de secuenciación específica que se esté utilizando.

La fragmentación ultrasónica del ADN se utiliza con frecuencia como paso de preparación de muestras en la secuenciación de próxima generación (NGS)

Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min de ultrasonidos. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

Secuenciación de nueva generación – Pasos del proceso:

  • Fragmentación ultrasónica del ADN: Antes de construir la biblioteca, el ADN genómico se fragmenta en trozos más pequeños y manejables. La fragmentación ultrasónica utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para fragmentar las moléculas de ADN en fragmentos del tamaño deseado. Este paso es crucial porque ayuda a garantizar que las lecturas de secuenciación generadas posteriormente tengan la longitud adecuada para la plataforma de secuenciación utilizada. El rango de tamaño de los fragmentos puede ajustarse en función de los requisitos específicos del experimento de secuenciación.
  • Amplificación clonal por PCR: Tras la fragmentación ultrasónica, los fragmentos de ADN se someten a reparación de extremos, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR para generar las bibliotecas de secuenciación de ADN finales. Estos pasos preparan las moléculas de ADN fragmentadas para el proceso de secuenciación añadiendo las secuencias adaptadoras necesarias para la unión a la plataforma de secuenciación y proporcionando sitios de cebado para la amplificación por PCR.
  • Secuenciación del ADN por síntesis: Una vez preparadas las bibliotecas de secuenciación, comienza el proceso de secuenciación del ADN por síntesis (SBS). Durante la SBS, la secuencia de ADN se determina mediante la adición secuencial de nucleótidos a la cadena complementaria. Este paso implica reacciones cíclicas de incorporación de nucleótidos, formación de imágenes y escisión, lo que permite determinar la secuencia de ADN basándose en las señales fluorescentes emitidas por los nucleótidos incorporados.
  • Secuenciación paralela masiva: En el último paso, las plantillas de ADN amplificadas y segregadas espacialmente se secuencian simultáneamente de forma masivamente paralela. Este enfoque de secuenciación de alto rendimiento permite la generación de millones a miles de millones de lecturas de secuenciación en una sola ejecución de secuenciación, lo que permite una determinación eficiente y rápida de las secuencias de ADN.

¿Cómo funciona la fragmentación ultrasónica del ADN?

La sonicación, también conocida como procesamiento acústico de muestras, es un método muy utilizado para fragmentar el ADN. Para la fragmentación ultrasónica del ADN, las muestras se exponen a ondas ultrasónicas en condiciones controladas. El principio de funcionamiento de la fragmentación ultrasónica del ADN se basa en las vibraciones y la cavitación generadas por las ondas ultrasónicas. Las fuerzas de cizallamiento que resultan de la cavitación ultrasónica (acústica) rompen las moléculas de ADN de alto peso molecular. El ajuste de la sonicación, como la intensidad (amplitud, duración), el modo de pulsación y la temperatura, permiten una fragmentación precisa del ADN hasta una determinada longitud deseada de los fragmentos de ADN. Mientras que el ADN suele reducirse a entre 100 y 600 pb mediante ultrasonicación, pueden obtenerse fragmentos de ADN más largos, de hasta 1.300 pb, cuando se aplican condiciones ultrasónicas más suaves.

Los homogeneizadores ultrasónicos son fiables para el cizallamiento del ADN

Cizallamiento ultrasónico del ADN durante la ChIP – inmunoprecipitación de cromatina
Adaptado de Jkwchui bajo CC-BY-SA.03

 

Este tutorial explica qué tipo de sonicador es el mejor para sus tareas de preparación de muestras como lisis, disrupción celular, aislamiento de proteínas, fragmentación de ADN y ARN en laboratorios, análisis e investigación. Elija el tipo de sonicador ideal para su aplicación, volumen de muestra, número de muestras y rendimiento. Hielscher Ultrasonics tiene el homogeneizador ultrasónico ideal para usted.

Cómo encontrar el sonicador perfecto para la disrupción celular y la extracción de proteínas en ciencia y análisis

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Control de la temperatura para evitar la degradación del ADN

La forma molecular de doble cadena del ADN es muy sensible a las temperaturas elevadas, por lo que el control exacto de la temperatura durante los pasos de preparación de la muestra es un factor crucial para obtener resultados fiables en los análisis.
Tanto si utiliza los ultrasonicadores de sonda de Hielscher, el VialTweeter o el UIP400MTP – La supervisión y el control continuos de la temperatura están garantizados gracias a un sensor de temperatura enchufable y al software del dispositivo inteligente. Para mantener la temperatura dentro de un rango determinado, se puede establecer un límite superior e inferior de temperatura. En consecuencia, el ultrasonicador se detendrá en cuanto se supere este límite de temperatura y continuará sonicando automáticamente cuando la temperatura haya descendido un ∆T establecido.
El sofisticado software de los ultrasonidos Hielscher garantiza el mantenimiento fiable de las condiciones ideales de tratamiento de las muestras.

Fragmentación masiva de muestras de ADN con el ultrasonido para placas de pocillos múltiples UIP400MTP

Unidad ultrasónica de preparación de muestras múltiples UIP400MTP para sonicación de placas de pocillos múltiplesEl número de muestras en las ciencias de la vida ha aumentado considerablemente en la última década. Esto significa que deben procesarse números muy elevados de muestras (por ejemplo, 384, 1536 o 3456 pocillos por microplaca) durante la preparación y el análisis de las muestras en condiciones uniformes para obtener resultados comparables y válidos. Con el UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics sigue la tendencia del procesamiento masivo de muestras. El UIP400MTP es un ultrasonido para la preparación de muestras en microplacas. El UIP400MTP puede procesar placas con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pocillos. Dependiendo del tipo de microplaca, cada pocillo puede contener volúmenes de muestra de entre decenas de nanolitros y varios mililitros. Ampliamente utilizado en la investigación de las ciencias de la vida, el UIP400MTP se utiliza muy comúnmente para la preparación de muestras antes de ensayos como ELISA (ensayo inmunoenzimático) o PCR, antes del análisis de proteínas, así como para la preparación de cromatina antes de CHiP y CHiP-seq, la identificación de modificaciones de histonas y otros tratamientos analíticos (por ejemplo, electroforesis en gel, espectrometría de masas).

El homogeneizador ultrasónico UIP400MTP puede sonicar placas de pocillos múltiples y microplacas para lisis celular, fragmentación de ADN, dispersión u homogeneización.

UIP400MTP para sonicación multiplaca de pocillos

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VialTweeter para la separación de muestras de hasta 10 viales

Equipo completo del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter con el procesador ultrasónico UP200StEl VialTweeter es un ultrasonicador de laboratorio ampliamente utilizado VialTweeter que permite la sonicación eficaz y cómoda de hasta 10 viales simultáneamente. Dado que los viales y tubos de ensayo (por ejemplo, viales Eppendorf, crio viales, tubos de centrífuga) se sonican indirectamente, se evita cualquier contaminación cruzada. Como se aplica la misma intensidad de ultrasonidos a cada muestra, todos los resultados de la sonicación son homogéneos y reproducibles. El VialTweeter ofrece todas las funciones inteligentes como nuestros otros dispositivos digitales (por ejemplo, menú inteligente, ajustes programables, control de temperatura, control remoto, etc.) para garantizar la máxima comodidad del usuario.

Sondas multidedos para placas de micropocillos

4 cabezales de sonda o 4 sonotrodos para la sonicación simultánea de 4 muestras a la misma intensidad con el ultrasonicador Hielscher de 200 vatios modelos UP200ST y UP200HTDisponibles para los homogeneizadores de sonda ultrasónica UP200Ht y UP200St, las sondas multidedos con 4 u 8 dedos son una opción cómoda para sonicar varias muestras al mismo tiempo en las mismas condiciones. Por ejemplo, el sonotrodo MTP-24-8-96 es una sonda de ocho dedos, ideal para la integración en sistemas automatizados o la preparación manual eficaz de muestras de los pocillos de placas de pocillos múltiples. El sonotrodo multidedos es ideal para laboratorios automatizados en los que se procesan principalmente vasos de precipitados y tubos de ensayo con un sonotrodo ultrasónico estándar. Las sondas multi-finger y estándar pueden intercambiarse rápidamente en pocos minutos transformando el ultrasonicador monosonda en un disruptor ultrasónico multi-sonda.

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Ultrasonidos Hielscher para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas diferentes plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras de múltiples tubos o placas de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas de microtitulación), sonorreactores y cóforos ultrasónicos. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN funcionan con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento y frecuencia sintonizada, que se controlan con precisión y ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos para cualquier número y tamaño de muestra

Con los ultrasonicadores multimuestra de Hielscher VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo) es posible reducir fácilmente el tiempo de procesamiento de la muestra gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtiene la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que la preparación de muestras sea eficiente, fiable y escalable. Los protocolos pueden escalarse linealmente de una a numerosas muestras aplicando ultrasonidos controlados constantemente.
Los ultrasonicadores de sonda con uno a cinco dedos son ideales para la preparación de un menor número de muestras. Los ultrasonicadores de laboratorio de Hielscher están disponibles en varios tamaños para que podamos recomendarle el dispositivo ideal para su aplicación y sus requisitos.

Control preciso del proceso

Los ultrasonidos de Hielscher pueden controlarse a distancia mediante un navegador. Los parámetros de sonicación pueden supervisarse y ajustarse con precisión a los requisitos del proceso.Los ajustes de sonicación controlables con precisión son cruciales, ya que una sonificación exhaustiva puede destruir el ADN, el ARN y la cromatina, pero un cizallamiento ultrasónico inadecuado da lugar a fragmentos de ADN y cromatina demasiado largos. Los ultrasonicadores digitales de Hielscher pueden ajustarse fácilmente a parámetros de sonicación precisos. Los ajustes específicos de sonicación también se pueden guardar como ajustes programados para repetir rápidamente el mismo procedimiento.
Todas las sonicaciones se protocolizan automáticamente y se almacenan como archivos CSV en una tarjeta SD integrada. Esto permite una documentación precisa de los ensayos realizados y hace posible revisar fácilmente los ciclos de sonicación.
Mediante el control remoto por navegador, todos los ultrasonicadores digitales pueden manejarse y supervisarse a través de cualquier navegador estándar. No es necesario instalar software adicional, ya que una conexión LAN permite una configuración plug-n-play muy sencilla.

Máxima facilidad de uso en la preparación de muestras por ultrasonidos

Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para ofrecer ultrasonidos de alto rendimiento y, al mismo tiempo, ser muy fáciles de usar y manejar. Todos los ajustes están bien estructurados en un menú claro, al que se puede acceder fácilmente mediante la pantalla táctil de colores o el mando a distancia del navegador. El software inteligente con ajustes programables y registro automático de datos garantiza unos ajustes de sonicación óptimos para obtener resultados fiables y reproducibles. La interfaz de menú limpia y fácil de usar convierte a los ultrasonicadores Hielscher en dispositivos fáciles de usar y eficientes.
La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonicadores de laboratorio, que son ideales para tareas de preparación de muestras como la fragmentación de ADN y ARN, la lisis celular y la extracción de proteínas:

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
UIP400MTP 400 para microplacas 6 – 3456 pozos
VialTweeter 200 para hasta 10 viales más posibilidad de pinza 0,5 – 1,5
UP50H 50 tipo sonda 0,01 – 250
UP100H 100 tipo sonda 0,01 – 500
UP200Ht 200 tipo sonda 0,1 – 1000
UP200St 200 tipo sonda 0,1 – 1000
UP400St 400 tipo sonda 5,0 – 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 – 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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El VialTweeter es un ultrasonicador multimuestra que permite una preparación fiable de las muestras en condiciones de temperatura controladas con precisión.

La unidad ultrasónica de preparación de muestras múltiples VialTweeter permite la sonicación simultánea de hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción VialPress, se pueden presionar hasta 4 viales adicionales hacia delante para una sonicación intensa.


El sonotrodo MTP-24-8-96 dispone de ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pocillos de placas de microtitulación.

El sonotrodo MTP-24-8-96 dispone de ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pocillos de placas de microtitulación.



Literatura / Referencias

Información interesante

¿Qué es la secuenciación de nueva generación?

La secuenciación de nueva generación, también denominada secuenciación de nueva generación (NGS), secuenciación de alto rendimiento o secuenciación de segunda generación, se refiere al enfoque de la secuenciación paralela masiva, en la que cantidades muy grandes (masivas) de ADN de millones de fragmentos se secuencian simultáneamente en paralelo por ejecución.
Para llevar a cabo una secuenciación de próxima generación, deben realizarse los tres pasos básicos de (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de la biblioteca, las cadenas de ADN deben fragmentarse en fragmentos de ADN de cierta longitud. La sonicación es una de las técnicas preferidas para fragmentar el ADN.
Durante el proceso de secuenciación del ADN, el orden de los nucleótidos en el ADN – conocida como secuencia del ácido nucleico. La secuencia del ácido nucleico está compuesta por cuatro bases nucleotídicas: adenina, citosina, guanina y timina. – que codifican la información.
La secuenciación de nueva generación está impulsando la investigación en ciencias de la vida y medicina personalizada, ya que la secuenciación de ADN y ARN se utiliza mucho en la investigación genómica, la investigación del cáncer, la investigación de enfermedades raras y complejas, la investigación microbiana, la agrigenómica y muchos otros campos de investigación.

Secuenciación de nueva generación frente a secuenciación Sanger

Mientras que con la secuenciación de nueva generación (NGS) es posible secuenciar grandes cantidades de muestras genómicas, la secuenciación Sanger (también conocida como método de terminación en cadena o secuenciación de primera generación) sólo permite secuenciar pequeñas cantidades de muestras. La secuenciación Sanger sólo secuencia un fragmento de ADN cada vez y puede realizarse en un solo día. Debido a su precisión, la secuenciación de Sanger también se considera la tecnología de referencia, que se utiliza para verificar los resultados obtenidos mediante la secuenciación de próxima generación.
La secuenciación Sanger alcanza longitudes de lectura de aproximadamente 800 pb (normalmente 500-600 pb con ADN no enriquecido). Las longitudes de lectura más largas de la secuenciación Sanger presentan ventajas significativas sobre otros métodos de secuenciación, especialmente en términos de secuenciación de regiones repetitivas del genoma. El reto de los datos de secuenciación de lectura corta es particularmente un problema en la secuenciación de nuevos genomas (de novo) y en la secuenciación de segmentos genómicos altamente reordenados, típicamente los que se observan en los genomas del cáncer o en regiones de cromosomas que presentan variación estructural. [cp. Morozova y Marra, 2008].


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonicador compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.


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