Fragmentación ultrasónica del ADN para la secuenciación de nueva generación

La secuenciación de próxima generación (NGS) requiere el cizallamiento y la fragmentación fiables del ADN genómico para secuenciar cadenas de ADN genómico y crear bibliotecas genómicas. La fragmentación controlada del ADN en fragmentos de ADN es un paso esencial de la preparación de muestras necesario antes de secuenciar el ADN. La ultrasonicación ha demostrado ser una técnica eficaz y fiable para la fragmentación de ADN de cierta longitud. Los protocolos de fragmentación ultrasónica del ADN consiguen resultados de fragmentación reproducibles. Los ultrasonicadores de Hielscher son capaces de producir una amplia gama de distribuciones de tamaños de fragmentos de ADN genómico, controlables con precisión mediante los parámetros de funcionamiento. Dado que los sistemas de fragmentación de ADN por ultrasonidos de Hielscher están disponibles para viales individuales y múltiples, así como para microplacas, la preparación de muestras resulta muy eficiente.

Secuenciación de próxima generación: Fragmentación ultrasónica del ADN para la preparación de bibliotecas

Para llevar a cabo una secuenciación de próxima generación, deben realizarse los tres pasos básicos de (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de la biblioteca, el ADN se fragmenta, después los extremos de los fragmentos se reparan (pulen) añadiendo una única base de adenina y los fragmentos objetivo se convierten en ADN de doble cadena. Por último, se unen los denominados adaptadores mediante ligación, PCR o marcación, de modo que el producto final de ADN de la biblioteca pueda cuantificarse para la secuenciación.
Fragmentación del ADN mediante sonicación: Especialmente en el caso de tecnologías de secuenciación de lectura corta como Illumina, que no pueden leer fácilmente fragmentos de ADN más largos, los soportes de ADN deben fragmentarse hasta un tamaño determinado que puede conseguirse de forma fiable mediante ultrasonidos.
La ultrasonicación puede utilizarse de forma fiable para la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina.

Secuenciación de nueva generación – preparación de la biblioteca

La fragmentación ultrasónica del ADN se emplea habitualmente en la preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN para plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS). Esta técnica se utiliza para romper las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños de un rango de tamaño deseado, lo que facilita los pasos posteriores en la preparación de bibliotecas. La fragmentación ultrasónica del ADN suele ser necesaria durante el paso de preparación de bibliotecas de los flujos de trabajo de NGS para fragmentar el ADN genómico en fragmentos más pequeños adecuados para el procesamiento y la secuenciación posteriores. Desempeña un papel crucial para garantizar el éxito del experimento de secuenciación al generar fragmentos de ADN del rango de tamaño adecuado para la plataforma de secuenciación específica que se esté utilizando.

Secuenciación de nueva generación – Pasos del proceso:

• Fragmentación ultrasónica del ADN: Antes de construir la biblioteca, el ADN genómico se fragmenta en trozos más pequeños y manejables. La fragmentación ultrasónica utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para fragmentar las moléculas de ADN en fragmentos del tamaño deseado. Este paso es crucial porque ayuda a garantizar que las lecturas de secuenciación generadas posteriormente tengan la longitud adecuada para la plataforma de secuenciación utilizada. El rango de tamaño de los fragmentos puede ajustarse en función de los requisitos específicos del experimento de secuenciación.
• Amplificación clonal por PCR: Tras la fragmentación ultrasónica, los fragmentos de ADN se someten a reparación de extremos, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR para generar las bibliotecas de secuenciación de ADN finales. Estos pasos preparan las moléculas de ADN fragmentadas para el proceso de secuenciación añadiendo las secuencias adaptadoras necesarias para la unión a la plataforma de secuenciación y proporcionando sitios de cebado para la amplificación por PCR.
• Secuenciación del ADN por síntesis: Una vez preparadas las bibliotecas de secuenciación, comienza el proceso de secuenciación del ADN por síntesis (SBS). Durante la SBS, la secuencia de ADN se determina mediante la adición secuencial de nucleótidos a la cadena complementaria. Este paso implica reacciones cíclicas de incorporación de nucleótidos, formación de imágenes y escisión, lo que permite determinar la secuencia de ADN basándose en las señales fluorescentes emitidas por los nucleótidos incorporados.
• Secuenciación paralela masiva: En el último paso, las plantillas de ADN amplificadas y segregadas espacialmente se secuencian simultáneamente de forma masivamente paralela. Este enfoque de secuenciación de alto rendimiento permite la generación de millones a miles de millones de lecturas de secuenciación en una sola ejecución de secuenciación, lo que permite una determinación eficiente y rápida de las secuencias de ADN.

¿Cómo funciona la fragmentación ultrasónica del ADN?

La sonicación, también conocida como procesamiento acústico de muestras, es un método muy utilizado para fragmentar el ADN. Para la fragmentación ultrasónica del ADN, las muestras se exponen a ondas ultrasónicas en condiciones controladas. El principio de funcionamiento de la fragmentación ultrasónica del ADN se basa en las vibraciones y la cavitación generadas por las ondas ultrasónicas. Las fuerzas de cizallamiento que resultan de la cavitación ultrasónica (acústica) rompen las moléculas de ADN de alto peso molecular. El ajuste de la sonicación, como la intensidad (amplitud, duración), el modo de pulsación y la temperatura, permiten una fragmentación precisa del ADN hasta una determinada longitud deseada de los fragmentos de ADN. Mientras que el ADN suele reducirse a entre 100 y 600 pb mediante ultrasonicación, pueden obtenerse fragmentos de ADN más largos, de hasta 1.300 pb, cuando se aplican condiciones ultrasónicas más suaves.

Control de la temperatura para evitar la degradación del ADN

La forma molecular de doble cadena del ADN es muy sensible a las temperaturas elevadas, por lo que el control exacto de la temperatura durante los pasos de preparación de la muestra es un factor crucial para obtener resultados fiables en los análisis.
Tanto si utiliza los ultrasonicadores de sonda de Hielscher, el VialTweeter o el UIP400MTP – La supervisión y el control continuos de la temperatura están garantizados gracias a un sensor de temperatura enchufable y al software del dispositivo inteligente. Para mantener la temperatura dentro de un rango determinado, se puede establecer un límite superior e inferior de temperatura. En consecuencia, el ultrasonicador se detendrá en cuanto se supere este límite de temperatura y continuará sonicando automáticamente cuando la temperatura haya descendido un ∆T establecido.
El sofisticado software de los ultrasonidos Hielscher garantiza el mantenimiento fiable de las condiciones ideales de tratamiento de las muestras.

Fragmentación masiva de muestras de ADN con el ultrasonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP

El número de muestras en las ciencias de la vida ha aumentado considerablemente en la última década. Esto significa que deben procesarse números muy elevados de muestras (por ejemplo, 384, 1536 o 3456 pocillos por microplaca) durante la preparación y el análisis de las muestras en condiciones uniformes para obtener resultados comparables y válidos. Con el UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics sigue la tendencia del procesamiento masivo de muestras. El UIP400MTP es un ultrasonido para la preparación de muestras en microplacas. El UIP400MTP puede procesar placas con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pocillos. Dependiendo del tipo de microplaca, cada pocillo puede contener volúmenes de muestra de entre decenas de nanolitros y varios mililitros. Ampliamente utilizado en la investigación de ciencias de la vida, el UIP400MTP se utiliza muy comúnmente para la preparación de muestras antes de ensayos como ELISA (ensayo inmunoenzimático) o PCR, antes de análisis de proteínas, así como para la preparación de cromatina antes de CHiP y CHiP-seq, identificación de modificación de histonas, y otros tratamientos analíticos (por ejemplo, electroforesis en gel, espectrometría de masas).

VialTweeter para la separación de muestras de hasta 10 viales

El VialTweeter es un ultrasonicador de laboratorio ampliamente utilizado VialTweeter que permite la sonicación eficaz y cómoda de hasta 10 viales simultáneamente. Dado que los viales y tubos de ensayo (por ejemplo, viales Eppendorf, crio viales, tubos de centrífuga) se sonican indirectamente, se evita cualquier contaminación cruzada. Como se aplica la misma intensidad de ultrasonidos a cada muestra, todos los resultados de la sonicación son homogéneos y reproducibles. El VialTweeter ofrece todas las funciones inteligentes como nuestros otros dispositivos digitales (por ejemplo, menú inteligente, ajustes programables, control de temperatura, control remoto, etc.) para garantizar la máxima comodidad del usuario.

Sondas multidedos para placas de micropocillos

Disponibles para los homogeneizadores de sonda ultrasónica UP200Ht y UP200St, las sondas multidedos con 4 u 8 dedos son una opción cómoda para sonicar varias muestras al mismo tiempo en las mismas condiciones. Por ejemplo, el sonotrodo MTP-24-8-96 es una sonda de ocho dedos, ideal para la integración en sistemas automatizados o la preparación manual eficaz de muestras de los pocillos de placas de pocillos múltiples. El sonotrodo multidedos es ideal para laboratorios automatizados en los que se procesan principalmente vasos de precipitados y tubos de ensayo con un sonotrodo ultrasónico estándar. Las sondas multi-finger y estándar pueden intercambiarse rápidamente en pocos minutos transformando el ultrasonicador monosonda en un disruptor ultrasónico multi-sonda.

Ultrasonidos Hielscher para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas diferentes plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras de múltiples tubos o placas de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas de microtitulación), sonorreactores y cóforos ultrasónicos. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN funcionan con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento y frecuencia sintonizada, que se controlan con precisión y ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos para cualquier número y tamaño de muestra

Con los ultrasonicadores multimuestra de Hielscher VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo) es posible reducir fácilmente el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtiene la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que la preparación de muestras sea eficiente, fiable y escalable. Los protocolos pueden escalarse linealmente de una a numerosas muestras aplicando ultrasonidos controlados constantemente.
Los ultrasonicadores de sonda con uno a cinco dedos son ideales para la preparación de un menor número de muestras. Los ultrasonicadores de laboratorio de Hielscher están disponibles en varios tamaños para que podamos recomendarle el dispositivo ideal para su aplicación y sus requisitos.

control preciso del proceso

Los ajustes de sonicación controlables con precisión son cruciales, ya que una sonificación exhaustiva puede destruir el ADN, el ARN y la cromatina, pero un cizallamiento ultrasónico inadecuado da lugar a fragmentos de ADN y cromatina demasiado largos. Los ultrasonicadores digitales de Hielscher pueden ajustarse fácilmente a parámetros de sonicación precisos. Los ajustes específicos de sonicación también se pueden guardar como ajustes programados para repetir rápidamente el mismo procedimiento.
Todas las sonicaciones se protocolizan automáticamente y se almacenan como archivos CSV en una tarjeta SD integrada. Esto permite una documentación precisa de los ensayos realizados y hace posible revisar fácilmente los ciclos de sonicación.
Mediante el control remoto por navegador, todos los ultrasonicadores digitales pueden manejarse y supervisarse a través de cualquier navegador estándar. No es necesario instalar software adicional, ya que una conexión LAN permite una configuración plug-n-play muy sencilla.

Máxima facilidad de uso en la preparación de muestras por ultrasonidos

Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para ofrecer ultrasonidos de alto rendimiento y, al mismo tiempo, ser muy fáciles de usar y manejar. Todos los ajustes están bien estructurados en un menú claro, al que se puede acceder fácilmente mediante la pantalla táctil de colores o el mando a distancia del navegador. El software inteligente con ajustes programables y registro automático de datos garantiza unos ajustes de sonicación óptimos para obtener resultados fiables y reproducibles. La interfaz de menú limpia y fácil de usar convierte a los ultrasonicadores Hielscher en dispositivos fáciles de usar y eficientes.
La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonidos de laboratorio, que son ideales para tareas de preparación de muestras como la fragmentación de ADN y ARN, la lisis celular y la extracción de proteínas: