Fragmentación ultrasónica del ADN para la secuenciación de nueva generación

La secuenciación de próxima generación (NGS) requiere el cizallamiento y la fragmentación fiables del ADN genómico para secuenciar las cadenas de ADN genómico y crear bibliotecas genómicas. La fragmentación controlada del ADN en fragmentos de ADN es un paso esencial de la preparación de la muestra que se requiere antes de la secuenciación del ADN. La ultrasonicación ha demostrado ser una técnica eficaz y fiable para la fragmentación del ADN de cierta longitud. Los protocolos de fragmentación de ADN por ultrasonidos consiguen resultados de fragmentación reproducibles. Los ultrasonidos de Hielscher son capaces de producir una amplia gama de distribuciones de tamaños de fragmentos de ADN genómico, controlables con precisión a través de los parámetros de funcionamiento. Dado que los sistemas de fragmentación de ADN por ultrasonidos de Hielscher están disponibles para viales individuales y múltiples, así como para microplacas, la preparación de las muestras resulta muy eficiente.

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Ultrasonic DNA fragmentation is frequently used as sample preparation step in Next Generation Sequencing (NGS)

Electroforética análisis de ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min ultrasonicación. L indica la escalera de ADN. (Basselet et al. 2008)

Ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN

  • resultados repetibles / reproducibles
  • ajustable con precisión para obtener una longitud de fragmento determinada
  • procesamiento rápido
  • resultados de fragmentación de ADN consistentes
  • dispositivos para cualquier volumen de muestra (por ejemplo, múltiples viales o microplacas)
  • alto rendimiento
  • control preciso de la temperatura
  • funcionamiento sencillo y fácil de usar

Secuenciación Next-Gen: Fragmentación ultrasónica del ADN para la preparación de bibliotecas

Para llevar a cabo una secuenciación de próxima generación, deben realizarse los tres pasos básicos de (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de la biblioteca, el ADN se fragmenta, luego los extremos de los fragmentos se reparan (se pulen) añadiendo una sola base de adenina y los fragmentos objetivo se convierten en ADN de doble cadena. Por último, los denominados adaptadores se unen mediante ligadura, PCR o etiquetado, de modo que el producto final de ADN de la biblioteca pueda cuantificarse para la secuenciación.
Fragmentación del ADN mediante sonicación: Especialmente en el caso de las tecnologías de secuenciación de lectura corta, como Illumina, que no pueden leer fácilmente fragmentos de ADN más largos, los soportes de ADN deben fragmentarse hasta un determinado tamaño que puede conseguirse de forma fiable mediante ultrasonidos.
La ultrasonicación puede utilizarse de forma fiable para la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina.

¿Cómo funciona la fragmentación ultrasónica del ADN?

La sonicación, también conocida como procesamiento acústico de muestras, es un método muy utilizado para fragmentar el ADN. Para la fragmentación ultrasónica del ADN, las muestras se exponen a ondas ultrasónicas en condiciones controladas. El principio de funcionamiento de la fragmentación ultrasónica del ADN se basa en las vibraciones y la cavitación generadas por las ondas ultrasónicas. Las fuerzas de cizallamiento que resultan de la cavitación ultrasónica (acústica) rompen las moléculas de ADN de alto peso molecular. El ajuste de la sonicación, como la intensidad (amplitud, duración), el modo de pulsación y la temperatura, permiten una fragmentación precisa del ADN hasta una determinada longitud deseada de los fragmentos de ADN. Mientras que el ADN suele reducirse a entre 100 y 600 pb mediante la ultrasonicación, pueden obtenerse fragmentos de ADN más largos, de hasta 1300 pb, cuando se aplican condiciones ultrasónicas más suaves.

Ultrasonic homogenizers are reliable for DNA shearing

Cizallamiento ultrasónico del ADN durante la ChIP – inmunoprecipitación de la cromatina
Adaptado de Jkwchui bajo CC-BY-SA.03

Control de la temperatura para evitar la degradación del ADN

La forma molecular de doble cadena del ADN es muy sensible a las temperaturas elevadas, por lo que el control exacto de la temperatura durante los pasos de preparación de la muestra es un factor crucial para obtener resultados de análisis fiables.
Tanto si utiliza los ultrasonidos con sonda de Hielscher, el VialTweeter o el UIP400MTP – La supervisión y el control continuos de la temperatura están garantizados gracias a un sensor de temperatura enchufable y al software del dispositivo inteligente. Para mantener la temperatura dentro de un rango determinado, se puede establecer un límite de temperatura superior e inferior. En consecuencia, el ultrasonido se detendrá en cuanto se supere este límite de temperatura y continuará sonando automáticamente cuando la temperatura haya bajado un ∆T establecido.
El sofisticado software de los ultrasonidos de Hielscher garantiza el mantenimiento fiable de las condiciones ideales de tratamiento de las muestras.

Fragmentación masiva de muestras de ADN con el ultrasonido para placas multipozo UIP400MTP

Ultrasonic Multi-Sample Preparation Unit UIP400MTP for multi-well plate sonicationEl número de muestras en las ciencias de la vida ha aumentado considerablemente en la última década. Esto significa que es necesario procesar un número muy elevado de muestras (por ejemplo, 384, 1536 o 3456 pocillos por microplaca) durante la preparación y el análisis de las muestras en condiciones uniformes para obtener resultados comparables y válidos. Con el UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics sigue la tendencia del procesamiento masivo de muestras. El UIP400MTP es un ultrasonido para la preparación de muestras mediante microplacas. El UIP400MTP puede procesar placas con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozos. Dependiendo del tipo de microplaca, cada pocillo puede contener volúmenes de muestra de entre decenas de nanolitros y varios mililitros. Ampliamente utilizado en la investigación en ciencias de la vida, el UIP400MTP se utiliza muy comúnmente para la preparación de muestras antes de ensayos como ELISA (ensayo inmunoenzimático) o PCR, antes de la analítica de proteínas, así como para la preparación de la cromatina antes de CHiP y CHiP-seq, la identificación de modificaciones de las histonas, y otros tratamientos analíticos (por ejemplo, electroforesis en gel, espectrometría de masas).

El VialTweeter para la separación de muestras de hasta 10 viales

Equipo completo del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter con el procesador ultrasónico UP200StEl VialTweeter es un ultrasonicador de laboratorio muy utilizado que permite sonicar de forma eficaz y cómoda hasta 10 viales simultáneamente. Dado que los viales y los tubos de ensayo (por ejemplo, viales Eppendorf, viales criogénicos, tubos de centrífuga) se sonican indirectamente, se evita cualquier contaminación cruzada. Como se aplica la misma intensidad de ultrasonido a cada muestra, todos los resultados de la sonicación son homogéneos y reproducibles. El VialTweeter ofrece todas las características inteligentes como nuestros otros dispositivos digitales (por ejemplo, menú inteligente, ajustes programables, control de la temperatura, control remoto, etc.) para garantizar la máxima comodidad del usuario.

Sondas multidedo para placas de micropocillos

4 probe heads or 4 sonotrodes for simultaneous sonication of 4 samples at the same intensity with the Hielscher 200 watts ultrasonicator models UP200ST and UP200HTDisponibles para los homogeneizadores de sonda ultrasónica UP200Ht y UP200St, las sondas multidedo con 4 u 8 dedos son una opción cómoda para sonicar varias muestras al mismo tiempo en las mismas condiciones. Por ejemplo, el sonotrodo MTP-24-8-96 es una sonda de ocho dedos, ideal para la integración en sistemas automatizados o para la eficiente preparación manual de muestras en los pocillos de placas multipocillo. El sonotrodo multidedo es ideal para los laboratorios automatizados, en los que se procesan principalmente vasos de precipitados y tubos de ensayo con un sonotrodo ultrasónico estándar. Las sondas multidedo y estándar se pueden intercambiar rápidamente en pocos minutos, transformando el ultrasonicador monosonda en un disruptor ultrasónico multi-sonda.

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Ultrasonidos Hielscher para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece varias plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas diferentes plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras en múltiples tubos o placas de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas de microtitulación), sonoreactores y cúpulas ultrasónicas. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN están equipadas con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento y frecuencia ajustada, que se pueden controlar con precisión y ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores de ultrasonidos para cualquier número y tamaño de muestra

Con los ultrasonidos multimuestra de Hielscher VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo) es posible reducir fácilmente el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtiene la distribución de tamaños de fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que la preparación de las muestras sea eficiente, fiable y escalable. Los protocolos pueden escalarse linealmente desde una hasta numerosas muestras aplicando ultrasonidos controlados constantemente.
Los ultrasonidos de sonda con uno a cinco dedos son ideales para la preparación de un número menor de muestras. Los ultrasonidos de laboratorio de Hielscher están disponibles en varios tamaños para que podamos recomendarle el dispositivo ideal para su aplicación y requisitos.

control de proceso exacto

Hielscher ultrasonicators can be remotely controlled via browser control. Sonication parameters can be monitored and adjusted precisely to the process requirements.Los ajustes de sonicación controlables con precisión son cruciales, ya que una sonificación exhaustiva puede destruir el ADN, el ARN y la cromatina, pero un cizallamiento ultrasónico inadecuado da lugar a fragmentos de ADN y cromatina demasiado largos. Los ultrasonidos digitales de Hielscher pueden ajustarse fácilmente con parámetros de sonicación precisos. Los ajustes de sonicación específicos también pueden guardarse como ajustes programados para repetir rápidamente el mismo procedimiento.
Todas las sonicaciones se protocolizan automáticamente y se almacenan como archivo CSV en una tarjeta SD integrada. Esto permite una documentación precisa de los ensayos realizados y hace posible la revisión de las ejecuciones de sonicación fácilmente.
Mediante el control remoto por navegador, todos los ultrasonidos digitales pueden manejarse y supervisarse a través de cualquier navegador estándar. No se requiere la instalación de software adicional, ya que una conexión LAN permite una configuración plug-n-play muy sencilla.

Máxima facilidad de uso en la preparación de muestras por ultrasonidos

Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para ofrecer ultrasonidos de alto rendimiento y, al mismo tiempo, son muy fáciles de usar y de manejar. Todos los ajustes están bien estructurados en un menú claro, al que se puede acceder fácilmente a través de la pantalla táctil de color o del mando a distancia del navegador. El software inteligente con ajustes programables y registro automático de datos garantiza unos ajustes de sonicación óptimos para obtener resultados fiables y reproducibles. La interfaz de menú limpia y fácil de usar convierte a los ultrasonidos de Hielscher en dispositivos fáciles de usar y eficientes.
La siguiente tabla le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonidos de laboratorio, que son ideales para tareas de preparación de muestras como la fragmentación de ADN y ARN, la lisis celular y la extracción de proteínas:

Dispositivo Potencia [W] Tipo Volumen [mL]
UIP400MTP 400 para microplacas 6 – 3456 pozos
VialTweeter 200 para hasta 10 viales más posibilidad de pinza 0,5 – 1,5
UP50H 50 Tipo sonda 0,01 – 250
UP100H 100 Tipo sonda 0,01 – 500
UP200Ht 200 Tipo sonda 0,1 – 1000
UP200St 200 Tipo sonda 0,1 – 1000
UP400St 400 Tipo sonda 5,0 – 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 – 200
GDmini2 200 Celda de flujo estéril

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The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

La unidad de preparación de muestras múltiples ultrasónicas VialTweeter permite la sonicación simultánea de hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción VialPress, se pueden presionar hasta 4 tubos adicionales en la parte delantera para una sonicación intensa.


El sonotrodo MTP-24-8-96 tiene ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pozos de las placas microtiter.

El sonotrodo MTP-24-8-96 tiene ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pozos de las placas microtiter.



Literatura / Referencias

Información interesante

¿Qué es la secuenciación de nueva generación?

La secuenciación de nueva generación, también llamada Next Gen Sequencing (NGS), secuenciación de alto rendimiento o secuenciación de segunda generación, se refiere al enfoque de la secuenciación paralela masiva, en la que se secuencian cantidades muy grandes (masivas) de ADN de millones de fragmentos simultáneamente en paralelo por carrera.
Para llevar a cabo una secuenciación de próxima generación, se deben realizar los tres pasos básicos de (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de la biblioteca, las cadenas de ADN deben fragmentarse en fragmentos de ADN de cierta longitud. La sonicación es una de las técnicas preferidas para fragmentar el ADN.
Durante el proceso de secuenciación del ADN, el orden de los nucleótidos en el ADN – conocida como secuencia del ácido nucleico - se determina. La secuencia del ácido nucleico está compuesta por cuatro bases nucleotídicas: adenina, citosina, guanina y timina. – cuyo código para la información.
La secuenciación de nueva generación está impulsando la investigación en las ciencias de la vida y la medicina personalizada, ya que la secuenciación de ADN y ARN se utiliza mucho en la investigación genómica, la investigación del cáncer, la investigación de enfermedades raras y complejas, la investigación microbiana, la agrigenómica y muchos otros campos de investigación.

Secuenciación de nueva generación frente a la secuenciación Sanger

Mientras que con la secuenciación de próxima generación (NGS) es posible secuenciar un número masivo de muestras genómicas, la secuenciación Sanger (también conocida como método de terminación en cadena o secuenciación de primera generación) sólo tiene capacidad para secuenciar un número reducido de muestras. La secuenciación Sanger sólo secuencia un único fragmento de ADN a la vez y puede realizarse en un solo día. Debido a su precisión, la secuenciación Sanger también se considera la tecnología de referencia, que se utiliza para verificar los resultados obtenidos por la secuenciación de próxima generación.
La secuenciación Sanger alcanza longitudes de lectura de aproximadamente 800 pb (normalmente 500-600 pb con ADN no enriquecido). Las longitudes de lectura más largas de la secuenciación Sanger presentan ventajas significativas sobre otros métodos de secuenciación, especialmente en lo que respecta a la secuenciación de regiones repetitivas del genoma. El reto de los datos de secuencias de lectura corta es particularmente un problema en la secuenciación de nuevos genomas (de novo) y en la secuenciación de segmentos del genoma altamente reordenados, típicamente los que se ven en los genomas del cáncer o en las regiones de los cromosomas que exhiben variación estructural. [cp. Morozova y Marra, 2008]


High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.