Fragmentación ultrasónica del ADN para la secuenciación de nueva generación
La secuenciación de nueva generación (NGS) requiere un cizallamiento y una fragmentación fiables del ADN genómico para secuenciar las hebras de ADN genómico y crear bibliotecas genómicas. La fragmentación controlada del ADN en fragmentos es una etapa esencial de la preparación de muestras que debe realizarse antes de secuenciar el ADN. La ultrasonicación ha demostrado ser una técnica eficiente y fiable para obtener fragmentos de ADN de una longitud determinada. Los protocolos de fragmentación ultrasónica del ADN permiten obtener resultados reproducibles. Los sonicadores de Hielscher pueden producir una amplia variedad de distribuciones de tamaños de fragmentos de ADN genómico, controlables con precisión mediante los parámetros de funcionamiento. Los sistemas de cizallamiento ultrasónico del ADN de Hielscher están disponibles para viales individuales, múltiples viales y microplacas, lo que permite preparar las muestras con gran eficiencia.
El sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento sonica uniformemente las muestras en placas multipocillo, placas de microtitulación y placas de 96 pocillos
- resultados repetibles / reproducibles
- ajuste preciso para obtener una longitud de fragmento determinada
- procesamiento rápido
- resultados uniformes de fragmentación del ADN
- equipos para cualquier volumen de muestra (p. ej., múltiples viales o microplacas)
- alta capacidad de procesamiento
- control preciso de la temperatura
- manejo sencillo e intuitivo
Secuenciación de nueva generación: fragmentación ultrasónica del ADN para la preparación de bibliotecas
Para realizar una secuenciación de nueva generación, deben completarse tres etapas básicas: (1) preparación de bibliotecas, (2) secuenciación y (3) análisis de datos. Durante la preparación de bibliotecas, el ADN se fragmenta; después, los extremos de los fragmentos se reparan (se pulen) añadiendo una única base de adenina, y los fragmentos de interés se convierten en ADN de doble cadena. Por último, se incorporan los denominados adaptadores mediante ligación, PCR o tagmentación, de modo que el producto final de ADN de la biblioteca pueda cuantificarse para la secuenciación.
Fragmentación del ADN mediante sonicación: Especialmente cuando se utilizan tecnologías de secuenciación de lecturas cortas, como Illumina, que no permiten leer fácilmente fragmentos de ADN más largos, las hebras de ADN deben fragmentarse hasta alcanzar un tamaño determinado, lo que puede lograrse de forma fiable mediante ultrasonicación.
La ultrasonicación puede utilizarse de forma fiable para fragmentar ADN, ARN y cromatina.
Secuenciación de nueva generación – Preparación de bibliotecas
La fragmentación ultrasónica del ADN se utiliza habitualmente para preparar bibliotecas de secuenciación de ADN destinadas a plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS). Esta técnica permite romper las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños dentro del intervalo de tamaños deseado, lo que facilita las etapas posteriores de preparación de bibliotecas. La fragmentación ultrasónica del ADN suele ser necesaria durante la etapa de preparación de bibliotecas de los flujos de trabajo de NGS para fragmentar el ADN genómico en segmentos más pequeños, adecuados para el procesamiento y la secuenciación posteriores. Desempeña un papel crucial para garantizar el éxito del experimento de secuenciación, ya que genera fragmentos de ADN dentro del intervalo de tamaños apropiado para la plataforma de secuenciación específica que se utiliza.
Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 – 15 min de ultrasonicación. L indica el marcador de tamaños de ADN. (Basselet et al. 2008)
Secuenciación de nueva generación – Etapas del proceso:
- Fragmentación ultrasónica del ADN: Antes de construir la biblioteca, el ADN genómico se fragmenta en segmentos más pequeños y manejables. La fragmentación ultrasónica utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para cizallar las moléculas de ADN y obtener fragmentos dentro del intervalo de tamaños deseado. Esta etapa es crucial porque ayuda a garantizar que las lecturas de secuenciación generadas posteriormente tengan una longitud apropiada para la plataforma de secuenciación utilizada. El intervalo de tamaños de los fragmentos puede ajustarse según los requisitos específicos del experimento de secuenciación.
- Amplificación clonal mediante PCR: Tras la fragmentación ultrasónica, los fragmentos de ADN se someten a reparación de extremos, ligación de adaptadores y amplificación por PCR para generar las bibliotecas finales de secuenciación de ADN. Estas etapas preparan las moléculas de ADN fragmentadas para el proceso de secuenciación mediante la incorporación de las secuencias adaptadoras necesarias para unirse a la plataforma de secuenciación y proporcionar sitios de unión de los cebadores para la amplificación por PCR.
- Secuenciación del ADN por síntesis: Una vez preparadas las bibliotecas de secuenciación, comienza el proceso de secuenciación del ADN por síntesis (SBS). Durante la SBS, la secuencia de ADN se determina mediante la adición secuencial de nucleótidos a la hebra complementaria. Esta etapa incluye ciclos de incorporación de nucleótidos, adquisición de imágenes y escisión, que permiten determinar la secuencia de ADN a partir de las señales fluorescentes emitidas por los nucleótidos incorporados.
- Secuenciación masivamente paralela: En la etapa final, los moldes de ADN amplificados y separados espacialmente se secuencian simultáneamente de forma masivamente paralela. Este enfoque de secuenciación de alto rendimiento permite generar entre millones y miles de millones de lecturas de secuenciación en una sola ejecución, lo que permite determinar las secuencias de ADN de forma eficiente y rápida.
¿Cómo funciona la fragmentación ultrasónica del ADN?
La sonicación, también conocida como procesamiento acústico de muestras, es un método ampliamente utilizado para fragmentar ADN. Para el cizallamiento ultrasónico del ADN, las muestras se exponen a ondas ultrasónicas en condiciones controladas. El principio de funcionamiento de la fragmentación ultrasónica del ADN se basa en las vibraciones y la cavitación generadas por las ondas ultrasónicas. Las fuerzas de cizallamiento resultantes de la cavitación ultrasónica (acústica) rompen las moléculas de ADN de alto peso molecular. Los ajustes de sonicación, como la intensidad (amplitud, duración), el modo de pulsación y la temperatura, permiten fragmentar el ADN con precisión hasta obtener fragmentos de una longitud determinada. Aunque mediante ultrasonicación el ADN suele reducirse a fragmentos de 100 a 600 bp, pueden obtenerse fragmentos de ADN más largos, de hasta 1300 bp, cuando se aplican condiciones ultrasónicas más suaves.
Cizallamiento ultrasónico del ADN durante la ChIP – inmunoprecipitación de cromatina
Adaptado de Jkwchui bajo CC-BY-SA.03
Control de la temperatura para evitar la degradación del ADN
La estructura molecular de doble cadena del ADN es muy sensible a las temperaturas elevadas, por lo que el control preciso de la temperatura durante las etapas de preparación de muestras es un factor crucial para obtener resultados analíticos fiables.
Tanto si utiliza los sonicadores de sonda de Hielscher como el VialTweeter o el UIP400MTP, la monitorización y el control continuos de la temperatura están garantizados gracias a un sensor de temperatura conectable y al software inteligente del equipo. Para mantener la temperatura dentro de un intervalo determinado, puede establecer un límite superior y otro inferior. En consecuencia, el sonicador se detendrá en cuanto se supere este límite de temperatura y reanudará automáticamente la sonicación cuando la temperatura haya descendido un ∆T predefinido.
El sofisticado software de los sonicadores de Hielscher garantiza el mantenimiento fiable de las condiciones ideales de tratamiento de las muestras.
Fragmentación del ADN en grandes cantidades de muestras con el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP
El número de muestras en las ciencias de la vida ha aumentado significativamente durante la última década. Esto significa que deben procesarse cantidades muy elevadas de muestras (p. ej., 384, 1536 o 3456 pocillos por microplaca) durante la preparación y el análisis, en condiciones constantemente iguales, para obtener resultados comparables y válidos. Con el UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics responde a la tendencia hacia el procesamiento de grandes cantidades de muestras. El UIP400MTP es un sonicador para la preparación de muestras en microplacas. El UIP400MTP puede procesar placas de 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pocillos. Según el tipo de microplaca, cada pocillo suele admitir volúmenes de muestra que van desde decenas de nanolitros hasta varios mililitros. Ampliamente utilizado en la investigación en ciencias de la vida, el UIP400MTP se emplea con mucha frecuencia para preparar muestras antes de ensayos como ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas) o PCR, antes del análisis de proteínas y para preparar cromatina antes de CHiP y CHiP-seq, identificar modificaciones de histonas y realizar otros tratamientos analíticos (p. ej., electroforesis en gel, espectrometría de masas).
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El VialTweeter para la preparación de muestras en hasta 10 viales
El VialTweeter es un sonicador de laboratorio VialTweeter ampliamente utilizado que permite sonicar hasta 10 viales simultáneamente de forma eficaz y cómoda. Como los viales y los tubos de ensayo (p. ej., viales Eppendorf, crioviales y tubos de centrifugación) se sonican indirectamente, se evita cualquier contaminación cruzada. Dado que cada muestra recibe la misma intensidad ultrasónica, todos los resultados de sonicación son homogéneos y reproducibles. El VialTweeter ofrece todas las funciones inteligentes de nuestros otros equipos digitales (p. ej., menú inteligente, ajustes programables, control de temperatura, control remoto, etc.), lo que garantiza la máxima comodidad de uso.
Sondas de múltiples dedos para placas de micropocillos
Disponibles para los homogeneizadores ultrasónicos de sonda UP200Ht y UP200St, las sondas de múltiples dedos con 4 u 8 dedos son una opción cómoda para sonicar varias muestras al mismo tiempo y en las mismas condiciones. Por ejemplo, el sonotrodo MTP-24-8-96 es una sonda de ocho dedos ideal para integrarse en sistemas automatizados o para preparar manualmente y de forma eficiente las muestras de los pocillos de placas multipocillo. El sonotrodo de múltiples dedos es ideal para la automatización en laboratorios donde se procesan principalmente vasos de precipitados y tubos de ensayo con un sonotrodo ultrasónico estándar. Las sondas de múltiples dedos y las sondas estándar pueden intercambiarse rápidamente en pocos minutos, transformando el sonicador de una sola sonda en un disruptor ultrasónico de múltiples sondas.
Sonicadores de Hielscher para la fragmentación del ADN
Hielscher Ultrasonics ofrece diversas plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras en múltiples tubos o placas multipocillo (p. ej., placas de 96 pocillos y placas de microtitulación), sonorreactores y sistemas ultrasónicos de copa. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN funcionan con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento ajustados en frecuencia, que pueden controlarse con precisión y proporcionan resultados reproducibles.
Procesadores ultrasónicos para cualquier cantidad y tamaño de muestra
Los sonicadores de Hielscher para múltiples muestras, VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas / placas multipocillo), permiten reducir el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtienen la distribución de tamaños de fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que la preparación de muestras sea eficiente, fiable y escalable. Los protocolos pueden escalarse linealmente desde una muestra hasta numerosas muestras mediante la aplicación de ultrasonidos controlados de forma constante.
Los sonicadores de sonda con uno a cinco dedos son ideales para preparar cantidades menores de muestras. Los sonicadores de laboratorio de Hielscher están disponibles en varios tamaños, por lo que podemos recomendarle el equipo ideal para su aplicación y sus requisitos.
Control preciso del proceso
Los ajustes de sonicación controlables con precisión son cruciales, ya que una sonification excesiva puede destruir el ADN, el ARN y la cromatina, mientras que un cizallamiento ultrasónico insuficiente produce fragmentos de ADN y cromatina demasiado largos. Los sonicadores digitales de Hielscher pueden configurarse fácilmente con parámetros de sonicación precisos. Los ajustes específicos de sonicación también pueden guardarse como configuraciones programadas para repetir rápidamente el mismo procedimiento.
Todos los procesos de sonicación se registran automáticamente y se guardan como archivos CSV en una tarjeta SD integrada. Esto permite documentar con exactitud los ensayos realizados y revisar fácilmente las ejecuciones de sonicación.
Mediante el control remoto por navegador, todos los sonicadores digitales pueden manejarse y monitorizarse desde cualquier navegador estándar. No es necesario instalar software adicional, ya que una conexión LAN permite una configuración muy sencilla mediante conexión y uso inmediato.
Máxima facilidad de uso en la preparación ultrasónica de muestras
Todos los sonicadores de Hielscher están diseñados para proporcionar ultrasonidos de alto rendimiento y, al mismo tiempo, ofrecer siempre un manejo sencillo e intuitivo. Todos los ajustes están bien estructurados en un menú claro, al que se puede acceder fácilmente mediante una pantalla táctil en color o el control remoto por navegador. El software inteligente, con ajustes programables y registro automático de datos, garantiza unos ajustes de sonicación óptimos para obtener resultados fiables y reproducibles. La interfaz de menú clara y fácil de usar convierte los sonicadores de Hielscher en equipos intuitivos y eficientes.
La tabla siguiente ofrece una indicación de la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros sonicadores de laboratorio, ideales para tareas de preparación de muestras como la fragmentación de ADN y ARN, la lisis celular y la extracción de proteínas:
| Equipo | Potencia [W] | Tipo | Volumen [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | para microplacas | 6 – 3456 pocillos | VialTweeter | 200 | para hasta 10 viales, con posibilidad adicional de sujeción por presión | 0,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | de sonda | 0,01 – 250 |
| UP100H | 100 | de sonda | 0,01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | de sonda | 0,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | de sonda | 0,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | de sonda | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonorreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | celda de flujo sin contaminación |
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La unidad ultrasónica de preparación de múltiples muestras VialTweeter permite sonicar simultáneamente hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción por presión VialPress, pueden presionarse hasta 4 tubos adicionales contra la parte frontal para una sonicación intensa.
El sonotrodo MTP-24-8-96 tiene ocho sondas ultrasónicas para la sonicación de los pocillos de placas de microtitulación.
Bibliografía / Referencias
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
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Información de interés
¿Qué es la secuenciación de nueva generación?
La secuenciación de nueva generación (NGS), también denominada secuenciación de alto rendimiento o secuenciación de segunda generación, se refiere al enfoque de secuenciación masivamente paralela, en el que se secuencian simultáneamente y en paralelo cantidades muy grandes (masivas) de ADN de millones de fragmentos en cada ejecución.
Para realizar una secuenciación de nueva generación, se requieren las tres etapas básicas de
- preparación de bibliotecas,
- secuenciación y
- análisis de datos
para llevar a cabo el proceso.
Durante la preparación de bibliotecas, las hebras de ADN deben fragmentarse en fragmentos de una longitud determinada. La sonicación es una de las técnicas preferidas para fragmentar ADN.
Durante el proceso de secuenciación del ADN, se determina el orden de los nucleótidos en el ADN, conocido como secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico está compuesta por cuatro bases nucleotídicas – adenina, citosina, guanina y timina – que codifican información.
La secuenciación de nueva generación impulsa la investigación en ciencias de la vida y la medicina personalizada, ya que la secuenciación de ADN y ARN se utiliza ampliamente en investigación genómica, investigación oncológica, investigación de enfermedades raras y complejas, investigación microbiana, genómica agraria y muchos otros campos de investigación.
Secuenciación de nueva generación frente a secuenciación de Sanger
Mientras que la secuenciación de nueva generación (NGS) permite secuenciar cantidades masivas de muestras genómicas, la secuenciación de Sanger (también conocida como método de terminación de cadena o secuenciación de primera generación) solo permite secuenciar cantidades pequeñas de muestras. La secuenciación de Sanger secuencia un único fragmento de ADN cada vez y puede completarse en un solo día. Debido a su exactitud, la secuenciación de Sanger también se considera la tecnología de referencia, utilizada para verificar los resultados obtenidos mediante secuenciación de nueva generación.
La secuenciación de Sanger alcanza longitudes de lectura de aproximadamente 800bp (normalmente 500–600bp con ADN no enriquecido). Las mayores longitudes de lectura de la secuenciación de Sanger ofrecen ventajas significativas frente a otros métodos de secuenciación, especialmente para secuenciar regiones repetitivas del genoma. Las limitaciones de los datos de secuenciación de lecturas cortas plantean dificultades especialmente al secuenciar nuevos genomas (de novo) y segmentos genómicos con numerosos reordenamientos, como los que suelen observarse en los genomas de cáncer o en regiones cromosómicas que presentan variación estructural. [cp. Morozova and Marra, 2008]
ADN – Ácido desoxirribonucleico – Sus formas y funciones
Cada forma de ADN tiene características y aplicaciones únicas que contribuyen a un amplio espectro de campos de investigación, como la oncología, la genética, las ciencias forenses y la biología evolutiva. Los sonicadores de Hielscher son una solución muy eficiente y fiable para aislar y fragmentar ADN y ARN con fines analíticos. En la lista siguiente explicamos las formas específicas de ADN y las clasificamos según su contexto biológico y sus funciones:
- ADN genómico (gDNA)
ADN genómico (gDNA): El conjunto completo de ADN de un organismo, que incluye tanto las regiones codificantes (genes) como las no codificantes. - ADN extracelular
ADN tumoral circulante (ctDNA): Fragmentos de ADN liberados al torrente sanguíneo por las células tumorales.
ADN libre de células (cfDNA): Fragmentos de ADN que circulan libremente por el torrente sanguíneo y proceden de diversos tejidos. - ADN circular extracromosómico (eccDNA): Moléculas circulares de ADN que se encuentran fuera de los cromosomas en las células eucariotas.
ADN viral: ADN procedente de virus, integrado en el genoma del huésped o presente como ADN episómico. - ADN mitocondrial
ADN mitocondrial (mtDNA): ADN localizado en las mitocondrias, heredado por vía materna e implicado en la producción de energía. - ADN plasmídico
ADN plasmídico: Pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican de forma independiente del ADN cromosómico, presentes habitualmente en bacterias y utilizadas en ingeniería genética. - ADN nuclear
ADN nuclear (nDNA): ADN contenido en el núcleo de las células eucariotas, que constituye la mayor parte del material genético de un organismo. - ADN de una sola célula
ADN de una sola célula (scDNA): ADN extraído de una sola célula, utilizado para realizar análisis genómicos detallados a nivel de célula individual. - ADN recombinante
ADN recombinante (rDNA): Moléculas de ADN formadas mediante métodos de recombinación genética en el laboratorio para reunir material genético de múltiples fuentes. - Formas especializadas
ADN ambiental (eDNA): ADN recogido de muestras ambientales (suelo, agua) sin aislar los organismos de origen
ADN antiguo (aDNA): ADN extraído de especímenes antiguos que aporta información sobre la biología evolutiva y las poblaciones antiguas. - ADN cromosómico
ADN cromosómico: ADN que constituye los cromosomas dentro del núcleo celular y abarca tanto las regiones codificantes como las no codificantes. - Formas virales y sintéticas
ADN viral: ADN procedente de virus, que puede estar integrado en los genomas de los huéspedes o existir como entidades independientes.
ADN sintético: Secuencias de ADN sintetizadas artificialmente mediante procesos químicos, utilizadas con frecuencia en investigación y biotecnología.
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento, desde equipos de laboratorio hasta escala industrial.