Protocolo de inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 mediante sonicación

El VialTweeter de Hielscher es una unidad ultrasónica única para la preparación de múltiples muestras que se utiliza para inactivar el coronavirus SARS-COV-2. El VialTweeter permite preparar hasta 10 viales de muestras simultáneamente, por lo que es la unidad ideal para el procesamiento masivo de muestras.

Inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 con el VialTweeter

Tras retirar el fijador, las monocapas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de recoger las células por raspado en 1 mL de MEM/5% FBS y someterlas a sonicación (3 × 10 segundos de activación, 10 segundos de pausa al 100% de potencia y amplitud) utilizando el procesador ultrasónico de Hielscher UP200St con VialTweeter como accesorio. Los sobrenadantes se clarificaron mediante centrifugación a 3000 × g durante 10 mins. A continuación puede consultar el protocolo completo de inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 de Welch et al. (2020):

Células y virus

Las células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) se cultivaron en medio mínimo esencial de Eagle modificado (MEM), suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FCS). El virus utilizado fue la cepa hCOV-19/England/2/2020 de SARS-CoV-2, aislada por PHE del primer grupo de pacientes del Reino Unido el 29/01/2020. Este virus se obtuvo en el pase 1 y se utilizó para los estudios de inactivación en el pase 2 o 3.
Para obtener información sobre los reactivos y las sustancias químicas utilizados para la inactivación de SARS-CoV-2, así como sobre la eliminación de la citotoxicidad de los reactivos, consulte el informe científico de Welch et al. (2020).

Inactivación de virus mediante detergentes – Protocolo de inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 de Welch et al. 2020

Inactivación de SARS-CoV-2


En el caso de los productos comerciales, las preparaciones de virus (líquido de cultivo de tejidos, con títulos comprendidos entre 1 × 10⁶ y 1 × 10⁸ PFU/ml) se trataron por triplicado con reactivos a las concentraciones y durante los tiempos de contacto recomendados en las instrucciones de uso del fabricante, cuando estaban disponibles, o a las concentraciones y durante los tiempos solicitados específicamente por los laboratorios de ensayo. Cuando el fabricante indicaba un intervalo de concentraciones, se ensayó la menor proporción de producto respecto a la muestra (es decir, la concentración mínima recomendada del producto ensayado). Los reactivos de los tubos de transporte de muestras se ensayaron utilizando una proporción de un volumen de líquido de cultivo de tejidos por diez volúmenes de reactivo, salvo que el fabricante especificara una proporción volumétrica entre el líquido de la muestra y el reactivo. Los detergentes, fijadores y disolventes se ensayaron a las concentraciones indicadas durante los tiempos indicados. Todas las etapas de inactivación se realizaron a temperatura ambiente (18 – 25 °C). Para ensayar tipos de muestras alternativos, se añadió el virus a la matriz de muestra indicada en una proporción de 1:9 y, a continuación, se trató con los reactivos de ensayo como se ha descrito anteriormente. Todos los experimentos incluyeron, por triplicado, muestras de control sometidas a un tratamiento simulado con un volumen equivalente de PBS en lugar del reactivo de ensayo. Inmediatamente después del tiempo de contacto requerido, se procesó 1 mL de muestra tratada utilizando la matriz de filtración seleccionada adecuadamente. La eliminación de reactivos para los ensayos de inactivación se realizó en un formato de columna de centrifugación de mayor tamaño, utilizando Pierce 4 mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), o rellenando columnas de centrifugación Pierce vacías de 10 mL de capacidad (Thermo Fisher) con SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR o Sephadex LH-20 hasta obtener 4 mL de perlas/resina compactadas. Para la purificación con filtros Amicon, se purificaron 2 × 500μl de muestra utilizando dos filtros centrífugos mediante el método descrito anteriormente y, después, se combinaron. Para la eliminación de formaldehído y de formaldehído con glutaraldehído, se utilizó un filtro con un volumen de muestra de 1× 500μl que, tras el procesamiento, se resuspendió en 500μl de PBS y se añadió a 400ul de MEM/5% FBS. Para la inactivación de monocapas infectadas, se utilizaron matraces de 12,5 cm² con células Vero E6 (2,5 × 10⁶ células/matraz en 2,5 mL de MEM/5% FBS), que se infectaron a una MOI de 0,001 y se incubaron a 37 °C/5% CO₂ durante 24 horas. Se retiró el sobrenadante y se fijaron las células utilizando 5 mL de formaldehído, o de formaldehído y glutaraldehído, a temperatura ambiente durante 15 o 60 mins. Se retiró el fijador y las monocapas se lavaron tres veces con PBS antes de recoger las células por raspado en 1 mL de MEM/5% FBS y someterlas a sonicación (3 × 10 segundos de activación, 10 segundos de pausa al 100% de potencia y amplitud) utilizando un UP200St con el accesorio VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Los sobrenadantes se clarificaron mediante centrifugación a 3000 × g durante 10 mins.


Detalles del reactivo utilizado para la inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 con el VialTweeter ultrasónico según el protocolo de Welch et al. 2020

El protocolo completo, que incluye el uso del VialTweeter de Hielscher, puede consultarse aquí:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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