Protocolo de inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 con sonicación
El VialTweeter de Hielscher es una unidad ultrasónica única de preparación de múltiples muestras, que se utiliza para inactivar el coronavirus SARS-COV-2. El VialTweeter permite preparar hasta 10 viales de muestra simultáneamente, por lo que es la unidad ideal para el procesamiento masivo de muestras.
Inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 con el VialTweeter
Tras retirar el fijador, las monocapas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de raspar las células en 1mL de MEM/5% de FBS y sonicarlas (3 × 10 segundos encendido, 10 segundos apagado al 100% de potencia y amplitud) utilizando el procesador ultrasónico Hielscher UP200St con VialTweeter fijación. Los sobrenadantes se clarificaron centrifugándolos a 3000 × g durante 10 minutos. Lea aquí el protocolo completo para la inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 por Welch et al. (2020):
Células y virus
Las células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) se cultivaron en medio esencial mínimo modificado de Eagle (MEM) suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal de ternera (FCS). El virus utilizado fue la cepa hCOV-19/England/2/2020 de SARS-CoV-2, aislada por PHE del primer grupo de pacientes en el Reino Unido el 29/01/2020. Este virus se obtuvo en el pasaje 1 y se utilizó para estudios de inactivación en los pasajes 2 ó 3.
Para los reactivos y productos químicos utilizados para la inactivación del SARS-CoV-2, así como para la eliminación de la citotoxicidad de los reactivos, véase el informe científico de Welch et al. (2020).

Inactivación del virus mediante detergentes – Protocolo de inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 por Welch et al. 2020
Inactivación del SARS-CoV-2
Para los productos comerciales, las preparaciones víricas (líquido de cultivo tisular, títulos comprendidos entre 1 × 106 a 1 × 108 PFU/ml) se trataron por triplicado con reactivos a las concentraciones y durante los tiempos de contacto recomendados en las instrucciones de uso de los fabricantes, cuando estaban disponibles, o a las concentraciones y tiempos solicitados específicamente por los laboratorios de ensayo. Cuando el fabricante indicó una gama de concentraciones, se probó la proporción más baja de producto a muestra (es decir, la concentración más baja recomendada de producto de prueba). Los reactivos para tubos de transporte de muestras se probaron utilizando una proporción de un volumen de líquido de cultivo tisular por cada diez volúmenes de reactivo, a menos que el fabricante especificara una proporción de volumen de líquido de muestra por reactivo. Los detergentes, fijadores y disolventes se probaron a las concentraciones indicadas durante los tiempos indicados. Todos los pasos de inactivación se realizaron a temperatura ambiente (18 - 25°C). Para las pruebas de tipos de muestras alternativas, se introdujo el virus en la matriz de muestra indicada en una proporción de 1:9, y después se trató con reactivos de prueba como se ha indicado anteriormente. Todos los experimentos incluyeron muestras de control por triplicado tratadas con un volumen equivalente de PBS en lugar del reactivo de prueba. Inmediatamente después del tiempo de contacto requerido, se procesó 1mL de muestra tratada utilizando la matriz de filtración seleccionada adecuadamente. La eliminación del reactivo para las pruebas de inactivación se llevó a cabo en un formato de columna de centrifugación más grande utilizando columnas de centrifugación Pierce de eliminación de detergente de 4mL (Thermo Fisher), o llenando columnas de centrifugación Pierce vacías de 10mL de capacidad (Thermo Fisher) con SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR o Sephadex LH-20 para obtener 4mL de perlas/resina empaquetadas. Para la purificación utilizando filtros Amicon, se purificaron 2 × 500μl de muestras utilizando dos filtros centrífugos por el método descrito anteriormente, y luego se agruparon. Para la eliminación de formaldehído y formaldehído con glutaraldehído, se utilizó un filtro con 1 × 500μl de volumen de muestra, se resuspendió tras el procesamiento en 500μl de PBS y se añadió a 400ul de MEM/5% de FBS. Para la inactivación de las monocapas, 12,5 cm2 matraces de células Vero E6 (2,5 × 106 en 2,5 ml de MEM/5% de FBS) se infectaron con una MOI de 0,001 y se incubaron a 37°C/5% de CO2 durante 24 horas. Se eliminó el sobrenadante y las células se fijaron con 5 ml de formaldehído o formaldehído y glutaraldehído a temperatura ambiente durante 15 o 60 minutos. Se eliminó el fijador y las monocapas se lavaron tres veces con PBS antes de raspar las células en 1mL de MEM/5% de FBS y sonicarlas (3 × 10 segundos encendido, 10 segundos apagado al 100% de potencia y amplitud) utilizando un UP200St con accesorio VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Los sobrenadantes se clarificaron centrifugándolos a 3000 × g durante 10 minutos.

Detalles del reactivo utilizado para la inactivación del coronavirus SARS-CoV-2 con el VialTweeter ultrasónico según el protocolo de Welch et al. 2020
El protocolo completo, incluido el uso del VialTweeter de Hielscher, puede consultarse aquí:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.
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Literatura / Referencias
- Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology 58(11), 2020.
- Natacha S. Ogando; Tim J. Dalebout; Jessika C. Zevenhoven-Dobbe; Ronald W. Limpens; Yvonne van der Meer; Leon Caly; Julian Druce; Jutte J. C. de Vries; Marjolein Kikkert; Montserrat Bárcena; Igor Sidorov; Eric J. Snijder (2020): SARS-coronavirus-2 replication in Vero E6 cells: replication kinetics, rapid adaptation and cytopathology. bioRxiv posted 20 April 2020.
Información interesante
¿Qué son las células Vero?
Vero E6, también conocida como Vero C1008 (ATCC n.º CRL-1586) es una línea celular clonada de Vero 76 y se utiliza en la investigación de los coronavirus SARS-CoV y SARS-CoV-2. Las células Vero son un linaje de células utilizadas en cultivos celulares. Las células 'Vero’ se aisló a partir de células epiteliales de riñón extraídas de un mono verde africano (Chlorocebus sp.).
Las células Vero E6 muestran cierta inhibición de contacto, por lo que son adecuadas para propagar virus que se replican lentamente. Las líneas celulares Vero E6 se utilizan habitualmente para investigar la citopatología de los coronavirus SARS-CoV y SARS-CoV-2, ya que las células Vero (células de riñón de mono verde africano) presentan una abundante expresión de receptores de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Los receptores ACE2 son un importante sitio de acoplamiento para el coronavirus SARS-CoV-2.
Por ejemplo, Ogando et al. (2020) descubrieron que el SARS-CoV-2 – en comparación con el SARS-CoV – generaron niveles más altos de ARN viral intracelular, pero sorprendentemente se recuperó del medio de cultivo una progenie viral infecciosa 50 veces menor. Además, determinaron que la sensibilidad de los dos virus a tres inhibidores establecidos de la replicación de coronavirus (Remdesivir, Alisporivir y cloroquina) es muy similar, pero que la infección por SARS-CoV-2 era sustancialmente más sensible al pretratamiento de las células con interferón alfa pegilado. Una diferencia importante entre los dos virus es el hecho de que – en células Vero E6 – Al parecer, el SARS-CoV-2 está sometido a una fuerte presión de selección para adquirir mutaciones adaptativas en su gen de la proteína spike. Estas mutaciones cambian o eliminan un supuesto "sitio de corte tipo furina" en la región que conecta los dominios S1 y S2 y dan lugar a un cambio fenotípico muy prominente en los ensayos de placa.