Lisis celular de células BL21 por ultrasonidos

Las células BL21 son una cepa de E. coli muy utilizada en laboratorios de investigación, biotecnología y producción industrial debido a su capacidad para expresar proteínas con gran eficacia. La disrupción celular por ultrasonidos, la lisis y la extracción de proteínas es el método habitual para aislar y recoger las proteínas objetivo del interior celular de las células BL21. La ultrasonicación desorganiza completamente la célula y libera todas las proteínas atrapadas, haciendo que el 100% de la proteína esté disponible.

Células BL21 para la expresión de proteínas

Las bacterias E. coli, como las células BL21, se suelen lisar por ultrasonidos para liberar las proteínas expresadas, como las proteínas recombinantes.La célula BL21 es una cepa bacteriana E. coli químicamente competente, adecuada para la transformación y la expresión proteica de alto nivel mediante un sistema de inducción T7 ARN polimerasa-IPTG. Las células BL21 permiten la expresión proteica de alta eficiencia de cualquier gen que esté bajo el control de un promotor T7. La cepa BL21(DE3) de E. coli es una cepa de producción de proteínas basada en la ARN polimerasa T7 combinada con vectores de expresión basados en el promotor T7 y se aplica ampliamente en laboratorios y en la industria para producir proteínas recombinantes. En BL21(DE3), la expresión del gen que codifica la proteína recombinante es transcrita por la ARN polimerasa T7 codificada cromosómicamente (T7 RNAP), que transcribe ocho veces más rápido que la RNAP convencional de E. coli. Esto hace que la cepa BL21(DE3) sea altamente eficiente y la convierte en uno de los sistemas celulares de expresión de proteínas más preferidos.

Protocolo de lisis ultrasónica y extracción de proteínas de células BL21

La lisis celular de las células BL21 se realiza principalmente utilizando ultrasonidos en combinación con lauroil sarcosinato sódico (también conocido como sarkosil) como tampón de lisis. Las ventajas de la disrupción celular y la extracción de proteínas por ultrasonidos residen en la fiabilidad, la reproducibilidad y el funcionamiento sencillo, seguro y rápido de los ultrasonicadores. El protocolo que figura a continuación describe paso a paso la lisis de células BL21 por ultrasonidos:

  • Para eliminar las proteínas chaperonas, los pellets de bacterias BL21 se resuspendieron en 50 ml de tampón Tris-EDTA sódico (STE) helado (compuesto por 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl complementado con 100 mM PMSF).
  • A continuación, se añaden 500 ul de lisozima (10 mg/ml) y se incuban las células en hielo durante 15 min.
  • A continuación, se añaden 500 ul de DTT y 7 ml de sarkosil (10% (p/v) en tampón STE).
  • Es esencial mantener todos los tampones de purificación helados y mantener las muestras en hielo todo el tiempo. Todos los pasos de purificación deben realizarse en la cámara frigorífica si es posible.
  • VialTweeter en el procesador ultrasónico UP200ST

  • Para la lisis ultrasónica y la extracción de proteínas, las muestras se sonican en el VialTweeter Ultrasonicador multimuestra durante 4 x 30 s al 100% de amplitud con un intervalo de 2 min entre cada sonicación. Alternativamente, un homogeneizador ultrasónico tipo sonda con micro-punta e.g., UP200Ht con S26d2 (3 x 30 seg, 2 min. de pausa entre ciclos ultrasónicos, 80% de amplitud).
  • Para los siguientes pasos de purificación, las muestras deben mantenerse en hielo o, alternativamente, almacenarse a -80°C hasta su posterior procesamiento.
Insonificador tipo sonda UP200St para lisis

Disruptor celular ultrasónico UP200St con micro-punta S26d2 para lisis y extracción de proteínas

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Lisis ultrasónica con control preciso de la temperatura

El control preciso y fiable de la temperatura es crucial a la hora de manipular muestras biológicas. Las altas temperaturas inician la degradación de proteínas inducida térmicamente en las muestras.
Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse bien cuando se utiliza el VialTweeter. Le presentamos varias opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con el VialTweeter y la VialPress para su análisis.

  1. Control de la temperatura de la muestra: El procesador ultrasónico UP200St, que acciona el VialTweeter, está equipado con un software inteligente y un sensor de temperatura enchufable. Conecte el sensor de temperatura al UP200St e inserte la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. A través de la pantalla táctil digital en color, puede establecer en el menú del UP200St un rango de temperatura específico para la sonicación de su muestra. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y hará una pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda hasta el valor inferior del ∆ de temperatura establecido. A continuación, la sonicación se reinicia automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
  2. El bloque VialTweeter puede ser pre-enfriado. Colocar el bloque VialTweeter (¡sólo el sonotrodo sin transductor!) en el frigorífico o congelador para preenfriar el bloque de titanio ayuda a posponer el aumento de temperatura en la muestra. Si es posible, también se puede preenfriar la propia muestra.
  3. Utilice hielo seco para enfriar durante la sonicación. Utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo para que el calor pueda disiparse rápidamente.

Clientes de todo el mundo utilizan VialTweeter y VialPress para su trabajo diario de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura del procesador UP200St, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. La preparación ultrasónica de muestras con el VialTweeter y la VialPress proporciona resultados altamente fiables y reproducibles.
 

Este tutorial explica qué tipo de sonicador es el mejor para sus tareas de preparación de muestras como lisis, disrupción celular, aislamiento de proteínas, fragmentación de ADN y ARN en laboratorios, análisis e investigación. Elija el tipo de sonicador ideal para su aplicación, volumen de muestra, número de muestras y rendimiento. Hielscher Ultrasonics tiene el homogeneizador ultrasónico ideal para usted.

Cómo encontrar el sonicador perfecto para la disrupción celular y la extracción de proteínas en ciencia y análisis

Vídeo en miniatura

 

Encuentre el disruptor ultrasónico óptimo para su aplicación de lisis

Los ultrasonidos de Hielscher pueden controlarse a distancia mediante un navegador. Los parámetros de sonicación pueden supervisarse y ajustarse con precisión a los requisitos del proceso.Hielscher Ultrasonics es un experimentado fabricante de disruptores celulares y homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para laboratorios y sistemas de sobremesa y a escala industrial. El tamaño de su cultivo de células bacterianas, su objetivo de investigación o producción y el volumen de células a procesar por hora o día son factores esenciales para encontrar el disruptor celular ultrasónico adecuado para su aplicación.
Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para la sonicación simultánea de múltiples muestras (hasta 10 viales con el VialTweeter) y muestras masivas (por ejemplo, placas microtiter / placas ELISA con el UIP400MTP), así como el clásico ultrasonicador de laboratorio tipo sonda con diferentes niveles de potencia de 50 a 400 vatios hasta procesadores ultrasónicos totalmente industriales con hasta 16.000 vatios por unidad para la disrupción celular comercial y la extracción de proteínas en grandes producciones. Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para funcionar a plena carga las 24 horas del día, los 7 días de la semana y los 365 días del año. La robustez y la fiabilidad son características esenciales de nuestros dispositivos ultrasónicos.
Todos los homogeneizadores ultrasónicos digitales están equipados con software inteligente, pantalla táctil de color y protocolling automático de datos, que hacen que el dispositivo ultrasónico en una herramienta de trabajo conveniente en las instalaciones de laboratorio y de producción.
Díganos qué tipo de células, qué volumen, con qué frecuencia y con qué objetivo tiene que procesar sus muestras biológicas. Le recomendaremos el disruptor celular ultrasónico más adecuado para los requisitos de su proceso.

La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas ultrasónicos, desde homogeneizadores manuales compactos y ultrasonidos multimuestra hasta procesadores ultrasónicos industriales para aplicaciones comerciales:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
Placas de 96 pocillos / microtitulación n.a. UIP400MTP
10 viales de 0,5 a 1,5 ml n.a. VialTweeter en UP200St
0De 0,01 a 250 ml 5 a 100mL/min UP50H
0.01 a 500mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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La fragmentación ultrasónica del ADN es una técnica fiable y eficaz utilizada habitualmente para la disrupción celular de proteínas, el aislamiento y la fragmentación del ADN en la secuenciación de próxima generación (NGS)

Sonicator de placas UIP400MTP para la disrupción celular de alto rendimiento en placas de 96 pocillos

 
 

Ultrasonicador UP200Ht con microtip S26d2 para lisis ultrasónica de muestras biológicas

Ultrasonicador UP200Ht con microtip de 2 mm S26d2 para la sonicación de muestras pequeñas

 
Obtenga más información sobre cómo puede utilizar su homogeneizador ultrasónico de tejidos para la preparación eficaz y fiable de soluciones tampón.
 



Información interesante

Bacteria Escherichia Coli

Escherichia coli es un tipo de bacteria no formadora de esporas, Gram negativa y caracterizada por su forma de bastón recto. La bacteria E. coli está presente en el medio ambiente, los alimentos y los intestinos de humanos y animales. E. coli suele ser móvil mediante flagelos peritricosos, pero también hay tipos no móviles. Las E. coli son organismos quimioorganótrofos anaerobios facultativos, lo que significa que son capaces tanto de metabolismo respiratorio como fermentativo. La mayoría de los tipos de E. coli son benignos y desempeñan funciones útiles en el organismo, como suprimir el crecimiento de especies bacterianas nocivas, sintetizar vitaminas, etc.
Las células bacterianas de Escherichia coli del llamado tipo B son una categoría especial de cepas de E.coli, muy utilizadas en investigación para estudiar mecanismos como la sensibilidad a los bacteriófagos o los sistemas de modificación por restricción. Además, las bacterias E.coli se valoran como un caballo de batalla fiable para la expresión de proteínas en laboratorios de biotecnología y ciencias de la vida. Por ejemplo, E. coli se utiliza para sintetizar compuestos como proteínas y oligosacáridos a escala industrial. Debido a características específicas como la deficiencia de proteasas, la baja producción de acetato a un alto nivel de glucosa y una mayor permeabilidad, las células B de E. coli son las células huésped más utilizadas para la producción de proteínas genéticamente modificadas.

Proteína recombinante

Las proteínas recombinantes (rProt) están adquiriendo una importancia significativa en múltiples sectores, como la producción química, la industria farmacéutica, la cosmética, la medicina humana y animal, la agricultura, la alimentación y el tratamiento de residuos.
La producción de proteínas recombinantes requiere el uso de un sistema de expresión. Como sistemas celulares de expresión para la producción de ADN recombinante, pueden utilizarse tanto células procariotas como eucariotas. Aunque las células bacterianas son las más utilizadas para la expresión de proteínas debido a factores como su bajo coste, su fácil escalabilidad y la sencillez de las condiciones de los medios, los sistemas de mamíferos, levaduras, algas, insectos y libres de células son alternativas consolidadas. El tipo de proteína, la actividad funcional y el rendimiento requerido de la proteína expresada influyen en la selección del sistema celular utilizado para la expresión de proteínas.
Para expresar una proteína recombinante, es necesario transfectar una célula determinada con un vector de ADN que contenga la plantilla del ADN recombinante. A continuación, se cultivan las células transfectadas con la plantilla. Como consecuencia del mecanismo celular, las células transcriben y traducen la proteína de interés, produciendo así la proteína objetivo.
Como las proteínas expresadas están atrapadas en la matriz celular, la célula debe lisarse (desorganizarse y romperse) para liberar las proteínas. En un paso posterior de purificación, la proteína se separa y se purifica.
La primera proteína recombinante utilizada en un tratamiento fue la insulina humana recombinante en 1982. Hoy en día se producen en todo el mundo más de 170 tipos de proteínas recombinantes para tratamientos médicos. Las proteínas recombinantes más utilizadas en medicina son, por ejemplo, hormonas recombinantes, interferones, interleucinas, factores de crecimiento, factores de necrosis tumoral, factores de coagulación de la sangre, fármacos trombolíticos y enzimas para el tratamiento de enfermedades graves como diabetes enanismo, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, apoplejía cerebral, esclerosis múltiple, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatitis, artritis reumatoide, asma, enfermedad de Crohn y terapias contra el cáncer. (cf. Phuc V. Pham, en Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)


Literatura / Referencias

VialTweeter en el procesador ultrasónico UP200ST

Sonicador VialTweeter para la sonicación simultánea de 10 muestras, por ejemplo, para disgregar células BL21


Hielscher Ultrasonics suministra homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento desde tamaño de laboratorio hasta industrial.

Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonicador compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

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