Lisis de células BL21 mediante ultrasonicación
Las células BL21 constituyen una cepa de E. coli ampliamente utilizada en laboratorios de investigación, biotecnología y producción industrial por su capacidad para expresar proteínas con gran eficiencia. La ruptura celular, la lisis y la extracción de proteínas mediante ultrasonidos son el método habitual para aislar y recuperar las proteínas de interés del interior de las células BL21. La ultrasonicación rompe por completo la célula y libera todas las proteínas retenidas en su interior, dejando disponible el 100% de las proteínas.
Células BL21 para la expresión de proteínas
BL21 es una cepa bacteriana de E. coli químicamente competente, adecuada para la transformación y la expresión de proteínas a niveles elevados mediante un sistema de inducción basado en la ARN polimerasa T7 e IPTG. Las células BL21 permiten la expresión de proteínas con alta eficiencia a partir de cualquier gen bajo el control de un promotor T7. La cepa de E. coli BL21(DE3) es una cepa de producción de proteínas basada en la ARN polimerasa T7 que se combina con vectores de expresión basados en el promotor T7 y se utiliza ampliamente en laboratorios y en la industria para producir proteínas recombinantes. En BL21(DE3), la expresión del gen que codifica la proteína recombinante es transcrita por la ARN polimerasa T7 codificada en el cromosoma (T7 RNAP), que transcribe ocho veces más rápido que la RNAP convencional de E. coli. Esto hace que la cepa BL21(DE3) sea altamente eficiente y la convierte en uno de los sistemas celulares preferidos para la expresión de proteínas.
Protocolo de lisis ultrasónica y extracción de proteínas de células BL21
La lisis de células BL21 se realiza principalmente mediante ultrasonicación en combinación con lauroil sarcosinato de sodio (también conocido como sarkosyl) como tampón de lisis. Las ventajas de la ruptura celular y la extracción de proteínas mediante ultrasonidos radican en la fiabilidad, la reproducibilidad y el manejo sencillo, seguro y rápido de los ultrasonicadores. El siguiente protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la lisis ultrasónica de células BL21:
- Para eliminar las proteínas chaperonas, los sedimentos bacterianos de BL21 se resuspendieron en 50 ml de tampón de sodio Tris-EDTA (STE) enfriado en hielo (compuesto por 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA y 150 mM NaCl, suplementado con 100 mM PMSF).
- A continuación, se añaden 500 ul de lisozima (10 mg/ ml) y se incuban las células en hielo durante 15 min.
- Después, se añaden 500 ul de DTT y 7 ml de sarkosyl (10% (w/v) preparado en tampón STE).
- Es esencial mantener todos los tampones de purificación enfriados en hielo y las muestras sobre hielo en todo momento. Si es posible, todas las etapas de purificación deben realizarse en una cámara fría.
- Para la lisis ultrasónica y la extracción de proteínas, las muestras se sonican en el ultrasonicador multimuestra VialTweeter durante 4 x 30 sec al 100% de amplitud, con un intervalo de 2 min entre cada sonicación. Como alternativa, puede utilizarse un homogeneizador ultrasónico de sonda con micropunta, por ejemplo, UP200Ht con S26d2 (3 x 30 sec, pausa de 2 min. entre ciclos ultrasónicos, 80% de amplitud).
- Para las etapas posteriores de purificación, las muestras deben mantenerse sobre hielo o, como alternativa, almacenarse a -80 °C hasta su procesamiento posterior.
Disruptor celular ultrasónico UP200St con micropunta S26d2 para lisis y extracción de proteínas
Lisis ultrasónica con control preciso de la temperatura
El control preciso y fiable de la temperatura es crucial al manipular muestras biológicas. Las temperaturas elevadas desencadenan la degradación térmica de las proteínas en las muestras.
Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse eficazmente al utilizar el VialTweeter. Le presentamos varias opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con el VialTweeter y el VialPress para su análisis.
- Supervisión de la temperatura de la muestra: el procesador ultrasónico UP200St, que acciona el VialTweeter, está equipado con un software inteligente y un sensor de temperatura conectable. Conecte el sensor de temperatura al UP200St e introduzca la punta del sensor en uno de los tubos de muestra. Mediante la pantalla táctil digital en color, puede establecer en el menú del UP200St un intervalo de temperatura específico para la sonicación de sus muestras. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y permanecerá en pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda al valor inferior del intervalo de temperatura ∆ establecido. Entonces, la sonicación se reanudará automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
- El bloque del VialTweeter puede enfriarse previamente. Introduzca el bloque del VialTweeter (¡solo el sonotrodo, sin el transductor!) en el frigorífico o el congelador para enfriar previamente el bloque de titanio y retrasar así el aumento de temperatura de la muestra. Si es posible, también puede enfriarse previamente la propia muestra.
- Utilice hielo seco para refrigerar durante la sonicación. Utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo para que el calor pueda disiparse rápidamente.
Clientes de todo el mundo utilizan el VialTweeter y el VialPress para sus tareas diarias de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura del procesador UP200St, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. ¡La preparación ultrasónica de muestras con el VialTweeter y el VialPress ofrece resultados altamente fiables y reproducibles!
Encuentre el disruptor ultrasónico óptimo para su aplicación de lisis
Hielscher Ultrasonics es un fabricante con una amplia trayectoria en la fabricación de disruptores celulares y homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para laboratorios, sistemas de sobremesa y sistemas a escala industrial. El tamaño de su cultivo de células bacterianas, su objetivo de investigación o producción y el volumen de células que debe procesar por hora o por día son factores esenciales para encontrar el disruptor celular ultrasónico adecuado para su aplicación.
Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones para la sonicación simultánea de múltiples muestras (hasta 10 viales con el VialTweeter) y de grandes conjuntos de muestras (es decir, placas de microtitulación / placas ELISA con el UIP400MTP), así como una gama que abarca desde el clásico ultrasonicador de laboratorio de sonda con distintos niveles de potencia de 50 a 400 vatios hasta procesadores ultrasónicos plenamente industriales con hasta 16.000 vatios por unidad para la ruptura celular y la extracción de proteínas con fines comerciales en la producción a gran escala. Todos los ultrasonicadores Hielscher están diseñados para funcionar 24/7/365 a plena carga. La robustez y la fiabilidad son características fundamentales de nuestros equipos ultrasónicos.
Todos los homogeneizadores ultrasónicos digitales están equipados con software inteligente, pantalla táctil en color y registro automático de datos, lo que convierte al equipo ultrasónico en una herramienta de trabajo práctica en laboratorios e instalaciones de producción.
Indíquenos qué tipo de células, qué volumen, con qué frecuencia y con qué objetivo necesita procesar sus muestras biológicas. Le recomendaremos el disruptor celular ultrasónico más adecuado para los requisitos de su proceso.
La siguiente tabla ofrece una orientación sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas ultrasónicos, desde homogeneizadores compactos de mano y ultrasonicadores multimuestra hasta procesadores ultrasónicos industriales para aplicaciones comerciales:
| Volumen por lote | Caudal | Equipos recomendados |
|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos / de microtitulación | n.a. | UIP400MTP |
| 10 viales de 0,5 a 1,5 mL cada uno | n.a. | VialTweeter conectado al UP200St |
| 0,01 a 250 mL | 5 a 100 mL/min | UP50H |
| 0,01 a 500 mL | 10 a 200 mL/min | UP100H |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 a 20 L | 0,2 a 4 L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100 L | 2 a 10 L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 a 100 L/min | UIP16000 |
| n.a. | superior | conjunto de UIP16000 |
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Sonicador de placas UIP400MTP para la ruptura celular de alto rendimiento en placas de 96 pocillos
Ultrasonicador UP200Ht con micropunta S26d2 de 2 mm para la sonicación de muestras pequeñas
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Información de interés
Bacterias Escherichia Coli
Escherichia coli es un tipo de bacteria que no forma esporas, es gramnegativa y se caracteriza por su forma de bacilo recto. Las bacterias E.coli están presentes en el medio ambiente, los alimentos y los intestinos de humanos y animales. E. coli suele ser móvil gracias a sus flagelos perítricos, aunque también existen tipos inmóviles. Las E.coli son organismos quimioorganótrofos anaerobios facultativos, lo que significa que son capaces de realizar tanto un metabolismo respiratorio como fermentativo. La mayoría de los tipos de E.coli son benignos y cumplen funciones útiles en el organismo, como suprimir el crecimiento de especies bacterianas perjudiciales, sintetizar vitaminas, etc.
Las células bacterianas de Escherichia coli del denominado tipo B constituyen una categoría especial de cepas de E.coli, ampliamente utilizadas en investigación para estudiar mecanismos como la sensibilidad a los bacteriófagos o los sistemas de restricción-modificación. Además, las bacterias E.coli se valoran como una herramienta de trabajo fiable para la expresión de proteínas en laboratorios de biotecnología y ciencias de la vida. Por ejemplo, las E.coli se utilizan para sintetizar compuestos como proteínas y oligosacáridos a escala industrial. Debido a características específicas como la deficiencia de proteasas, la baja producción de acetato a concentraciones elevadas de glucosa y la mayor permeabilidad, las células E. coli B son las células hospedadoras más utilizadas para la producción de proteínas obtenidas mediante ingeniería genética.
Proteína recombinante
Las proteínas recombinantes (rProt) están adquiriendo una importancia considerable en numerosos sectores, entre ellos la producción química, la industria farmacéutica, la cosmética, la medicina humana y veterinaria, la agricultura, la industria alimentaria y el tratamiento de residuos.
La producción de proteínas recombinantes requiere el uso de un sistema de expresión. Como sistemas celulares de expresión para la producción de ADN recombinante, pueden utilizarse tanto células procariotas como eucariotas. Aunque las células bacterianas son las más utilizadas para la expresión de proteínas debido a factores como su bajo coste, la facilidad de escalado y las condiciones sencillas del medio de cultivo, los sistemas de mamíferos, levaduras, algas e insectos, así como los sistemas libres de células, son alternativas consolidadas. El tipo de proteína, su actividad funcional y el rendimiento requerido de proteína expresada influyen en la selección del sistema celular utilizado para la expresión de proteínas.
Para expresar una proteína recombinante, una célula determinada debe transfectarse con un vector de ADN que contenga el molde de ADN recombinante. A continuación, se cultivan las células transfectadas con dicho molde. Como consecuencia de los mecanismos celulares, las células transcriben y traducen la proteína de interés, produciendo así la proteína objetivo.
Como las proteínas expresadas quedan retenidas en la matriz celular, la célula debe someterse a lisis (disgregarse y romperse) para liberar las proteínas. En una etapa posterior de purificación, la proteína se separa y se purifica.
La primera proteína recombinante utilizada en un tratamiento fue la insulina humana recombinante en 1982. Actualmente, se producen en todo el mundo más de 170 tipos de proteínas recombinantes para tratamientos médicos. Entre las proteínas recombinantes utilizadas habitualmente en medicina se encuentran, por ejemplo, las hormonas recombinantes, los interferones, las interleucinas, los factores de crecimiento, los factores de necrosis tumoral, los factores de coagulación sanguínea, los fármacos trombolíticos y las enzimas para tratar enfermedades importantes como la diabetes, el enanismo, el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca congestiva, la apoplejía cerebral, la esclerosis múltiple, la neutropenia, la trombocitopenia, la anemia, la hepatitis, la artritis reumatoide, el asma y la enfermedad de Crohn, así como para tratamientos contra el cáncer. (cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Bibliografía / Referencias
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicador VialTweeter para la sonicación simultánea de 10 muestras, por ejemplo, para romper células BL21
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