Tecnología de ultrasonido de Hielscher

Lisis celular de las células BL21 por ultrasonido

Las células BL21 son una cepa de E. coli que se utiliza ampliamente en laboratorios de investigación, biotecnología y producción industrial debido a su capacidad para expresar proteínas de forma altamente eficiente. La disrupción celular ultrasónica, la lisis y la extracción de proteínas es el método común para aislar y recoger las proteínas objetivo del interior celular de las células BL21. La ultrasonificación interrumpe completamente la célula y libera todas las proteínas atrapadas, haciendo que el 100% de la proteína esté disponible.

Células BL21 para la expresión de proteínas

E. coli bacteria such as BL21 cells are commonly lysed by ultrasonication in order to release expressed proteins, such as recombinant proteinsLa célula BL21 es una cepa bacteriana de E. coli químicamente competente, adecuada para la transformación y la expresión de proteínas de alto nivel mediante un sistema de inducción de ARN T7 de polimerasa IPTG. Las células BL21 permiten una expresión proteínica de alta eficiencia de cualquier gen que esté bajo el control de un promotor T7. La cepa BL21(DE3) de E. coli es una cepa de producción de proteínas basada en ARN T7 polimerasa combinada con vectores de expresión basados en promotores T7 y se aplica ampliamente en laboratorios e industria para producir proteínas recombinantes. En BL21(DE3), la expresión del gen que codifica la proteína recombinante es transcrita por la ARN polimerasa T7 codificado en el cromosoma (RNAP T7), que se transcribe ocho veces más rápido que la RNAP de E. coli convencional. Esto hace que la cepa BL21(DE3) sea altamente eficiente y la convierte en uno de los sistemas celulares de expresión de proteínas más preferidos.

Protocolo para la lisis ultrasónica y la extracción de proteínas de las células BL21

La lisis celular de las células BL21 se realiza principalmente mediante ultrasonido en combinación con lauroil sarcosinato de sodio (también conocido como sarkosyl) como tampón de lisis. Las ventajas de la disrupción celular ultrasónica y de la extracción de proteínas radican en la fiabilidad, la reproducibilidad y el funcionamiento sencillo, seguro y rápido de los ultrasonidos. El siguiente protocolo da una dirección paso a paso para la lisis celular ultrasónica BL21:

Sonda de tipo insonifier UP200St para la lisis

El disruptor de células ultrasónicas UP200St con la micro punta S26d2 para la lisis y la extracción de proteínas

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  • Para eliminar las proteínas de chaperona, los pellets bacterianos BL21 se resuspendieron en 50 ml de tampón Tris-EDTA de sodio (STE) frío como el hielo (consistente en 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl complementado con 100 mM de PMSF).
  • Se añaden 500 ul de lisozima (10 mg/ ml) y las células se incuban en hielo durante 15 min.
  • Después se añaden 500 ul de DTT y 7 ml de sarkosyl (10% (p/v) compuesto en tampón STE).
  • Es esencial mantener todos los tampones de purificación en hielo y mantener las muestras en hielo todo el tiempo. Todos los pasos de purificación deben llevarse a cabo en la cámara frigorífica si es posible.
  • VialTweeter at the ultrasonic processor UP200ST

  • Para la lisis ultrasónica y la extracción de proteínas, las muestras son sonicadas en el Ultrasonido Multimuestra VialTweeter durante 4 x 30 seg. al 100% de amplitud con un intervalo de 2 min. entre cada sonicación. Alternativamente, un homogeneizador ultrasónico de tipo sonda con micro-punta, por ejemplo, UP200Ht con S26d2 (3 x 30 seg., 2 min. de pausa entre los ciclos de ultrasonidos, 80% de amplitud) puede ser utilizado.
  • Para los pasos de purificación posteriores, las muestras deben mantenerse en hielo o, alternativamente, almacenarse a -80°C hasta su procesamiento posterior.

Lisis ultrasónica bajo control de temperatura prescrita

El control preciso y fiable de la temperatura es crucial cuando se manipulan muestras biológicas. Las altas temperaturas inician la degradación de la proteína inducida térmicamente en las muestras.
Como todas las técnicas de preparación de muestras mecánicas, la sonicación crea calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede ser bien controlada cuando se utiliza el VialTweeter. Le presentamos varias opciones para monitorizar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con el VialTweeter y la VialPress para su análisis.

  1. Monitorización de la temperatura de la muestra: El procesador ultrasónico UP200St, que acciona el VialTweeter, está equipado con un software inteligente y un sensor de temperatura enchufable. Enchufe el sensor de temperatura en el UP200St e inserte la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. A través de la pantalla táctil digital de color, puede establecer en el menú del UP200St un rango de temperatura específico para su sonicación de la muestra. El ultrasonido se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y hará una pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda al valor más bajo de la temperatura establecida ∆. A continuación, la sonicación vuelve a comenzar automáticamente. Esta característica inteligente evita la degradación inducida por el calor.
  2. El bloque del VialTweeter puede ser preenfriado. Poner el bloque del VialTweeter (¡sólo el sonotrodo sin transductor!) en la nevera o el congelador para preenfriar el bloque de titanio ayuda a posponer el aumento de temperatura de la muestra. Si es posible, la muestra misma puede ser preenfriada también.
  3. Use hielo seco para enfriar durante la sonicación. Utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter en el hielo para que el calor se pueda disipar rápidamente.

Clientes de todo el mundo utilizan el VialTweeter y el VialPress para su trabajo diario de preparación de muestras en laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos y clínicos. Gracias al software inteligente y al control de temperatura del procesador UP200St, la temperatura se controla de forma fiable y se evita la degradación de las muestras inducida por el calor. La preparación de muestras por ultrasonidos con el VialTweeter y la VialPress proporciona resultados altamente fiables y reproducibles!

Encuentre el disruptor ultrasónico óptimo para su aplicación de lisis

Hielscher's industrial processors of the hdT series can be comfortable and user-friendly operated via browser remote control.Hielscher Ultrasonics es un fabricante con una larga experiencia en la fabricación de disruptores y homogeneizadores de células ultrasónicas de alto rendimiento para laboratorios, sistemas de mesa y sistemas a escala industrial. El tamaño de su cultivo de células bacterianas, su objetivo de investigación o producción y el volumen de células a procesar por hora o día son factores esenciales para encontrar el disruptor celular ultrasónico adecuado para su aplicación.
Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para la sonicación simultánea de muestras múltiples (hasta 10 viales con el VialTweeter) y muestras de masa (es decir, placas microtiter / placas ELISA con el UIP400MTP), así como el clásico ultrasonido de laboratorio tipo sonda con diferentes niveles de potencia de 50 a 400 vatios hasta procesadores ultrasónicos totalmente industriales con hasta 16.000 vatios por unidad para la disrupción de células comerciales y la extracción de proteínas en grandes producciones. Todos los ultrasonidos de Hielscher están construidos para el funcionamiento 24/7/365 a plena carga. La robustez y la fiabilidad son características esenciales de nuestros dispositivos ultrasónicos.
Todos los homogeneizadores ultrasónicos digitales están equipados con un software inteligente, una pantalla táctil de color y un protocolo de datos automático, que hacen del dispositivo ultrasónico una herramienta de trabajo cómoda en el laboratorio y en las instalaciones de producción.
Háganos saber, qué tipo de células, qué volumen, con qué frecuencia y con qué objetivo tiene que procesar sus muestras biológicas. Le recomendaremos el disruptor celular ultrasónico más adecuado para sus necesidades de proceso.

En la tabla siguiente se indica la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas de ultrasonidos, desde los homogeneizadores manuales compactos y los ultrasonidos multimuestra hasta los procesadores ultrasónicos industriales para aplicaciones comerciales:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
Placas de 96 pozos/microtítulo n.a. UIP400MTP
10 frascos de 0,5 a 1,5 ml. n.a. VialTweeter en UP200St
0De 0,01 a 250 ml. 5 a 100mL/min UP50H
0De 0,01 a 500 ml. 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of biological samples

Ultrasonicador UP200Ht con 2mm microtip S26d2 para la sonicación de pequeñas muestras

Literatura / Referencias



Información interesante

Bacterias Escherichia Coli

La Escherichia coli es un tipo de bacteria, que no forma deportes, es Gram-negativa y se caracteriza por su forma de varilla recta. La bacteria E.coli está presente en el medio ambiente, en los alimentos y en los intestinos de los seres humanos y los animales. La E. coli suele ser móvil mediante el uso de flagelos peritricos, pero también hay tipos no móviles. Las E.coli son los llamados organismos quimioorganótrofos facultativos anaeróbicos, lo que significa que son capaces de tener un metabolismo tanto respiratorio como fermentativo. La mayoría de los tipos de E.coli son benignos y cumplen funciones útiles en el cuerpo, por ejemplo, suprimir el crecimiento de especies bacterianas nocivas, sintetizar vitaminas, etc.
Las células bacterianas de Escherichia coli del denominado tipo B son una categoría especial de cepas de E.coli, que se utilizan ampliamente en la investigación de mecanismos como la sensibilidad de los bacteriófagos o los sistemas de modificación de la restricción. Además, la bacteria E.coli es valorada como un caballo de batalla fiable para la expresión de proteínas en los laboratorios de biotecnología y ciencias de la vida. Por ejemplo, la E.coli se utiliza para sintetizar compuestos como proteínas y oligosacáridos a escala industrial. Debido a características específicas como la deficiencia de proteasa, la baja producción de acetato a un alto nivel de glucosa y la mayor permeabilidad, las células B de E. coli son las células huésped más utilizadas para la producción de proteínas mediante ingeniería genética.

Proteína recombinante

Las proteínas recombinantes (rProt) están adquiriendo una importancia significativa en múltiples ramas, entre ellas la producción química, la farmacéutica, la cosmética, la medicina humana y animal, la agricultura, la alimentación y las industrias de tratamiento de desechos.
La producción de proteína recombinante requiere el uso de un sistema de expresión. Como sistemas de expresión para la producción de ADN recombinado, se pueden utilizar tanto células procarióticas como eucarióticas. Mientras que las células bacterianas son las más utilizadas para la expresión de proteínas debido a factores como el bajo costo, la fácil escalabilidad y las condiciones simples del medio, los sistemas de mamíferos, levaduras, algas, insectos y los sistemas libres de células son alternativas establecidas. El tipo de proteína, la actividad funcional y el rendimiento requerido de la proteína expresada influyen en la selección del sistema celular utilizado para la expresión de las proteínas.
Para poder expresar la proteína recombinante, una célula particular debe ser transfectada con un vector de ADN que contenga la plantilla de ADN recombinante. Las células transfectadas con la plantilla son entonces cultivadas. Como consecuencia del mecanismo celular, las células transcriben y traducen la proteína de interés, produciendo así la proteína deseada.
Como las proteínas expresadas están atrapadas en la matriz celular, la célula debe ser lisada (interrumpida y rota) para liberar las proteínas. En un paso de purificación posterior, la proteína se separa y se purifica.
La primera proteína recombinante utilizada en el tratamiento fue la insulina humana recombinante en 1982. Hoy en día, se producen más de 170 tipos de proteína recombinante en todo el mundo para tratamientos médicos. Las proteínas recombinantes más utilizadas en la medicina son, por ejemplo, las hormonas recombinantes, los interferones, las interleucinas, los factores de crecimiento, los factores de necrosis tumoral, los factores de coagulación sanguínea, los fármacos trombolíticos y las enzimas para el tratamiento de enfermedades importantes como la diabetes, enanismo, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, apoplejía cerebral, esclerosis múltiple, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatitis, artritis reumatoide, asma, enfermedad de Crohn y terapias para el cáncer. (cf. Phuc V. Pham, en Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)


Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

¡Ultrasonidos de alto rendimiento! La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonido completamente industriales.