Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Lisis de E. coli por ultrasonidos

  • Las bacterias E. coli son las más comúnmente utilizadas en microbiología y biotecnología.
  • Los disruptores celulares ultrasónicos proporcionan resultados fiables y reproducibles para la lisis de E. coli.
  • Las fuerzas de cavitación y cizallamiento intensas pero controlables con precisión dan como resultado una interrupción completa y un alto rendimiento de extracción (p. ej. proteínas, ADN).

Alteración celular por cavitación

La bacteria Escherichia coli es lisada de forma fiable mediante homogeneizadores ultrasónicos de tejidos.Los homogeneizadores ultrasónicos de tipo sonda funcionan con aproximadamente 20.000 ciclos por segundo (a 20 kHz) y causan cavitación en líquidos o supsensiones. Cavitación acústica: áreas microscópicas de presiones similares a las del vacío y altas temperaturas que desgarran las células. Aunque las temperaturas pueden alcanzar varios miles de grados centígrados, los volúmenes de cavitación son tan pequeños que no calientan el proceso significativamente. El ultrasonido generó cavitación acústica y fuerzas de corte que perforan o rompen la membrana celular de E.coli – dependiendo de la configuración del dispositivo del homogeneizador ultrasónico.

Ventajas de la lisis ultrasónica

  • control preciso de la lisis (intensidad, amplitud, temperatura)
  • adaptación óptima a muestras específicas
  • regulación de temperatura
  • para muestras muy pequeñas a muy grandes (µL a litros)
  • tratamiento mecánico puro
  • Escalado lineal desde el laboratorio hasta la producción
El dispositivo ultrasónico VialTweeter permite preparar simultáneamente muestras con hasta 10 viales bajo las mismas condiciones (haga clic para ampliar).

VialTweeter para lisis ultrasónica

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Mientras que la lisis química y enzimática puede ser problemática – ya que la lisis química puede alterar las estructuras de las proteínas e introducir problemas de purificación y la lisis enzimática requiere largos tiempos de incubación y no es reproducible. – es un sofisticado y rápido método de disrupción celular.
La lisis ultrasónica se basa únicamente en fuerzas mecánicas. No se agregan productos químicos, la sonicación rompe la pared celular por fuerzas de corte. La lisis química puede alterar la estructura de las proteínas e introducir problemas de purificación. La alteración enzimática requiere largos períodos de incubación y no es reproducible.

Recomendaciones generales

UP400St ultrasonido con reactor de flujoLa sonicación es la técnica más popular para lisar cantidades muy pequeñas, medianas y grandes de suspensiones celulares. – desde pico-litros hasta 100L/hr (usando una celda de flujo ultrasónica). Las células son lisadas por cizallamiento líquido y cavitación. El ADN también es cortado durante la sonicación, por lo que no es necesario añadir DNasa a la suspensión celular.
Control de temperatura:
Al preenfriar la muestra y mantenerla durante la sonicación en hielo, se puede evitar fácilmente la degradación térmica de la muestra.
Idealmente, las muestras deben mantenerse frías durante la lisis, pero para la mayoría de las muestras es suficiente si la temperatura no supera la temperatura del cultivo o de la fuente del tejido. Por lo tanto, se recomienda mantener la suspensión en hielo y sonar con varios pulsos ultrasónicos cortos de 5-10 segundos y pausas de 10-30 segundos. Durante las pausas, el calor puede disiparse para restablecer una temperatura baja. Para muestras de células más grandes, se dispone de varios reactores de células de flujo con camisas de refrigeración.

Protocolos para la preparación de los Lisados de E. Coli

Análisis de expresión y purificación de proteínas recombinantes

El perdigón de E. coli fue sondeado con un sistema ultrasónico UP100H (Hielscher). Para ello, se resuspendió el sedimento celular en tampón de lisis refrigerado (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) y se enfrió en hielo durante 10 minutos. Luego, la suspensión celular fue sonada con 10 ráfagas cortas de 10 s seguidas de un intervalo de 30 s para enfriamiento. Finalmente, los restos celulares se eliminaron por ultracentrifugación a 4°C durante 15 minutos a 14000 rpm. Para confirmar la expresión de rPR, el sobrenadante se aplicó en gel de poliacrilamida al 12% y se analizó mediante SDS-PAGE y Western blotting. La purificación del rPR se realizó con Ni2+-Resina NTA (Invitrogen, EE.UU.) según la guía del fabricante. En esta etapa se utilizó el método de purificación nativo. La pureza de la proteína purificada se evaluó mediante electroforesis en el gel de poliacrilamida al 12% y la posterior tinción de azul de Coomassie. La concentración de proteína purificada se midió mediante el kit de análisis de proteína Micro BCA (PIERCE, EE.UU.). (Azarnezhad et al. 2016)

Interruptor celular ultrasónico UP100H (100W) para lisis, disrupción celular y cizallamiento del ADN.

Homogeneizador ultrasónico UP100H (100W)

Crecimiento celular, reticulación y preparación de extractos celulares de E. coli

Para SeqA y RNA polimerasa ChIP-Chip E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA fue cultivado a 37°C a un OD600 de aproximadamente 0,15 en 50 ml de LB (+ 0,2% de glucosa) antes de que se añadieran 27 μl de formaldehído (37%) por ml de medio (concentración final 1%). El reticulado se realizó a agitación lenta (100 rpm) a temperatura ambiente durante 20 min. seguido de un enfriamiento con 10 ml de glicina de 2,5 M (concentración final 0,5 M). Para experimentos de choque térmico, se cultivó E. coli MG1655 en un medio LB de 65 ml a 30°C hasta un OD600 de aproximadamente 0,3. Posteriormente se transfirieron 30 ml de cultivo a un matraz precalentado a 43°C y el resto se mantuvo a 30°C. El reentrecruzamiento y el enfriamiento fueron los descritos anteriormente, excepto que las células se mantuvieron a 30 o 43°C durante 5 minutos antes de agitarlas lentamente a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con TBS frío (pH 7,5). Después de la resuspensión en 1 ml de tampón de lisis (10 mM Tris (pH 8.0), 20% de sacarosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml de lisozima) e incubación a 37°C durante 30 min seguido de la adición de 4 ml de tampón de IP, las células se sonaron en hielo con 12 veces 30 seg. y 30 seg. UP400St (Hielscher Ultrasonics GmbH) con una potencia del 100%. Después de la centrifugación durante 10 min a 9000 g, se almacenaron 800 alícuotas del sobrenadante a -20°C. (Waldminghaus 2010)

Sobreproducción y purificación de enzimas.

Para la sobreproducción de proteínas etiquetadas con decahistidina (His10), E. coli BL21(DE3) se transformó con construcciones pET19b. Se cosechó un precultivo nocturno por centrifugación y se utilizó el 1% para inocular un cultivo de expresión. Las células portadoras de pET19mgtB se cultivaron a 22°C hasta una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,7. El cultivo fue transferido a 17°C e inducido por 100 μM IPTG. Después de 16 h, el cultivo se cosechó por centrifugación a 7.500 × g a 4°C. Las células fueron resuspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 50 mM con 0,3 M NaCl a un pH de 7,4 y alteradas por ultrasonido con un sonotrodo de micro-puntas S2 al UP200St (Hielscher, Teltow, Alemania) a un ciclo de 0,5 y una amplitud del 75%.
La sobreproducción de GtfC marcada con decahistidina fue inducida a 37°C a una temperatura de DO600 de 0,6 con 100 μM IPTG. Las células se incubaron durante 4 horas, se cosecharon y se lisaron tal como se ha indicado anteriormente para la MgtB.
Los extractos celulares crudos se centrifugaron a 15.000 × g y 4°C para sedimentar los restos celulares. Los extractos clarificados se cargaron en columnas de 1 ml de HisTrap FF Crude utilizando un sistema ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Las enzimas fueron purificadas de acuerdo con el protocolo del fabricante para la elución de gradiente de las proteínas marcadas con His. Las soluciones de proteínas eludidas se dializaron dos veces contra 1.000 volúmenes de 50 mM PBS, pH 7,4, con 0,3 M NaCl a 4°C. La purificación se analizó con un 12% de SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford utilizando Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania). (Rabausch et al. 2013)

Extracción de proteína de bacterias E. coli
Una proteína de cebo de interés (en este caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) se fusiona con una marca GST y se expresa en células BL21 de Escherichia coli (E. coli).
1. Tomar un gránulo de GST-MTV1 y GST (correspondiente a 50 ml de cultivo bacteriano) y volver a suspender cada uno en 2,5 ml de tampón de extracción en frío.
2. Usar un ultrasonido UP100H (equipado con microtip-sonotrodo MS3 para pequeños volúmenes (2-5mL)) para interrumpir las células bacterianas hasta que sean lisadas, lo que se indica por la reducción de la opacidad y el aumento de la viscosidad. Esto debe realizarse en hielo, y se recomienda sonicar en intervalos (por ejemplo, 10 segundos de sonicación seguidos de 10 segundos en hielo y así sucesivamente). Hay que tener cuidado de no sondear con una intensidad demasiado alta. Si se detecta espuma o la formación de un precipitado blanco, es necesario reducir la intensidad.
3. Transferir la solución de bacterias lisadas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar a 4°C, 16.000 x g durante 20 min.

Proteínas modificadas con alicina en E. coli

El VialTweeter es un cómodo ultrasonicador para homogeneizar pequeñas muestrasDeterminación del contenido de sulfhidrilo mediante el ensayo 5,5′-Dithiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB)
Se utilizó un cultivo nocturno de E. coli MG1655 para inocular el medio mínimo de MOPS (1:100). El cultivo se realizó de forma aeróbica hasta alcanzar un A600 de 0,4. El cultivo se dividió en tres cultivos de 15 ml para el tratamiento del estrés. Un cultivo sin tratar sirvió como control negativo. 0,79 mM de alicina (128 μg ml-1) o 1 mM de diamante fue añadido a uno de los dos cultivos restantes cada uno. Los cultivos se incubaron durante 15 minutos. Se recogieron 5 ml de cada cultivo por centrifugación (8,525 × g, 4°C, 10 min). Las células se lavaron dos veces con 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO42 mM KH2PO4pH 7,4, almacenado anaeróbicamente antes de su uso) y centrifugado (13.000 × g, 4°C, 10 min). Las células fueron resuspendidas en tampón de lisis (PBS con 6 mM de guanidinio HCl, pH 7.4) antes de la interrupción a 4°C por ultrasonido (VialTweeter ultrasonido, Hielscher GmbH, Alemania) (3 × 1 min). Los residuos celulares se granularon por centrifugación (13.000 × g, 4 °C, 15 min). El sobrenadante se transfirió a una cubeta QS-macro de 3,5 ml (10 mm) con una barra de agitación magnética y se mezcló con 1 ml de tampón de lisis. La extinción de las muestras fue monitoreada a 412 nm con un espectrofotómetro Jasco V-650 equipado con el porta-células PSC-718 de temperatura controlada (Jasco) a temperatura ambiente. 100μl de una solución de 3 mM dithiobis(ácido 2-nitrobenzoico). La extinción fue monitoreada hasta que alcanzó la saturación. El cálculo de la concentración de tiol se realizó utilizando el coeficiente de extinción ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 para el ácido tio-2-nitrobenzoico (TNB). Las concentraciones de tiol celular se calcularon sobre la base de un volumen de células de E. coli de 6,7 × 10-15 litro y una densidad celular de A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 108 células ml-1 cultura). (Müller et al. 2016)

Determinación de glutatión in vivo

E.coli MG1655 se cultivó en medio mínimo de MOPS en un volumen total de 200 ml hasta una concentración de A600 de 0,5. El cultivo se dividió en cultivos de 50 ml para el tratamiento del estrés. Después de 15 minutos de incubación con 0,79 mM de alicina, 1 mM de diamido o dimetilsulfóxido (control), se cosecharon células a 4.000 g a 4°C durante 10 min. Las células se lavaron dos veces con tampón de KPE antes de la resuspensión de los gránulos en 700µl de tampón de KPE. Para la desproteinación, se añadieron 300 l de ácido sulfosalicílico al 10% (p/v) antes de la interrupción de las células por ultrasonido (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonido). Los sobrenadantes se recogieron después de la centrifugación (30 min, 13.000 g, 4°C). Las concentraciones de ácido sulfosalicílico se redujeron al 1% mediante la adición de 3 volúmenes de tampón de KPE. Las mediciones de glutatión total y GSSG se realizaron como se describió anteriormente. Las concentraciones de glutatión celular se calcularon sobre la base de un volumen de células de E. coli de 6,7×10-15 litro y una densidad celular de A600 0.5 (equivalente a 1×108 células ml-1 cultura). Las concentraciones de GSH fueron calculadas por sustracción de 2[GSSG] del glutatión total. (Müller et al. 2016)

Interruptor ultrasónico para lisis celular y extracción de material biológico (Click para ampliar)

Ultrasonicador con sonda UP400St

Expresión de mAspAT humano en E. coli

Disruptor celular ultrasónico UP400St (400W) para la extracción de materia intracelular (por ejemplo, proteínas, orgánulos, ADN, ARN, etc.).La única colonia de E. coli BL21 (DE3) que alberga el vector de expresión en 30 mL de medio Luria-Bertani (LB) que contiene 100μg/mL de ampicilina, y luego se cultiva a 37ºC hasta la densidad óptica (OD600) alcanzó el 0,6 %. Las células fueron cosechadas por centrifugación a 4.000 × g durante 10 minutos, y resuspendidas en un medio LB fresco de 3L que contenía 100μg/mL de ampicilina.
Posteriormente, se indujo la expresión de la proteína con 1 mM isopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) durante 20 h a 16ºC. Las células se recogieron por centrifugación a 8.000 × g durante 15 minutos y se lavaron con tampón A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Se obtuvieron aproximadamente 45 g (peso húmedo) de un cultivo de 3 L. Después de la centrifugación, los gránulos celulares fueron resuspendidos en 40 mL (para un cultivo de 1 L) de tampón de extracción en frío A, y lisiados por ultrasonido a temperatura de frío utilizando un UP400St (Dr. Hielscher GmbH, Alemania). La lisis celular se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos para separar las fracciones solubles (sobrenadante) y precipitadas (pellets). (Jiang et al. 2015)

En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
0,5 a 1,5 mL n.a. VialTweeter
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Literatura/Referencias



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E. coli

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