Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Lisis de E. coli por ultrasonidos

  • E. coli bacterias son las bacterias más comúnmente utilizados en microbiología y biotecnología.
  • disruptores ultrasónicos de células ofrecen resultados fiables y reproducibles para la lisis de E. coli.
  • fuerzas de cavitación y de cizallamiento intensas todavía precisamente controlables resultan en la interrupción completa y rendimientos de extracción altas (por ejemplo, proteínas, ADN).

Rotura celular por cavitación

bacterias Escherichia coli se lisan fiable utilizando homogeneizadores de tejido ultrasónico.Ultrasónicos de tipo sonda homogeneizadores operan con aprox. 20.000 ciclos por segundo (en 20 kHz) y la causa cavitación en líquidos o supsensions. áreas microscópicas cavitación acústica de presiones de vacío como y altas temperaturas que desgarran células aparte. Aunque las temperaturas pueden llegar a varios miles de grados centígrados, los volúmenes de cavitación son tan pequeñas que no calientan el proceso de manera significativa. El ultrasonido generado cavitación acústica y fuerzas de cizallamiento perforar o romper la membrana celular de E. coli – dependiendo de la configuración del dispositivo del homogeneizador ultrasónico.

Ventajas de lisis por ultrasonidos

  • control preciso de lisis (intensidad, amplitud, temperatura)
  • adaptación óptima a las muestras específicas
  • control de temperatura
  • para muestras muy pequeñas hasta muy grandes (l a litros)
  • tratamiento mecánico pura
  • lineal ampliación del laboratorio a la producción
El dispositivo ultrasónico VialTweeter permite preparar simultáneamente muestras con hasta 10 viales bajo las mismas condiciones (haga clic para ampliar).

VialTweeter para la lisis por ultrasonidos

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Mientras lisis química y enzymtic puede ser problemático – desde lisis química puede alterar estructuras de proteínas e introducir problemas de purificación y lisis enzimática requiere largos tiempos de incubación y no es reproducible – ruptura ultrasónica es un método interrupción sofisticado, celular rápido.
La lisis ultrasónica se basa únicamente en fuerzas mecánicas. No se agregan productos químicos, la sonicación rompe la pared celular por fuerzas de corte. La lisis química puede alterar la estructura de las proteínas e introducir problemas de purificación. La alteración enzimática requiere largos períodos de incubación y no es reproducible.

Recomendaciones generales

ultrasonicador UP400St con reactor de flujoEl tratamiento con ultrasonidos es la técnica más popular para lisar muy pequeñas, medianas y grandes cantidades de suspensiones celulares – de pico-litros hasta 100L / h (usando una celda de flujo ultrasónica). Las células se lisan por cizallamiento líquido y cavitación. ADN también se cizalla durante la sonicación, por lo que no es necesario añadir DNasa a la suspensión celular.
Control de temperatura:
Por pre-enfriamiento de la muestra y mantener la muestra durante la sonicación en hielo, Muestra la degradación térmica de la muestra se puede prevenir fácilmente.
Idealmente, las muestras deben mantenerse frías durante la lisis, pero para la mayoría de las muestras es suficiente si la temperatura no supera la temperatura del cultivo o de la fuente del tejido. Por lo tanto, se recomienda mantener la suspensión en hielo y sonar con varios pulsos ultrasónicos cortos de 5-10 segundos y pausas de 10-30 segundos. Durante las pausas, el calor puede disiparse para restablecer una temperatura baja. Para muestras de células más grandes, se dispone de varios reactores de células de flujo con camisas de refrigeración.

Los protocolos para la preparación de lisados ​​de E. coli

Análisis de la expresión y purificación de la proteína recombinante

El sedimento de E. coli se sometió a ultrasonidos con un sistema ultrasónico UP100H (Hielscher). Para este fin, el sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis enfriado (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM) y se enfrió en hielo durante 10 minutos. Luego, la suspensión celular se sonicó con 10 ráfagas cortas de 10 s seguidas por un intervalo de 30 s para el enfriamiento. Finalmente, los restos celulares se eliminaron mediante ultracentrifugación a 4 ° C durante 15 min a 14000 rpm. Para la confirmación de la expresión de rPR, el sobrenadante se ejecutó sobre gel de poliacrilamida al 12% y se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia Western. La purificación de rPR se realizó usando Ni2+resina NTA (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con la guía del fabricante. En esta etapa, se utilizó el método de purificación nativo. La pureza de la proteína purificada se evaluó mediante electroforesis en el gel de poliacrilamida al 12% y la subsiguiente tinción con azul de Coomassie. concentración de la proteína purificada se midió por Micro BCA kit de ensayo de proteínas (Pierce, EE.UU.). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrasonic UP100H disruptor celular (100W) para la lisis, la ruptura celular y el cizallamiento del ADN.

Homogeneizador ultrasónico UP100H (100W)

Crecimiento celular, la reticulación y Preparación de E. coli extractos celulares

Para SecA y ARN polimerasa ChIP-Chip E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA se cultivó a 37 ° C a una DO600 de aproximadamente 0,15 en 50 ml de LB (+ 0,2% de glucosa) antes de añadir 27 μl de formaldehído (37%) por ml de medio (concentración final 1%). La reticulación se realizó con agitación lenta (100 rpm) a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de inactivación con 10 ml de glicina 2,5 M (concentración final 0,5 M). Para experimentos de choque térmico, E. coli MG1655 se cultivó en 65 ml de medio LB a 30 ° C hasta una DO600 de alrededor de 0.3. Posteriormente, se transfirieron 30 ml de cultivo a un matraz precalentado a 43 ° C y el resto se mantuvo a 30 ° C. La reticulación y el enfriamiento rápido fueron como se describió anteriormente, excepto que las células se mantuvieron a 30 o 43ºC durante 5 minutos antes de una agitación lenta adicional a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con TBS frío (pH 7,5). Después de la resuspensión en 1 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM (pH 8,0), sacarosa al 20%, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, lisozima 10 mg / ml) e incubación a 37 ° C durante 30 minutos, seguido de la adición de 4 ml de IP buffer, las células fueron sonicadas en hielo con 12 veces 30 segundos y 30 segundos de pausa en un UP400St procesador ultrasónico (Hielscher Ultrasonidos GmbH) con 100% de potencia. Después de la centrifugación durante 10 min a 9000 g, 800 alícuotas l del sobrenadante se almacenaron a -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

La sobreproducción y purificación de enzimas.

Para la sobreproducción de decahistidine (His10) proteínas-etiquetados, E. coli BL21 (DE3) se transformó con pET19b constructos. Un precultivo durante la noche se recogió mediante centrifugación, y el 1% se utilizó para inocular un cultivo de expresión. Las células que llevan pET19mgtB se cultivaron a 22 ° C hasta una densidad óptica a 600 nm (OD600) De 0,7. El cultivo se transfirió a 17 ° C y se indujo por 100? M IPTG. Después de 16 h, se recogió el cultivo por centrifugación a 7500 × g a 4 ° C. Las células se resuspendieron en solución salina 50 mM tamponada con fosfato (PBS) con 0,3 M de NaCl a pH 7,4 y se rompieron por tratamiento con ultrasonidos con un sonotrodo de micro-punta S2 en el UP200St ultrasonicador (Hielscher, Teltow, Alemania) a un ciclo de 0,5 y una amplitud de 75%.
Se indujo La sobreproducción de GtfC-etiquetados decahistidine a 37 ° C a una DO600 de 0,6 con 100 mM IPTG. Las células se incubaron a continuación durante 4 h, se recogieron y se lisaron como se ha indicado anteriormente para MgtB.
extractos celulares brutos se centrifugaron a 15.000 x g y 4 ° C para sedimentar los restos celulares. Los extractos clarificados se cargan en 1-ml HisTrap FF columnas bruto usando un sistema de ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Las enzimas se purificaron de acuerdo con el protocolo del fabricante para gradiente de elución de proteínas con cola de histidina. soluciones de proteínas eluidas se dializaron dos veces contra 1000 volúmenes de PBS 50 mM, pH 7,4, con 0,3 M NaCl a 4 ° C. La purificación se analizó por 12% SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford utilizando Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania). (Rabausch et al. 2013)

La extracción de proteína de la bacteria E. coli
Una proteína cebo de interés (en este caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) se fusiona a una etiqueta de GST y se expresa en células BL21 de Escherichia coli (E. coli).
1. Tomar una pastilla de GST-MTV1 y GST (correspondiente a 50 ml de cultivo bacteriano) y resuspender cada una en 2,5 ml de hielo tampón de extracción en frío.
2. Utilice un ultrasonicador UP100H (Equipado con MS3 micropunta-sonotrodo para pequeños volúmenes (2-5mL)) para romper las células bacterianas hasta que se lisan, que se indica por la reducción de la opacidad y el aumento de la viscosidad. Esto tiene que ser llevado a cabo en hielo, y se recomienda someter a ultrasonidos en intervalos (por ejemplo, 10 seg de sonicación seguido por 10 segundos en hielo y así sucesivamente). El cuidado tiene que tener cuidado de no someter a ultrasonidos con intensidad demasiado elevada. Si la formación de espuma o se detecta la formación de un precipitado de color blanco, la intensidad debe ser bajado.
3. Transferir la solución bacterias lisadas a 1,5 tubos de microcentrífuga ml y centrifugar a 4 ° C, 16.000 x g durante 20 min.

Las proteínas Allicin modificado en E. coli

El VialTweeter es un cómodo ultrasonicador para homogeneizar pequeñas muestrasDeterminación del contenido de sulfhidrilo por 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) Ensayo
Un cultivo de una noche de E. coli MG1655 se utilizó para inocular MOPS medio mínimo (1: 100). El cultivo se hizo crecer aeróbicamente hasta que se alcanzó una A600 de 0,4. El cultivo se dividió en tres cultivos de 15 ml para el tratamiento de estrés. Un cultivo sin tratar sirvió como un control negativo. alicina 0,79 mM (128 g ml-1diamida) o 1 mM se añadió a uno de los dos cultivos restantes cada uno. Los cultivos se incubaron durante 15 min. 5 ml de cada cultivo se recogieron por centrifugación (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Las células se lavaron dos veces con 1 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 102HPO4, KH 2 mM2correos4, pH 7.4, almacenado anaeróbicamente antes del uso) y centrifugado (13,000 × g, 4 ° C, 10 min). Las células se resuspendieron en tampón de lisis (PBS con guanidinio HCl 6 mM, pH 7,4) antes de la interrupción a 4 ° C mediante ultrasonicación (VialTweeter ultrasonicador, Hielscher GmbH, Alemania) (3 x 1 min). Los restos celulares se sedimentaron por centrifugación (13.000 xg, 4 ° C, 15 min). El sobrenadante se transfirió a un 3,5-ml QS-macro cubeta (10 mm) con una barra de agitación magnética y se mezcla con 1 ml de tampón de lisis. La extinción de las muestras se monitorizó a 412 nm con un espectrofotómetro Jasco V-650 equipado con el soporte de la celda de temperatura controlada PSC-718 (Jasco) a temperatura ambiente. se añadieron 100? l de una solución ditiobis 3 mM (ácido 2-nitrobenzoico). La extinción se monitorizó hasta que alcanzó la saturación. Cálculo de la concentración de tiol se realizó utilizando el coeficiente de extinción ε412 = 13.700 M-1 cm-1 para tio-2-nitrobenzoico (TNB). concentraciones de tiol celular se calcularon basándose en un volumen de células de E. coli de 6,7 x 10-15 litro y una densidad celular de A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 108 células ml-1 cultura). (Müller et al. 2016)

En Vivo Determinación glutatión

E. coli MG1655 se cultivó en MOPS medio mínimo en un volumen total de 200 ml hasta una A600 de 0.5 fue alcanzado. El cultivo se dividió en cultivos de 50 ml para el tratamiento del estrés. Después de 15 minutos de incubación con alicina 0,79 mM, diamida 1 mM o sulfóxido de dimetilo (control), las células se recogieron a 4.000 g a 4 ° C durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón KPE antes de la resuspensión de gránulos en 700 μl de tampón KPE. Para la desprotección, se añadieron 300 l de ácido sulfosalicílico al 10% (p / v) antes de la interrupción de las células mediante ultrasonicación (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicador). Se recogieron los sobrenadantes después de la centrifugación (30 min, 13.000 g, 4 ° C). concentraciones de ácido sulfosalicílico se redujeron a 1% por la adición de 3 volúmenes de tampón KPE. Se realizaron mediciones de glutatión total y GSSG como se describe anteriormente. concentraciones de glutatión celular se calcularon basándose en un volumen de células de E. coli de 6,7×10-15 litro y una densidad celular de A600 00,5 (equivalente a 1×108 células ml-1 cultura). concentraciones de GSH se calcularon mediante la resta de 2 [GSSG] de glutatión total. (Müller et al. 2016)

disruptor de ultrasonidos para la lisis celular y la extracción de material biológico (Haga clic para agrandar!)

Ultrasonicador con sonda UP400St

La expresión de mAspAT humana en E. coli

Ultrasonic disruptor celular UP400St (400W) para la extracción de la materia intracelular (por ejemplo proteínas, orgánulos, ADN, ARN, etc.)La única colonia de E. coli BL21 (DE3) que alberga el vector de expresión en 30 ml de medio Luria-Bertani (LB) medio que contiene 100? G / ml de ampicilina, y luego se cultivó a 37ºC hasta que la densidad óptica (DO600) Alcanzó 0,6. Las células se recogieron por centrifugación a 4000 xg durante 10 min, y se resuspendieron en medio LB fresco que contiene 100? G 3L / ml de ampicilina.
Posteriormente, la expresión de proteínas se indujo con 1 mM de isopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20 h a 16ºC. Las células se recogieron por centrifugación a 8000 xg durante 15 min y se lavaron con tampón A (NaH2PO4 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4). Se obtuvieron células 45g aproximado (peso húmedo) de 3 cultura L. Después de la centrifugación, los sedimentos de células se resuspendió en 40 ml (para 1 l de cultivo) de tampón de extracción enfriado en hielo A, y se lisaron mediante ultrasonidos a temperatura enfriada con hielo usando un UP400St instrumento (Dr. Hielscher GmbH, Alemania). La lisis celular se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min para separar soluble (sobrenadante) y las fracciones precipitadas (pellet). (Jiang et al. 2015)

En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
0,5 a 1,5 mL n.a. VialTweeter
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Literatura/Referencias



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E. coli

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E. coli juega un papel importante en la ingeniería biológica moderna y la microbiología industrial, ya que la bacteria es fácil de manipular. aplicaciones de laboratorio comunes que implican a menudo el uso de E. coli, por ejemplo, para crear el ácido desoxirribonucleico (ADN) o para actuar como un organismo modelo.
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E. coli se utilizan como fábricas de células para producir insulina. Otras aplicaciones incluyen el uso de células de E. coli modificadas para desarrollar y producir vacunas y enzimas inmovilizadas, para producir biocombustibles, así como para la biorremediación.
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Fragmentación de ADN por ultrasonidos

fuerzas de corte ultrasónicos son un método comúnmente utilizado para separar de la célula y romper cadenas de ADN en pedazos. cavitación acústica rompe las paredes celulares y membranas para extraer el ADN de las células y generan fragmentos de aproximadamente 600 – 800 pb de longitud, que es ideal para el análisis.
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