Lisis de E. coli por ultrasonidos
- La bacteria E. coli es la más utilizada en microbiología y biotecnología.
- Los disruptores celulares ultrasónicos ofrecen resultados fiables y reproducibles para la lisis de E. coli.
- Las fuerzas de cavitación y cizallamiento, intensas pero controlables con precisión, provocan una disrupción completa y altos rendimientos de extracción (por ejemplo, proteínas, ADN).
¿Por qué la disrupción celular ultrasónica de E. coli es el método preferido?
Los homogeneizadores ultrasónicos o los ultrasonicadores tipo sonda ofrecen varias ventajas para la lisis de E. coli, ya que los ultrasonidos intensos rompen eficazmente las paredes y membranas celulares. Los ultrasonidos tipo sonda se utilizan ampliamente para la lisis de E. coli por las siguientes razones:
La extracción de proteínas a partir de células E.coli se realiza eficazmente con el sonda ultrasónica UP200St
El ultrasonicador tipo sonda ofrece muchas ventajas para la lisis de E. coli. El control fiable y preciso de los parámetros del proceso ultrasónico permite optimizar los parámetros de funcionamiento, como la potencia, la duración y la manipulación de la muestra, para lograr los resultados deseados.
Análisis electroforéticos del ADN genómico de E. coli EDL933 sometido a 0 - 15 min de ultrasonidos. L indica la escalera de ADN.
Disrupción celular mediante cavitación ultrasónica
Los homogeneizadores ultrasónicos de tipo sonda funcionan con unos 20.000 ciclos por segundo (a 20 kHz) y provocan cavitación en líquidos o suspensiones. La cavitación acústica crea zonas microscópicas de presiones similares al vacío y altas temperaturas que desgarran las células. Aunque las temperaturas pueden alcanzar varios miles de grados centígrados, los volúmenes de cavitación son tan pequeños que no calientan significativamente el proceso. La cavitación acústica generada por ultrasonidos y las fuerzas de cizallamiento perforan o rompen la membrana celular de células bacterianas como E. coli. Los ultrasonidos de Hielscher permiten controlar con precisión parámetros del proceso como la intensidad de los ultrasonidos, la amplitud, la entrada de energía y la temperatura. De este modo, el proceso de lisis ultrasónica puede ajustarse de forma óptima al tipo de célula, al cultivo celular y al objetivo del proceso.
- control preciso de la lisis (intensidad, amplitud, temperatura)
- resultados fiables y reproducibles
- adaptación óptima a muestras específicas
- control de temperatura
- para muestras de muy pequeñas a muy grandes (de µl a litros)
- Tratamiento puramente mecánico
- manejo sencillo y seguro
- escalado lineal del laboratorio a la producción
VialTweeter para lisis ultrasónica
Homogeneizador ultrasónico frente a otras técnicas de lisis
Aunque la lisis química y enzimática puede ser problemática – ya que la lisis química puede alterar las estructuras de las proteínas e introducir problemas de purificación y la lisis enzimática requiere largos tiempos de incubación y no es reproducible – La disrupción ultrasónica es un método sofisticado y rápido de disrupción celular.
La lisis ultrasónica se basa únicamente en fuerzas mecánicas. No se añaden productos químicos, la sonicación rompe la pared celular mediante fuerzas de cizallamiento. La lisis química puede alterar la estructura de las proteínas e introducir problemas de purificación. La disrupción enzimática requiere largos tiempos de incubación y no es reproducible. La disrupción celular por ultrasonidos de las células de la bacteria E. coli es rápida, sencilla, fiable y reproducible. Por este motivo, los ultrasonidos de Hielscher se utilizan en laboratorios biológicos y bioquímicos de todo el mundo para la preparación de muestras, preanálisis, diagnóstico in vitro y múltiples ensayos.
Recomendaciones generales para la lisis ultrasónica
La sonicación es la técnica más popular para lisar cantidades muy pequeñas, medianas y grandes de suspensiones celulares – desde pico-litros hasta 100L/h (utilizando una célula de flujo ultrasónico). Las células se lisan por cizallamiento del líquido y cavitación. El ADN también se tritura durante la sonicación, por lo que no es necesario añadir DNasa a la suspensión celular.
Control de la temperatura durante la lisis ultrasónica de E. coli
Preenfriando la muestra y manteniéndola en hielo durante la sonicación se puede evitar fácilmente la degradación térmica de la muestra.
Lo ideal es mantener las muestras en hielo durante la lisis, pero para la mayoría de las muestras es suficiente con que la temperatura no supere la temperatura del cultivo o de la fuente tisular. Por lo tanto, se recomienda mantener la suspensión en hielo y sonicar con varios pulsos ultrasónicos cortos de 5-10 segundos y pausas de 10-30 segundos. Durante las pausas, el calor puede disiparse para restablecer una temperatura baja. Para muestras celulares más grandes, se dispone de varios reactores de celda de flujo con camisas de refrigeración.
Lea aquí consejos detallados y recomendaciones para una lisis ultrasónica satisfactoria.
Protocolos para la preparación ultrasónica de lisados de E. Coli
Los investigadores utilizan los homogeneizadores ultrasónicos de Hielscher para la disrupción celular de E. coli. A continuación encontrará varios protocolos probados y demostrados para la lisis de E. coli utilizando homogeneizadores ultrasónicos Hielscher para diversas aplicaciones relacionadas con E. coli.
Crecimiento celular, reticulación y preparación de extractos celulares de E. coli mediante ultrasonidos
Para SeqA y RNA polimerasa ChIP-Chip se cultivó E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA a 37°C hasta una DO600 de aproximadamente 0,15 en 50 ml de LB (+ 0,2% de glucosa) antes de añadir 27 μl de formaldehído (37%) por ml de medio (concentración final 1%). La reticulación se realizó con agitación lenta (100 rpm) a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguida de un enfriamiento con 10 ml de glicina 2,5 M (concentración final 0,5 M). Para los experimentos de choque térmico, se cultivó E. coli MG1655 en 65 ml de medio LB a 30 °C hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 0,3. Posteriormente se transfirieron 30 ml de cultivo a un matraz precalentado a 43°C y el resto se mantuvo a 30°C. La reticulación y el enfriamiento se realizaron como se ha descrito anteriormente, salvo que las células se mantuvieron a 30 o 43 °C durante 5 minutos antes de agitarlas lentamente a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con TBS frío (pH7,5). Tras la resuspensión en 1 ml de tampón de lisis (10 mM Tris (pH 8,0), 20% de sacarosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml de lisozima) y la incubación a 37°C durante 30 min, seguida de la adición de 4 ml de tampón IP, las células se sonicaron en hielo con 12 pausas de 30 seg y 30 seg utilizando el procesador ultrasónico UP400St de Hielscher al 100% de potencia. Tras centrifugar durante 10 min a 9000 g, se almacenaron alícuotas de 800 μl del sobrenadante a -20 °C. (Waldminghaus 2010)
Sobreproducción y purificación de enzimas con una sonda ultrasónica
Para la sobreproducción de proteínas marcadas con decahistidina (His10), se transformó E. coli BL21(DE3) con constructos pET19b. Se cosechó un precultivo de una noche mediante centrifugación y se utilizó un 1% para inocular un cultivo de expresión. Las células portadoras de pET19mgtB se cultivaron a 22°C hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,7. El cultivo se transfirió a 17°C y se sometió a pruebas de laboratorio. El cultivo se transfirió a 17°C y se indujo con 100 μM de IPTG. Después de 16 h, el cultivo se cosechó por centrifugación a 7.500 × g a 4°C. Las células se resuspendieron en 50 mM de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,3 M de NaCl a pH 7,4 y se disgregaron por ultrasonidos con un sonotrodo de micro-punta S2 en el ultrasonicador UP200St de Hielscher a un ciclo de 0,5 y una amplitud del 75%.
La sobreproducción de GtfC marcada con decahistidina se indujo a 37°C a una OD600 de 0,6 con 100 μM de IPTG. A continuación, las células se incubaron durante 4 h, se cosecharon y se lisaron como se ha indicado anteriormente para la MgtB.
Los extractos celulares crudos se centrifugaron a 15.000 × g y 4 °C para sedimentar los restos celulares. Los extractos clarificados se cargaron en columnas HisTrap FF Crude de 1 ml utilizando un sistema ÄKTAprime Plus. Las enzimas se purificaron de acuerdo con el protocolo del fabricante para la elución en gradiente de proteínas marcadas con His. Las soluciones proteicas eluidas se dializaron dos veces contra 1.000 volúmenes de 50 mM de PBS, pH 7,4, con 0,3 M de NaCl a 4 °C. La purificación se analizó con SDS-PAGE al 12%. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford utilizando Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Extracción ultrasónica de proteínas de bacterias E. coli
Una proteína cebo de interés (en este caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) se fusiona a una etiqueta GST y se expresa en células BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Tomar un pellet de GST-MTV1 y GST (correspondiente a 50 ml de cultivo bacteriano) y resuspender cada uno en 2,5 mL de tampón de extracción helado.
- Utilizar un ultrasonicador UP100H (equipado con microtip-sonotrodo MS3 para pequeños volúmenes de aprox. 2-5mL) para desorganizar las células bacterianas hasta que se lisen, lo que se indica por la reducción de la opacidad y el aumento de la viscosidad. Esto debe realizarse en hielo, y se recomienda sonicar a intervalos (por ejemplo, 10 segundos de sonicación seguidos de 10 segundos de pausa en hielo y así sucesivamente). Hay que tener cuidado de no sonicar con una intensidad demasiado alta. Si se detecta la formación de espuma o de un precipitado blanco, debe reducirse la intensidad.
- Transferir la solución de bacterias lisadas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar a 4°C, 16.000 x g durante 20 min.
Ultrasonidos de sonda como el UP400St utilizan el principio de funcionamiento de la cavitación acústica para la lisis eficaz de E. coli.
Análisis de expresión y purificación de proteínas recombinantes mediante sonicación
El pellet de E. coli se sonicó con el ultrasonicador UP100H de Hielscher. Para ello, el sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis refrigerado (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) y se enfrió en hielo durante 10 minutos. A continuación, se sonicó la suspensión celular con 10 ráfagas cortas de 10 s seguidas de un intervalo de 30 s para enfriar. Por último, los restos celulares se eliminaron por ultracentrifugación a 4°C durante 15 min a 14000 rpm. Para confirmar la expresión de rPR, el sobrenadante se corrió en un gel de poliacrilamida al 12% y se analizó por SDS-PAGE y Western blotting. La purificación de la rPR se realizó utilizando resina Ni2+-NTA (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con la guía del fabricante. En esta etapa se utilizó el método de purificación nativa. La pureza de la proteína purificada se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% y posterior tinción con azul de Coomassie. La concentración de proteína purificada se midió mediante el kit de ensayo de proteína Micro BCA (PIERCE, EE.UU.). (Azarnezhad et al. 2016)
Homogeneizadores ultrasónicos para lisis de E. coli
Hielscher Ultrasonics diseña, fabrica y suministra homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para la lisis fiable y eficaz de bacterias E. coli y otros tipos de células, tejidos y cultivos celulares.
La amplia cartera de sondas ultrasónicas, así como de sistemas de sonicación indirecta, nos permite ofrecerle el homogeneizador tisular ultrasónico ideal para su aplicación de disrupción y extracción celular.
Diseño, fabricación y consultoría – Calidad Made in Germany
Los ultrasonidos de Hielscher son conocidos por sus elevados estándares de calidad y diseño. Software inteligente, menú intuitivo, ajustes programables y protocolización automática de datos son sólo algunas de las características de los ultrasonidos Hielscher. La robustez y el fácil manejo permiten la integración sin problemas de nuestros ultrasonidos en instalaciones de investigación y biotecnología. Los ultrasonidos de Hielscher pueden utilizarse incluso en condiciones duras y entornos exigentes.
Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y pone especial énfasis en los ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología punta y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonidos de Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:
| Volumen del lote | Tasa de flujo | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| placas multipocillo? microtituladoras | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn para viales o vaso de precipitados | n.a. | CupHorn ultrasónico |
| reactor ultrasónico de microflujo | n.a. | GDmini2 |
| hasta 10 viales con 0,5 a 1,5mL | n.a. | VialTweeter |
| 0,5 a 1,5 mL | n.a. | VialTweeter |
| 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. | UP100H |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 a 20 L | 0,2 a 4 L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100 L | 2 a 10 L/min | UIP4000 |
| n.a. | 10 a 100 L/min | UIP16000 |
| n.a. | mayor | Grupo de UIP16000 |
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Protocolos adicionales para la lisis ultrasónica de E. coli
Proteínas modificadas con alicina en E. coli utilizando un VialTweeter ultrasónico
Determinación del contenido de sulfhidrilos mediante el ensayo con 5,5′-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB)
Se utilizó un cultivo de una noche de E. coli MG1655 para inocular medio MOPS mínimo (1:100). El cultivo se hizo crecer aeróbicamente hasta que se alcanzó un A600 de 0,4. El cultivo se dividió en tres cultivos de 15 ml para el tratamiento de estrés. El cultivo se dividió en tres cultivos de 15 ml para el tratamiento de estrés. Un cultivo no tratado sirvió como control negativo. Se añadió 0,79 mM de alicina (128 μg ml-1) o 1 mM de diamida a cada uno de los dos cultivos restantes. Los cultivos se incubaron durante 15 min. Se cosecharon 5 ml de cada cultivo por centrifugación (8.525 × g, 4°C, 10 min). Las células se lavaron dos veces con 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, almacenado anaeróbicamente antes de su uso) y se centrifugaron (13.000 × g, 4°C, 10 min). Las células se resuspendieron en tampón de lisis (PBS con 6 mM de HCl de guanidinio, pH 7,4) antes de disgregarlas a 4 °C mediante ultrasonidos (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Alemania) (3 × 1 min). Los restos celulares se pelletearon por centrifugación (13.000 × g, 4 °C, 15 min). El sobrenadante se transfirió a una cubeta QS-macro de 3,5 ml (10 mm) con una barra de agitación magnética y se mezcló con 1 ml de tampón de lisis. La extinción de las muestras se monitorizó a 412 nm con un espectrofotómetro Jasco V-650 equipado con el portacubetas PSC-718 de temperatura controlada a temperatura ambiente. Se añadieron 100μl de una solución de ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) 3 mM. Se monitorizó la extinción hasta que alcanzó la saturación. El cálculo de la concentración de tiol se realizó utilizando el coeficiente de extinción ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 para el ácido tio-2-nitrobenzoico (TNB). Las concentraciones celulares de tioles se calcularon sobre la base de un volumen de células de E. coli de 6,7 × 10-15 litro y una densidad celular de A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 108 células ml-1 cultura). (Müller et al. 2016)
Determinación de glutatión in vivo mediante un triturador celular ultrasónico
E.coli MG1655 se cultivó en medio MOPS mínimo en un volumen total de 200 ml hasta alcanzar un A600 de 0,5. El cultivo se dividió en cultivos de 50 ml para el tratamiento de estrés. Tras 15 min de incubación con 0,79 mM de alicina, 1 mM de diamida o dimetilsulfóxido (control), las células se cosecharon a 4.000g a 4°C durante 10 min. Las células se lavaron dos veces con tampón KPE antes de resuspender los gránulos en 700 µl de tampón KPE. Para la desproteína, se añadieron 300l de ácido sulfosalicílico al 10% (p/v) antes de disgregar las células por ultrasonidos (3 x 1 min.); VialTweeter ultrasonicador). Los sobrenadantes se recogieron tras centrifugación (30 min, 13.000g, 4°C). Las concentraciones de ácido sulfosalicílico se redujeron al 1% añadiendo 3 volúmenes de tampón KPE. Las mediciones de glutatión total y GSSG se realizaron como se ha descrito anteriormente. Las concentraciones de glutatión celular se calcularon a partir de un volumen de células de E. coli de 6,7×10-15 litro y una densidad celular de A600 0,5 (equivalente a 1×108 células ml-1 cultivo). Las concentraciones de GSH se calcularon restando el 2[GSSG] del glutatión total. (Müller et al. 2016)
Expresión de mAspAT humano en E. coli mediante un homogeneizador ultrasónico
La colonia única de E. coli BL21 (DE3) que alberga el vector de expresión en 30 mL de medio Luria-Bertani (LB) que contiene 100μg/mL de ampicilina, y después se cultivó a 37ºC hasta que la densidad óptica (DO600) alcanzó 0,6. Las células se recogieron por centrifugación a 4.000 × g durante 10 minutos y se resuspendieron en 3 L de medio LB fresco con 100μg/mL de ampicilina.
Posteriormente, se indujo la expresión proteica con 1 mM de isopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20 h a 16ºC. Las células se cosecharon por centrifugación a 8.000 × g durante 15 min y se lavaron con tampón A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Se obtuvieron aproximadamente 45 g (peso húmedo) de células de un cultivo de 3 L. Después de la centrifugación, los gránulos celulares se resuspendieron en 40 mL (para 1 L de cultivo) de tampón de extracción A enfriado con hielo, y se lisaron por ultrasonidos a temperatura de hielo utilizando el triturador celular ultrasónico UP400St de Hielscher. La lisis celular se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min para separar las fracciones solubles (sobrenadante) y precipitadas (gránulos). (Jiang et al. 2015)
Información interesante
E. coli
Escherichia coli (E. coli) es una bacteria coliforme gramnegativa, facultativamente anaerobia, con forma de bastoncillo, del género Escherichia, que suele encontrarse en la parte inferior del intestino de los organismos de sangre caliente (endotermos). Existe un gran número de cepas (o subtipos) de E. coli con características diversas. La mayoría de las cepas de E. coli son inocuas para el ser humano, por ejemplo las cepas B y K-12, que se utilizan habitualmente para aplicaciones de investigación en laboratorios. Sin embargo, algunas cepas son nocivas y pueden causar enfermedades graves.
E. coli desempeña un papel importante en la ingeniería biológica moderna y la microbiología industrial, ya que se trata de una bacteria fácil de manipular. Las aplicaciones de laboratorio más comunes suelen implicar el uso de E. coli, por ejemplo, para crear ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante o para actuar como organismo modelo.
E. coli es un huésped muy versátil para la producción de proteínas heterólogas, y existen múltiples sistemas de expresión de proteínas para producir proteínas recombinantes en E. coli. Mediante el uso de plásmidos que permiten la expresión de proteínas de alto nivel, se pueden introducir genes en la bacteria, lo que permite producir dichas proteínas en grandes cantidades en procesos de fermentación industrial.
Las E. coli se utilizan como fábricas celulares para producir insulina. Otras aplicaciones incluyen el uso de células de E. coli modificadas para desarrollar y producir vacunas y enzimas inmovilizadas, para producir biocombustibles, así como para la biorremediación.
La cepa K-12 es una forma mutante de E. coli que sobreexpresa la enzima fosfatasa alcalina (ALP). Esta mutación se produce debido a un defecto en el gen que codifica constantemente la enzima. Si un gen produce un producto sin ninguna inhibición, esto se conoce como actividad constitutiva. Esta forma mutante específica se utiliza para aislar y purificar la enzima ALP.
Las bacterias E. coli también se utilizan mucho como fábricas celulares. Los microbios (por ejemplo, las bacterias) y las células vegetales modificados genéticamente pueden utilizarse como fábricas celulares. Estas células modificadas genéticamente producen moléculas, productos químicos, polímeros, proteínas y otras sustancias que se utilizan, por ejemplo, en la industria farmacéutica, alimentaria y química. Para liberar las moléculas producidas en el interior de dichas células de bioingeniería, la lisis ultrasónica es un método habitual para alterar las paredes celulares y transferir las sustancias objetivo al líquido circundante. Más información sobre la lisis de células de bioingeniería.
Fragmentación de ADN por ultrasonidos
Las fuerzas de cizallamiento ultrasónicas son un método muy utilizado para liberar moléculas, orgánulos y proteínas del interior celular, así como para romper en pedazos las cadenas de ADN. La cavitación acústica rompe las paredes y membranas celulares para extraer el ADN de las células y generar fragmentos de unos 600 – 800 pb de longitud, ideal para el análisis.
Haga clic aquí para obtener más información sobre los homogeneizadores ultrasónicos para la fragmentación del ADN.
Literatura? Referencias
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.