Lisis ultrasónica de células modificadas mediante bioingeniería en la producción industrial

Las especies bacterianas modificadas mediante bioingeniería, como E. coli, así como los tipos de células de mamíferos y vegetales modificados genéticamente, se utilizan ampliamente en biotecnología para expresar moléculas. Para liberar estas biomoléculas sintetizadas, se necesita una técnica fiable de ruptura celular. La ultrasonicación de alto rendimiento es un método probado para una lisis celular eficiente y fiable – fácilmente escalable a grandes capacidades de procesamiento. Hielscher Ultrasonics le ofrece equipos ultrasónicos de alto rendimiento para una lisis celular eficaz que permita producir grandes volúmenes de biomoléculas de alta calidad.

Extracción de moléculas de fábricas celulares

Para producir una amplia variedad de biomoléculas, pueden utilizarse diversos microorganismos y células vegetales modificados como fábricas celulares microbianas, entre ellos Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana y algas, entre muchos otros. Estas fábricas celulares pueden producir proteínas, lípidos, sustancias bioquímicas, polímeros, biocombustibles y productos oleoquímicos, que se utilizan como alimentos o materias primas para aplicaciones industriales. Las células utilizadas como fábricas celulares se cultivan en biorreactores cerrados, donde pueden alcanzar una elevada eficiencia y especificidad con bajos requerimientos energéticos.
Para aislar las moléculas objetivo de los cultivos celulares modificados mediante bioingeniería, es necesario romper las células para liberar el material intracelular. Los disruptores celulares ultrasónicos están ampliamente consolidados como una técnica muy fiable y eficiente para la desintegración celular y la liberación de compuestos.

Las fábricas celulares microbianas son células modificadas mediante ingeniería metabólica que se utilizan para sintetizar diversos compuestos de valor. La ruptura celular ultrasónica es un método eficiente y fiable para liberar estos valiosos compuestos del interior celular.
estudio y gráfico: ©Villaverde, 2010.

Ventajas de los disruptores celulares ultrasónicos

Como tecnología no térmica, suave y, a la vez, muy eficiente, los disruptores ultrasónicos se utilizan en el laboratorio y en la industria para lisar células y producir extractos de alta calidad, por ejemplo, para aislar moléculas de fábricas celulares.

Ultrasonidos de potencia para la ruptura eficiente de fábricas celulares microbianas

Mecanismo y efectos de los disruptores celulares ultrasónicos:
La ruptura celular ultrasónica utiliza la potencia de las ondas ultrasónicas. El homogeneizador ultrasónico / disruptor celular está equipado con una sonda (también denominada sonotrodo) fabricada en una aleación de titanio que oscila a una frecuencia elevada de aproximadamente 20 kHz. Esto significa que la sonda ultrasónica acopla 20.000 vibraciones por segundo al líquido sonicado. Las ondas ultrasónicas acopladas al líquido se caracterizan por ciclos alternos de alta presión / baja presión. Durante un ciclo de baja presión, el líquido se expande y se forman diminutas burbujas de vacío. Estas burbujas muy pequeñas crecen a lo largo de varios ciclos alternos de presión hasta que ya no pueden absorber más energía. En ese momento, las burbujas de cavitación implosionan violentamente y crean, de forma local, un entorno con una extraordinaria densidad energética. Este fenómeno se conoce como cavitación acústica y se caracteriza por temperaturas y presiones locales muy elevadas, así como por fuerzas de cizallamiento. Estos esfuerzos de cizallamiento rompen eficazmente las paredes celulares y aumentan la transferencia de masa entre el interior celular y el disolvente circundante. Como técnica puramente mecánica, las fuerzas de cizallamiento generadas por ultrasonidos se utilizan ampliamente y constituyen el procedimiento recomendado para la ruptura de células bacterianas y el aislamiento de proteínas. Como método sencillo y rápido de ruptura celular, la sonicación es ideal para el aislamiento en volúmenes pequeños, medianos y grandes. Los ultrasonicadores digitales de Hielscher están equipados con un menú de ajustes claro que permite controlar con precisión la sonicación. Todos los datos de sonicación se almacenan automáticamente en una tarjeta SD integrada y son fácilmente accesibles. Las opciones avanzadas de disipación de calor, como la refrigeración externa, la sonicación en modo pulsado, etc., durante el proceso de desintegración ultrasónica garantizan el mantenimiento de la temperatura ideal del proceso y, con ello, la integridad de los compuestos termosensibles extraídos.

La investigación destaca las ventajas de la ruptura celular y la extracción ultrasónicas

El Prof. Chemat et al. (2017) resumen en su estudio que «la extracción asistida por ultrasonidos es una alternativa ecológica y económicamente viable a las técnicas convencionales para alimentos y productos naturales. Los principales beneficios son la reducción del tiempo de extracción y procesamiento, de la cantidad de energía y disolventes utilizados, de las operaciones unitarias y de las emisiones de CO₂ ».
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaron un homogeneizador de alta presión y un desintegrador celular ultrasónico en su estudio sobre la lisis de esporas para liberar ADN. Al comparar ambos métodos de ruptura celular, el equipo de investigación concluye, respecto a la lisis celular para obtener ADN de esporas, que «el análisis se realizó utilizando lisados celulares obtenidos mediante homogeneización a alta presión. Posteriormente, nos dimos cuenta de que la ruptura celular ultrasónica presenta ventajas excepcionales para este fin. Es bastante rápida y puede aplicarse a volúmenes de muestra pequeños». (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoléculas de fábricas celulares para la producción de alimentos

Las fábricas celulares microbianas constituyen una metodología de producción viable y eficiente que utiliza organismos microbianos para obtener altos rendimientos de metabolitos nativos y no nativos mediante la bioingeniería metabólica de microorganismos como bacterias, levaduras, hongos, etc. Por ejemplo, las enzimas a granel se producen utilizando microorganismos como Aspergillus oryzae, hongos y bacterias. Estas enzimas a granel se utilizan en la producción de alimentos y bebidas, así como en la agricultura, la bioenergía y el cuidado del hogar.
Ciertas bacterias, como Acetobacter xylinum y Gluconacetobacter xylinus, producen celulosa durante el proceso de fermentación, en el que se sintetizan nanofibras mediante un proceso de ensamblaje de abajo arriba. La celulosa bacteriana (también conocida como celulosa microbiana) es químicamente equivalente a la celulosa vegetal, pero presenta un alto grado de cristalinidad y una elevada pureza (sin lignina, hemicelulosa, pectina ni otros componentes biogénicos), así como una estructura única de red reticulada tridimensional (3D) formada por nanofibras de celulosa entretejidas. (cf. Zhong, 2020) En comparación con la celulosa de origen vegetal, la celulosa bacteriana es más sostenible y la celulosa producida es pura, sin necesidad de pasos de purificación complejos. La ultrasonicación y la extracción con disolventes utilizando NaOH o SDS (dodecilsulfato de sodio) son muy eficaces para aislar la celulosa bacteriana de las células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas celulares para la producción de productos farmacéuticos y vacunas

Uno de los productos farmacéuticos más destacados obtenidos de fábricas celulares es la insulina humana. Para producir insulina mediante bioingeniería, se utilizan principalmente E. coli y Saccharomyces cerevisiae. Dado que las moléculas de tamaño nanométrico biosintetizadas ofrecen una elevada biocompatibilidad, las nanopartículas biológicas, como la ferritina, resultan ventajosas para numerosas aplicaciones de biofabricación. Además, la producción en microorganismos modificados mediante ingeniería metabólica suele ser significativamente más eficaz en cuanto a los rendimientos obtenidos. Por ejemplo, la producción de ácido artemisínico, resveratrol y licopeno se ha multiplicado entre diez y varios cientos de veces, y la producción a escala industrial ya está implantada o en fase de desarrollo. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Por ejemplo, las biomoléculas de tamaño nanométrico basadas en proteínas y con propiedades de autoensamblaje, como la ferritina y las partículas similares a virus, son especialmente interesantes para el desarrollo de vacunas, ya que imitan tanto el tamaño como la estructura de los patógenos y permiten la conjugación de antígenos en su superficie para favorecer la interacción con las células inmunitarias. Estas moléculas se expresan en las denominadas fábricas celulares (por ejemplo, cepas modificadas de E. coli), que producen una molécula objetivo determinada.

Protocolo de lisis ultrasónica de E. coli BL21 para liberar ferritina

La ferritina es una proteína cuya función principal es almacenar hierro. La ferritina presenta un potencial prometedor como nanopartículas autoensamblables en vacunas, donde se utiliza como vehículo de administración de vacunas (por ejemplo, proteínas de la espícula de SARS-Cov-2). La investigación científica de Sun et. al. (2016) muestra que la ferritina recombinante puede liberarse en forma soluble de Escherichia coli a bajas concentraciones de NaCl (≤50 mmol/L). Para expresar ferritina en E. coli BL21 y liberarla, se aplicó con éxito el siguiente protocolo. Se introdujo el plásmido recombinante pET-28a/ferritin mediante transformación en la cepa E coli BL21 (DE3). Las células E coli BL21 (DE3) productoras de ferritina se cultivaron en medios de crecimiento LB con 0,5% de kanamicina a 37 °C y se indujeron a una OD600 de 0,6 con 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37 °C. A continuación, el cultivo final se cosechó mediante centrifugación a 8000 g durante 10 minutos a 4 °C y se recogió el sedimento. Después, el sedimento se resuspendió, respectivamente, en medio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% de extracto de levadura)/tampón de lisis (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) y en soluciones de NaCl de diferentes concentraciones (0, 50, 100, 170 y 300 mmol/L). Para la lisis de las células bacterianas, se aplicó sonicación en modo pulsado: por ejemplo, utilizando el ultrasonicador UP400St al 100% de amplitud con un ciclo de trabajo de 5 segundos de activación y 10 segundos de pausa, durante 40 ciclos) y, a continuación, se centrifugó a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante y el precipitado se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Todos los geles teñidos con dodecilsulfato de sodio se digitalizaron con un escáner de alta resolución. Las imágenes de los geles se analizaron con el software Magic Chemi 1D. Para obtener una claridad óptima, las bandas de proteínas se detectaron ajustando los parámetros. Los datos de las bandas se generaron a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

Disruptores celulares ultrasónicos para la lisis industrial de fábricas celulares

La lisis y la extracción ultrasónicas constituyen un método fiable y práctico para liberar metabolitos de fábricas celulares, lo que contribuye a una producción eficaz de las moléculas objetivo. Los disruptores celulares ultrasónicos están disponibles en tamaños de laboratorio e industriales, y los procesos pueden escalarse de forma completamente lineal.
Hielscher Ultrasonics es su socio especializado en disruptores ultrasónicos de alto rendimiento y cuenta con una amplia experiencia en la implantación de sistemas ultrasónicos en instalaciones de sobremesa e industriales.
En cuanto a hardware y software avanzados, los sistemas de ruptura celular de Hielscher Ultrasonics cumplen todos los requisitos para un control óptimo del proceso, un manejo sencillo y una gran facilidad de uso. Los clientes y usuarios de los ultrasonicadores de Hielscher valoran que los disruptores celulares y extractores ultrasónicos de Hielscher permitan supervisar y controlar el proceso con precisión – mediante una pantalla táctil digital y control remoto a través de un navegador. Todos los datos importantes de sonicación (por ejemplo, energía neta, energía total, amplitud, duración, temperatura y presión) se almacenan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD integrada. Esto ayuda a obtener resultados reproducibles y repetibles y facilita la estandarización del proceso, así como el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación (cGMP).
Por supuesto, los procesadores ultrasónicos de Hielscher están diseñados para funcionar 24/7 a plena carga y, por tanto, pueden utilizarse de forma fiable en entornos de producción industrial. Gracias a su elevada robustez y sus bajas necesidades de mantenimiento, el tiempo de inactividad de los equipos ultrasónicos es muy reducido. Las funciones CIP (limpieza in situ) y SIP (esterilización in situ) minimizan las tareas laboriosas de limpieza, especialmente porque todas las piezas en contacto con el líquido tienen superficies metálicas lisas (sin orificios ni boquillas ocultos).

La tabla siguiente ofrece una indicación de la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros ultrasonicadores: