Lisis ultrasónica de células de bioingeniería en la producción industrial

Las bacterias de bioingeniería, como E. coli, y las células de mamíferos y plantas modificadas genéticamente se utilizan mucho en biotecnología para expresar moléculas. Para liberar estas biomoléculas sintetizadas, se requiere una técnica fiable de disrupción celular. La ultrasonicación de alto rendimiento es un método probado para la lisis celular eficaz y fiable. – fácilmente escalable a grandes producciones. Hielscher Ultrasonics le ofrece equipos ultrasónicos de alto rendimiento para la lisis celular eficaz con el fin de producir grandes volúmenes de biomoléculas de alta calidad.

Extracción de moléculas de las fábricas celulares

Para la producción de una amplia gama de biomoléculas, pueden utilizarse como fábricas celulares microbianas diversos microbios y células vegetales manipulados, como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana y algas, entre muchos otros. Estas fábricas celulares pueden producir proteínas, lípidos, bioquímicos, polímeros, biocombustibles y oleoquímicos, que se utilizan como alimento o materia prima para aplicaciones industriales. Las células utilizadas como fábricas celulares se cultivan en biorreactores cerrados, donde pueden alcanzar una alta eficiencia, especificidad y bajos requerimientos energéticos.
Para aislar las moléculas diana de los cultivos celulares de bioingeniería, hay que desintegrar las células para que se libere el material intracelular. Los disruptores celulares ultrasónicos son una técnica muy fiable y eficaz para la desintegración celular y la liberación de compuestos.

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La desintegración celular por ultrasonidos se utiliza para aislar compuestos de las fábricas de células bacterianas.

Desintegradores celulares ultrasónicos como el UIP2000hdT se utilizan para aislar compuestos de las fábricas de células microbianas.

Las fábricas de células microbianas son células de ingeniería metabólica utilizadas para la síntesis de diversos compuestos, como sustancias bioactivas, principios activos farmacéuticos (API), biocombustibles, polímeros y proteínas. Los desintegradores celulares ultrasónicos son fiables, rápidos y eficaces cuando se trata de aislar esos valiosos compuestos del interior celular.

Las fábricas de células microbianas son células de ingeniería metabólica utilizadas para la síntesis de diversos compuestos valiosos. La disrupción celular por ultrasonidos es un método eficaz y fiable para liberar los compuestos valiosos del interior celular.
estudio y gráfico: ©Villaverde, 2010.

Ventajas de los disruptores celulares ultrasónicos

Como tecnología no térmica, suave pero muy eficaz, los disruptores ultrasónicos se utilizan en el laboratorio y en la industria para lisar células y producir extractos de alta calidad, por ejemplo, utilizados para el aislamiento de moléculas de fábricas celulares.

¿Por qué ultrasonidos para la disrupción celular?

  • Alta eficiencia
  • No térmico, ideal para sustancias sensibles a la temperatura
  • Resultados fiables y repetibles
  • Control preciso del procesamiento
  • Escalabilidad lineal a mayores caudales
  • Disponible para capacidades de producción industrial

Ultrasonidos de potencia para la interrupción eficaz de las fábricas de células microbianas

Mecanismo y efectos de los disruptores celulares ultrasónicos:
La disrupción celular por ultrasonidos se utiliza en laboratorio y a escala industrial para alterar células microbianas metabólicamente modificadas, las llamadas fábricas celulares, con el fin de liberar compuestos valiosos.La disrupción celular por ultrasonidos utiliza la potencia de las ondas ultrasónicas. El homogeneizador / disruptor celular ultrasónico está equipado con una sonda (también conocida como sonotrodo) fabricada con una aleación de titanio que oscila a una alta frecuencia de aproximadamente 20 kHz. Esto significa que la sonda ultrasónica acopla 20.000 vibraciones por segundo en el líquido sonicado. Las ondas ultrasónicas acopladas en el líquido se caracterizan por la alternancia de ciclos de alta y baja presión. Durante un ciclo de baja presión, el líquido se expande y surgen diminutas burbujas de vacío. Estas pequeñísimas burbujas crecen a lo largo de varios ciclos de presión alterna hasta que ya no pueden absorber más energía. En ese momento, las burbujas de cavitación implosionan violentamente y crean localmente un entorno de extraordinaria densidad energética. Este fenómeno se conoce como cavitación acústica y se caracteriza por temperaturas localmente muy elevadas, presiones muy altas y fuerzas de cizallamiento. Estas fuerzas de cizallamiento rompen eficazmente las paredes celulares y aumentan la transferencia de masa entre el interior de la célula y el disolvente circundante. Como técnica puramente mecánica, las fuerzas de cizallamiento generadas por ultrasonidos son ampliamente utilizadas y el procedimiento recomendado para la disrupción de células bacterianas, así como para el aislamiento de proteínas. Como método de disrupción celular sencillo y rápido, la sonicación es ideal para el aislamiento de volúmenes pequeños, medianos y grandes. Los ultrasonicadores digitales de Hielscher están equipados con un claro menú de ajustes para un control preciso de la sonicación. Todos los datos de sonicación se almacenan automáticamente en una tarjeta SD integrada y son fácilmente accesibles. Las sofisticadas opciones de disipación del calor, como la refrigeración externa, la sonicación en modo pulsado, etc. durante el proceso de desintegración por ultrasonidos, garantizan el mantenimiento de la temperatura ideal del proceso y, por tanto, la integridad de los compuestos termosensibles extraídos.

La investigación subraya las ventajas de la disrupción y extracción celular por ultrasonidos

El Prof. Chemat et al. (2017) resume en su estudio que "la extracción asistida por ultrasonidos es una alternativa ecológica y económicamente viable a las técnicas convencionales para alimentos y productos naturales. Las principales ventajas son la reducción del tiempo de extracción y procesamiento, la cantidad de energía y disolventes utilizados, las operaciones unitarias y las emisiones de CO2 de la UE".
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaron en su estudio un homogeneizador de alta presión y un desintegrador celular ultrasónico para la lisis de esporas con el fin de liberar ADN. Comparando ambos métodos de disrupción celular, el equipo de investigación concluye que, en lo que respecta a la lisis celular para obtener ADN de esporas, "el análisis se ha realizado empleando lisados celulares procedentes de la homogeneización a alta presión. Posteriormente, nos dimos cuenta de que la disrupción celular por ultrasonidos presenta ventajas sobresalientes para este fin. Es bastante rápida y puede procesarse para pequeños volúmenes de muestra". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

El potente procesador ultrasónico UIP4000hdT de 4000 vatios se utiliza para alterar células de bioingeniería (es decir, fábricas celulares) con el fin de liberar moléculas diana.

Desintegrador industrial de células por ultrasonidos UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) para el aislamiento continuo en línea y la purificación de compuestos sintetizados a partir de fábricas de células microbianas.

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Biomoléculas de fábricas celulares para la producción de alimentos

Las fábricas de células microbianas son una metodología de producción viable y eficiente que utiliza organismos microbianos para producir altos rendimientos de metabolitos nativos y no nativos mediante bioingeniería metabólica de microorganismos microbianos como bacterias, levaduras, hongos, etc. Las enzimas a granel se producen, por ejemplo, utilizando microorganismos como Aspergillus oryzae, hongos y bacterias. Estas enzimas a granel se utilizan en la producción de alimentos y bebidas, así como en la agricultura, la bioenergía y el cuidado del hogar.
Ciertas bacterias como Acetobacter xylinum y Gluconacetobacter xylinus producen celulosa durante el proceso de fermentación, en el que se sintetizan nanofibras en un proceso ascendente. La celulosa bacteriana (también conocida como celulosa microbiana) es químicamente equivalente a la celulosa vegetal, pero tiene un alto grado de cristalinidad y una gran pureza (libre de lignina, hemicelulosa, pectina y otros componentes biogénicos), así como una estructura única de red reticulada tridimensional (3D) tejida con nanofibras de celulosa. (cf. Zhong, 2020) En comparación con la celulosa de origen vegetal, la celulosa bacteriana es más sostenible y la celulosa producida es pura, sin necesidad de complejos pasos de purificación. La ultrasonicación y la extracción con disolventes utilizando NaOH o SDS (dodecil sulfato sódico) son muy eficaces para el aislamiento de la celulosa bacteriana a partir de las células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas celulares para la producción farmacéutica y de vacunas

Uno de los productos farmacéuticos más destacados derivados de fábricas celulares es la insulina humana. Para la producción de insulina mediante bioingeniería se utilizan sobre todo E. coli y Saccharomyces cerevisiae. Dado que las moléculas nanométricas biosintetizadas ofrecen una gran biocompatibilidad, las nanopartículas biológicas como la ferritina resultan ventajosas para numerosas aplicaciones de biofabricación. Además, la producción en microbios de ingeniería metabólica suele ser significativamente más eficaz en los rendimientos obtenidos. Por ejemplo, la producción de ácido artemisínico, resveratrol y licopeno se ha multiplicado de diez a varios cientos de veces, y ya está establecida o se encuentra en fase de desarrollo para la producción a escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Por ejemplo, las biomoléculas de tamaño nanométrico basadas en proteínas con propiedades de autoensamblaje, como la ferritina y las partículas similares a virus, son especialmente interesantes para el desarrollo de vacunas, ya que imitan tanto el tamaño como la estructura de los patógenos y son susceptibles de conjugación superficial de antígenos para promover la interacción con las células inmunitarias. Estas moléculas se expresan en las denominadas fábricas celulares (por ejemplo, cepas de E. coli manipuladas), que producen una determinada molécula diana.

Protocolo de lisis ultrasónica y de E. coli BL21 para la liberación de ferritina

La ferritina es una proteína cuya función principal es el almacenamiento de hierro. La ferritina muestra capacidades prometedoras como nanopartículas autoensamblables en vacunas, donde se utiliza como vehículo de administración de vacunas (por ejemplo, proteínas de espiga SARS-Cov-2). La investigación científica de Sun et. al. (2016) muestra que la ferritina recombinante puede liberarse como forma soluble a partir de Escherichia coli a bajas concentraciones de NaCl (≤50 mmol/L). Para expresar la ferritina en E. coli BL21 y liberar la ferrtina, se aplicó con éxito el siguiente protocolo. El plásmido recombinante pET-28a/ferritina se transformó en la cepa E coli BL21 (DE3). Las células de ferritina E coli BL21 (DE3) se cultivaron en medio de crecimiento LB con 0,5% de kanamicina a 37°C y se indujeron a una DO600 de 0,6 con 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37°C. El cultivo final se cosechó por centrifugación a 8000g durante 10 minutos a 4°C, y se recogió el pellet. A continuación, el precipitado se resuspendió en medio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extracto de levadura)/tampón de lisis (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) y diferentes concentraciones de solución de NaCl (0, 50, 100, 170 y 300 mmol/L), respectivamente. Para la lisis de las células bacterianas, la sonicación se aplicó en modo de impulsos: por ejemplo, utilizando el botón Ultrasonidos UP400St al 100% de amplitud con un ciclo de trabajo de 5 segundos ON, 10 segundos OFF, durante 40 ciclos) y luego se centrifugó a 10 000g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante y el precipitado se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Todos los geles teñidos con dodecil sulfato sódico se escanearon con un escáner de alta resolución. Las imágenes del gel se analizaron con el software Magic Chemi 1D. Para una claridad óptima, las bandas de proteínas se detectaron ajustando los parámetros. Los datos de las bandas se generaron a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

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Disruptores celulares ultrasónicos para la lisis industrial de fábricas celulares

La lisis y extracción por ultrasonidos es un método fiable y cómodo para liberar metabolitos de las fábricas celulares y contribuir así a una producción eficaz de las moléculas objetivo. Los disruptores celulares ultrasónicos están disponibles desde tamaño de laboratorio hasta industrial y los procesos pueden escalarse de forma completamente lineal.
Hielscher Ultrasonics es su socio competente para disruptores ultrasónicos de alto rendimiento y cuenta con una larga experiencia en el campo de la implantación de sistemas ultrasónicos en entornos de sobremesa e industriales.
Los ultrasonidos de Hielscher pueden controlarse a distancia mediante un navegador. Los parámetros de sonicación pueden supervisarse y ajustarse con precisión a los requisitos del proceso.Cuando se trata de hardware y software sofisticados, los sistemas de disrupción celular de Hielscher Ultrasonics cumplen todos los requisitos para un control óptimo del proceso, un manejo sencillo y una gran facilidad de uso. Los clientes y usuarios de los ultrasonicadores de Hielscher valoran la ventaja de que los disruptores y extractores celulares ultrasónicos de Hielscher permiten la supervisión y el control precisos del proceso – mediante una pantalla táctil digital y un mando a distancia con navegador. Todos los datos de sonicación importantes (por ejemplo, energía neta, energía total, amplitud, duración, temperatura, presión) se almacenan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD integrada. Esto ayuda a obtener resultados reproducibles y repetibles y facilita la estandarización del proceso, así como el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP).
Por supuesto, los procesadores por ultrasonidos de Hielscher están diseñados para funcionar las 24 horas del día, los 7 días de la semana, a plena carga, por lo que pueden utilizarse de forma fiable en entornos de producción industrial. Gracias a su gran robustez y bajo mantenimiento, el tiempo de inactividad de los equipos de ultrasonidos es realmente bajo. Las funciones CIP (limpieza in situ) y SIP (esterilización in situ) minimizan la laboriosa limpieza, especialmente porque todas las piezas húmedas son superficies metálicas lisas (sin orificios ni boquillas ocultos).

En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Los homogeneizadores ultrasónicos de alto cizallamiento se utilizan en procesos de laboratorio, de sobremesa, piloto e industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.



Literatura / Referencias

Información interesante

sono-biorreactores

Los ultrasonidos se utilizan, por un lado, para alterar las células con el fin de liberar compuestos intracelulares, pero aplicados con amplitudes más suaves y/o como ráfagas de ultrasonidos pulsátiles, la sonicación puede mejorar enormemente la productividad metabólica de células microbianas, vegetales y animales en biorreactores, impulsando así los procesos biotecnológicos. Las sondas ultrasónicas pueden integrarse fácilmente en los biorreactores (los llamados sono-biorreactores) para intensificar la eficacia de los biocatalizadores vivos. Los ultrasonicadores de Hielscher permiten controlar con precisión las condiciones de los ultrasonidos, que pueden ajustarse de forma óptima para conseguir una elevada conversión catalítica de las células vivas. Obtenga más información sobre las sondas ultrasónicas de Hielscher para sonobiorreactores y los efectos de la biocatálisis mejorada por ultrasonidos.

Las fábricas celulares y la síntesis de metabolitos

Diferentes microorganismos pueden sintetizar metabolitos similares, por ejemplo, para la producción de aminoácidos se han utilizado con éxito Corynebacterium, Brevibacterium y Escherichia coli; las vitaminas se han sintetizado utilizando Propionibacterium y Pseudomonas; los ácidos orgánicos se obtienen a partir de Aspergillus, Lactobacillus, Rhizopus; mientras que las enzimas pueden fabricarse mediante Aspergillus y Bacillus; los antibióticos pueden producirse mediante Streptomyces y Penicillium; mientras que para la producción de biosurfactantes comúnmente formados se utilizan Pseudomonas, Bacillus y Lactobacillus como fábricas celulares.

E. Coli como fábricas de células microbianas

La bacteria E. coli y sus numerosas cepas se utilizan ampliamente en biología molecular y se han convertido en uno de los primeros modelos celulares eficientes utilizados como fábricas de células microbianas para la producción de proteínas recombinantes, biocombustibles y otras sustancias químicas. E. coli presenta una capacidad natural para producir varios compuestos, que se ha mejorado mediante bioingeniería y modificaciones genéticas. Por ejemplo, mediante la transferencia de enzimas heterólogas, se ha modificado la capacidad de E. coli para producir numerosos productos con el fin de desarrollar nuevas vías biosintéticas.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)

Los Streptomyces como fábricas celulares microbianas

Streptomyces es el mayor grupo de actinomicetos; las especies de Streptomyces están muy extendidas en ecosistemas acuáticos y terrestres. Los miembros del género Streptomyces son de interés comercial por su capacidad para producir un enorme número de biomoléculas y metabolitos secundarios bioactivos. Producen antibióticos clínicamente útiles como tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos, cloranfenicol y rifamicinas. Además de antibióticos, los Streptomyces también producen otros productos farmacéuticos de gran valor, como anticancerígenos, inmunoestimulantes, inmunosupresores, agentes antioxidantes, insecticidas y antiparasitarios, que tienen amplias aplicaciones médicas y agrícolas.
Las especies de Streptomyces producen una serie de enzimas de importancia médica, como la L-asparaginasa, la uricasa y la colesterol oxidasa. Muchos actinomicetos pueden producir enzimas de importancia industrial como celulasas, quitinasas, quitosanasas, α-amilasas, proteasas y lipasas. Muchos actinomicetos pueden producir diferentes pigmentos que son potencialmente una buena alternativa a los colores sintéticos. Las especies de Streptomyces tienen una gran capacidad para producir biomoléculas superficiales activas, como bioemulsionantes y biosurfactantes. La acarbosa antidiabética fue producida por cepas de Streptomyces mediante fermentación microbiana. Las especies de Streptomyces han demostrado la capacidad de sintetizar inhibidores de la síntesis del colesterol, como la pravastatina. Recientemente, las especies de Streptomyces pueden utilizarse como "nanofactorías" respetuosas con el medio ambiente para la síntesis de nanopartículas. Algunas especies de Streptomyces son prometedoras para la producción de vitamina B12.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonicador compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.


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