Lisis ultrasónica de células de bioingeniería en la producción industrial

Las especies de bacterias de bioingeniería, como E. coli, así como los tipos de células de mamíferos y plantas modificadas genéticamente, se utilizan ampliamente en biotecnología para expresar moléculas. Para liberar estas biomoléculas sintetizadas, se requiere una técnica fiable de disrupción celular. La ultrasonicación de alto rendimiento es un método probado para la lisis celular eficiente y fiable – fácilmente escalable a grandes rendimientos. Hielscher Ultrasonics le ofrece equipos de ultrasonidos de alto rendimiento para la lisis celular eficaz con el fin de producir grandes volúmenes de biomoléculas de alta calidad.

Extracción de moléculas de las fábricas de células

Para la producción de una amplia gama de biomoléculas, se pueden utilizar diversos microbios y células vegetales de ingeniería como fábricas celulares microbianas, como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana y algas, entre muchos otros. Estas fábricas celulares pueden producir proteínas, lípidos, productos bioquímicos, polímeros, biocombustibles y oleoquímicos, que se utilizan como alimento o materia prima para aplicaciones industriales. Las células utilizadas como fábricas celulares se cultivan en biorreactores cerrados, donde pueden alcanzar una alta eficiencia, especificidad y bajos requerimientos de energía.
Para aislar las moléculas objetivo de los cultivos celulares de bioingeniería, hay que desintegrar las células para que se libere el material intracelular. Los disruptores celulares ultrasónicos están bien establecidos como técnica altamente fiable y eficiente para la desintegración celular y la liberación de compuestos.

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La desintegración celular por ultrasonidos se utiliza para aislar compuestos de las fábricas de células bacterianas.

Los desintegradores de células por ultrasonidos, como el UIP2000hdT se utilizan para aislar compuestos de las fábricas de células microbianas.

Las fábricas de células microbianas son células de ingeniería metabólica que se utilizan para la síntesis de diversos compuestos, como sustancias bioactivas, ingredientes farmacéuticos activos (API), biocombustibles, polímeros y proteínas. Los desintegradores celulares por ultrasonidos son fiables, rápidos y eficaces a la hora de aislar esos valiosos compuestos del interior de las células.

Las fábricas de células microbianas son células de ingeniería metabólica utilizadas para la síntesis de diversos compuestos valiosos. La disrupción celular por ultrasonidos es un método eficaz y fiable para liberar los compuestos valiosos del interior celular.
estudio y gráfico: ©Villaverde, 2010.

Ventajas de los disruptores celulares por ultrasonidos

Al ser una tecnología no térmica, suave y muy eficaz, los disruptores ultrasónicos se utilizan en el laboratorio y en la industria para lisar células y producir extractos de alta calidad, por ejemplo, utilizados para el aislamiento de moléculas de las fábricas de células.

¿Por qué los ultrasonidos para la disrupción celular?

  • Alta eficiencia
  • No térmico, ideal para sustancias sensibles a la temperatura
  • Resultados fiables y repetibles
  • Control preciso del procesamiento
  • Escalable linealmente a mayores rendimientos
  • Disponible para capacidades de producción industrial

Ultrasonido de potencia para la interrupción eficaz de las fábricas de células microbianas

Mecanismo y efectos de los disruptores celulares ultrasónicos:
La disrupción celular por ultrasonidos se utiliza a escala industrial y de banco para disolver células microbianas de ingeniería metabólica, las llamadas fábricas celulares, para liberar compuestos valiosos.La disrupción celular por ultrasonidos utiliza la potencia de las ondas ultrasónicas. El homogeneizador/disruptor celular por ultrasonidos está equipado con una sonda (también conocida como sonotrodo) hecha de una aleación de titanio que oscila a una alta frecuencia de aproximadamente 20 kHz. Esto significa que la sonda ultrasónica acopla 20.000 vibraciones por segundo en el líquido sonicado. Las ondas ultrasónicas acopladas en el líquido se caracterizan por la alternancia de ciclos de alta y baja presión. Durante un ciclo de baja presión, el líquido se expande y surgen diminutas burbujas de vacío. Estas pequeñísimas burbujas crecen a lo largo de varios ciclos de presión alternados hasta que no pueden absorber más energía. En ese momento, las burbujas de cavitación implosionan violentamente y crean localmente un entorno de extraordinaria densidad energética. Este fenómeno se conoce como cavitación acústica y se caracteriza por temperaturas localmente muy altas, presiones muy elevadas y fuerzas de cizallamiento. Estas fuerzas de cizallamiento rompen eficazmente las paredes celulares y aumentan la transferencia de masa entre el interior de la célula y el disolvente circundante. Como técnica puramente mecánica, las fuerzas de cizallamiento generadas por ultrasonidos son ampliamente utilizadas y el procedimiento recomendado para la disrupción de células bacterianas, así como para el aislamiento de proteínas. Como método de disrupción celular sencillo y rápido, la sonicación es ideal para el aislamiento de volúmenes pequeños, medianos y grandes. Los ultrasonidos digitales de Hielscher están equipados con un claro menú de ajustes para un control preciso de la sonicación. Todos los datos de sonicación se almacenan automáticamente en una tarjeta SD integrada y son fácilmente accesibles. Las sofisticadas opciones de disipación del calor, como la refrigeración externa, la sonicación en modo pulsado, etc. durante el proceso de desintegración por ultrasonidos, garantizan el mantenimiento de la temperatura ideal del proceso y, por tanto, la integridad de los compuestos sensibles al calor extraídos.

La investigación subraya los puntos fuertes de la disrupción y extracción celular por ultrasonidos

El profesor Chemat et al. (2017) resume en su estudio que "la extracción asistida por ultrasonidos es una alternativa ecológica y económicamente viable a las técnicas convencionales para alimentos y productos naturales. Los principales beneficios son la disminución del tiempo de extracción y procesamiento, la cantidad de energía y disolventes utilizados, las operaciones unitarias y las emisiones de CO2 de las emisiones".
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaron en su estudio un homogeneizador de alta presión y un dsintegrador celular ultrasónico para la lisis de esporas con el fin de liberar ADN. Comparando ambos métodos de disrupción celular, el equipo de investigación concluye que en lo que respecta a la lisis celular para el ADN de las esporas, "el análisis se ha realizado empleando lisados celulares de la homogeneización de alta presión. Posteriormente, nos dimos cuenta de que la disrupción celular por ultrasonidos presenta ventajas extraordinarias para este fin. Es bastante rápida y puede procesarse para pequeños volúmenes de muestra". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

El potente procesador ultrasónico UIP4000hdT de 4000 vatios se utiliza para interrumpir las células de bioingeniería (es decir, las fábricas de células) con el fin de liberar las moléculas objetivo.

Desintegrador industrial de células por ultrasonidos UIP4000hdT (4000W, 20kHz) para el aislamiento y la purificación continuos en línea de compuestos sintetizados a partir de fábricas de células microbianas.

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Biomoléculas de las fábricas de células para la producción de alimentos

Las fábricas de células microbianas son una metodología de producción viable y eficiente que utiliza organismos microbianos para producir altos rendimientos de metabolitos nativos y no nativos mediante la bioingeniería metabólica de microorganismos como bacterias, levaduras, hongos, etc. Las enzimas a granel se producen, por ejemplo, utilizando microorganismos como Aspergillus oryzae, hongos y bacterias. Estas enzimas a granel se utilizan en la producción de alimentos y bebidas, así como en la agricultura, la bioenergía y el cuidado del hogar.
Algunas bacterias, como Acetobacter xylinum y Gluconacetobacter xylinus, producen celulosa durante el proceso de fermentación, en el que se sintetizan nanofibras en un proceso ascendente. La celulosa bacteriana (también conocida como celulosa microbiana) es químicamente equivalente a la celulosa vegetal, pero tiene un alto grado de cristalinidad y alta pureza (libre de lignina, hemicelulosa, pectina y otros componentes biogénicos), así como una estructura única de red reticulada tridimensional (3D) tejida con nanofibras de celulosa. (cf. Zhong, 2020) En comparación con la celulosa de origen vegetal, la celulosa bacteriana es más sostenible y la celulosa producida es pura y no requiere complejos pasos de purificación. La ultrasonicación y la extracción con disolventes utilizando NaOH o SDS (dodecil sulfato de sodio) son muy eficaces para el aislamiento de la celulosa bacteriana de las células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas de células para la producción farmacéutica y de vacunas

Uno de los productos farmacéuticos más destacados derivados de las fábricas de células es la insulina humana. Para la producción de insulina mediante bioingeniería se utilizan principalmente E. coli y Saccharomyces cerevisiae. Dado que las moléculas de tamaño nanométrico biosintetizadas ofrecen una gran biocompatibilidad, las nanopartículas biológicas como la ferritina son ventajosas para numerosas aplicaciones de biofabricación. Además, la producción en microbios de ingeniería metabólica suele ser significativamente más eficaz en los rendimientos obtenidos. Por ejemplo, la producción de ácido artemisínico, resveratrol y licopeno se ha multiplicado de diez a varios cientos de veces, y ya está establecida o está en desarrollo para la producción a escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Por ejemplo, las biomoléculas de tamaño nanométrico basadas en proteínas con propiedades de autoensamblaje, como la ferritina y las partículas similares a los virus, son especialmente interesantes para el desarrollo de vacunas, ya que imitan tanto el tamaño como la estructura de los patógenos y son susceptibles de conjugación superficial de antígenos para promover la interacción con las células inmunitarias. Estas moléculas se expresan en las llamadas fábricas celulares (por ejemplo, cepas de E. coli modificadas), que producen una determinada molécula objetivo.

Protocolo de lisis ultrasónica y de E. coli BL21 para la liberación de ferritina

La ferritina es una proteína cuya función principal es el almacenamiento de hierro. La ferritina muestra capacidades prometedoras como nanopartículas autoensambladas en vacunas, donde se utiliza como vehículo de entrega de vacunas (por ejemplo, las proteínas de espiga del SARS-Cov-2). La investigación científica de Sun et. al. (2016) muestra que la ferritina recombinante puede liberarse como forma soluble a partir de Escherichia coli a bajas concentraciones de NaCl (≤50 mmol/L). Para expresar la ferritina en E. coli BL21 y liberar la ferrtina, se aplicó con éxito el siguiente protocolo. El plásmido recombinante pET-28a/ferritina se transformó en la cepa E coli BL21 (DE3). Las células de E coli BL21 (DE3) con ferritina se cultivaron en medio de crecimiento LB con 0,5% de kanamicina a 37°C y se indujeron a una DO600 de 0,6 con 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37°C. El cultivo final se cosechó por centrifugación a 8000g durante 10 minutos a 4°C, y se recogió el pellet. A continuación, el pellet se resuspendió en medio LB (1% de NaCl, 1% de Typone, 0,5% de extracto de levadura)/tampón de lisis (20 mmol/L de Tris, 50 mmol/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, pH 7,6) y diferentes concentraciones de solución de NaCl (0, 50, 100, 170 y 300 mmol/L), respectivamente. Para la lisis de las células bacterianas, la sonicación se aplicó en modo de pulso: por ejemplo, utilizando el ultrasonido UP400St al 100% de amplitud con un ciclo de trabajo de 5 segundos ON, 10 segundos OFF, durante 40 ciclos) y luego se centrifugó a 10 000g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante y el precipitado se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Todos los geles teñidos con dodecil sulfato de sodio se escanearon con un escáner de alta resolución. Las imágenes del gel se analizaron con el software Magic Chemi 1D. Para obtener una claridad óptima, las bandas de proteínas se detectaron ajustando los parámetros. Los datos de las bandas se generaron a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

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Disruptores celulares ultrasónicos para la lisis industrial de fábricas de células

La lisis y extracción por ultrasonidos es un método fiable y cómodo para liberar los metabolitos de las fábricas de células, ayudando así a una producción eficaz de las moléculas objetivo. Los disruptores celulares por ultrasonidos están disponibles desde el tamaño de laboratorio hasta el industrial y los procesos se pueden escalar de forma completamente lineal.
Hielscher Ultrasonics es su socio competente en materia de disruptores ultrasónicos de alto rendimiento y cuenta con una larga experiencia en el campo de la implantación de sistemas de ultrasonidos en entornos de banco e industriales.
Los ultrasonidos de Hielscher pueden controlarse a distancia a través de un navegador. Los parámetros de sonicación se pueden supervisar y ajustar con precisión a los requisitos del proceso.Cuando se trata de hardware y software sofisticados, los sistemas de disrupción celular de Hielscher Ultrasonics cumplen todos los requisitos para un control óptimo del proceso, un manejo sencillo y una gran facilidad de uso. Los clientes y usuarios de los ultrasonidos de Hielscher valoran la ventaja de que los disruptores y extractores de células por ultrasonidos de Hielscher permiten la supervisión y el control precisos del proceso – a través de la pantalla táctil digital y el control remoto del navegador. Todos los datos importantes de la sonicación (por ejemplo, la energía neta, la energía total, la amplitud, la duración, la temperatura y la presión) se almacenan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD integrada. Esto ayuda a obtener resultados reproducibles y repetibles y facilita la estandarización del proceso, así como el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación (cGMP).
Por supuesto, los procesadores de ultrasonidos de Hielscher están construidos para funcionar 24 horas al día, 7 días a la semana, a plena carga, por lo que pueden funcionar de forma fiable en entornos de producción industrial. Gracias a su gran robustez y bajo mantenimiento, el tiempo de inactividad de los equipos de ultrasonidos es realmente bajo. Las funciones CIP (limpieza in situ) y SIP (esterilización in situ) minimizan la laboriosa limpieza, especialmente porque todas las piezas húmedas son superficies metálicas lisas (sin orificios ni boquillas ocultas).

En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L 0,2 a 4 L/min UIP2000hdT
10 a 100 L 2 a 10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10 a 100 L/min UIP16000
n.a. mayor Grupo de UIP16000

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Los homogeneizadores de alto cizallamiento por ultrasonidos se utilizan en el laboratorio, en la mesa de trabajo, en los procesos piloto y en la industria.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.



Literatura / Referencias

Información interesante

Sono-Bioreactores

Los ultrasonidos se utilizan, por un lado, para perturbar las células con el fin de liberar compuestos intracelulares, pero aplicados con amplitudes más suaves y/o como ráfagas de ultrasonidos pulsantes, la sonicación puede mejorar en gran medida la productividad metabólica de las células microbianas, vegetales y animales en los biorreactores, impulsando así los procesos biotecnológicos. Las sondas ultrasónicas pueden integrarse de forma sencilla en los biorreactores (los llamados sono-biorreactores) para intensificar la eficiencia de los biocatalizadores vivos. Los ultrasonidos de Hielscher permiten controlar con precisión las condiciones de los ultrasonidos, que pueden ajustarse de forma óptima para lograr una elevada conversión catalítica de las células vivas. Más información sobre las sondas ultrasónicas de Hielscher para sonobiorreactores y los efectos de la biocatálisis mejorada por ultrasonidos.

Las fábricas celulares y la síntesis de metabolitos

Diferentes microorganismos pueden sintetizar metabolitos similares, por ejemplo, para la producción de aminoácidos se han utilizado con éxito Corynebacterium, Brevibacterium y Escherichia coli; las vitaminas se han sintetizado utilizando Propionibacterium y Pseudomonas; los ácidos orgánicos se obtienen a partir de Aspergillus, Lactobacillus, Rhizopus; mientras que las enzimas pueden ser fabricadas por Aspergillus y Bacillus; los antibióticos pueden ser producidos por Streptomyces y Penicillium; mientras que para la producción de biosurfactantes comúnmente formados se utilizan Pseudomonas, Bacillus y Lactobacillus como fábricas celulares.

E. Coli como fábricas de células microbianas

La bacteria E. coli y sus numerosas cepas son ampliamente utilizadas en biología molecular y se han convertido en uno de los primeros modelos celulares eficientes utilizados como fábricas de células microbianas para la producción de proteínas recombinantes, biocombustibles y otros productos químicos. E. coli presenta una capacidad natural para producir varios compuestos, que ha sido mejorada mediante bioingeniería y modificaciones genéticas. Por ejemplo, mediante la transferencia de enzimas heterólogas, se ha modificado la capacidad de E. coli para producir numerosos productos con el fin de desarrollar nuevas vías biosintéticas.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)

Los Streptomyces como fábricas de células microbianas

Streptomyces es el mayor grupo de actinomicetos; las especies de Streptomyces están muy extendidas en los ecosistemas acuáticos y terrestres. Los miembros del género Streptomyces son de interés comercial por su capacidad de producir un enorme número de biomoléculas y metabolitos secundarios bioactivos. Producen antibióticos clínicamente útiles como tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos, cloranfenicol y rifamicinas. Además de antibióticos, los Streptomyces también producen otros productos farmacéuticos de gran valor, como anticancerígenos, inmunoestimulantes, inmunosupresores, agentes antioxidativos, insecticidas y antiparasitarios, que tienen amplias aplicaciones médicas y agrícolas.
Las especies de Streptomyces producen una serie de enzimas de importancia médica, como la L-asparaginasa, la uricasa y la colesterol oxidasa. Muchos actinomicetos pueden producir enzimas de importancia industrial como celulasas, quitinasas, quitosanasas, α-amilasas, proteasas y lipasas. Muchos actinomicetos pueden producir diferentes pigmentos que son potencialmente una buena alternativa a los colores sintéticos. Las especies de Streptomyces tienen una gran capacidad para producir biomoléculas activas de superficie, incluyendo bioemulsionantes y biosurfactantes. La acarbosa antidiabética fue producida por cepas de Streptomyces mediante fermentación microbiana. Las especies de Streptomyces han demostrado la capacidad de sintetizar inhibidores de la síntesis del colesterol, como la pravastatina. Recientemente, las especies de Streptomyces pueden utilizarse como "nanofábricas" respetuosas con el medio ambiente para la síntesis de nanopartículas. Algunas especies de Streptomyces son prometedoras para la producción de vitamina B12.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.