Producción biosintética de oligosacáridos de la leche humana

La biosíntesis de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) mediante la fermentación o las reacciones enzimáticas es un proceso complejo, agotador y a menudo de bajo rendimiento. La ecografía aumenta la transferencia de masa entre el sustrato y las fábricas de células y estimula el crecimiento y el metabolismo celular. De este modo, la sonicación intensifica la fermentación y los procesos bioquímicos, lo que da lugar a una producción acelerada y más eficiente de HMO.

Oligosacáridos de la leche humana

Los oligosacáridos de la leche humana, también conocidos como glicanos de la leche humana, son moléculas de azúcar que forman parte del grupo de los oligosacáridos. Ejemplos destacados de HMO incluyen la 2'-fucosilactosa (2′-FL), lacto-N-neotetraosa (LNnT), 3'-galactosilactosa (3′-GL), y la difucosilactosa (DFL).
Si bien la leche materna humana está compuesta por más de 150 estructuras diferentes de HMO, sólo la 2′-fucosilactosa (2′-FL) y la lacto-N-neteotetraosa (LNnT) se producen actualmente a nivel comercial y se utilizan como aditivos nutricionales en las fórmulas para lactantes.
Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) son conocidos por su importancia en la nutrición del bebé. Los oligosacáridos de la leche humana son un tipo único de nutrientes, que actúan como prebióticos, antimicrobianos antiadherentes e inmunomoduladores en el intestino del bebé y contribuyen sustancialmente al desarrollo del cerebro. Los HMO se encuentran exclusivamente en la leche materna humana; otras leches de mamíferos (por ejemplo, de vaca, cabra, oveja, camello, etc.) no tienen esta forma específica de oligosacáridos.
Los oligosacáridos de la leche humana son el tercer componente sólido más abundante en la leche humana, que puede estar presente en forma disuelta, emulsionada o suspendida en el agua. La lactosa y los ácidos grasos son los sólidos más abundantes que se encuentran en la leche humana. Están presentes en una concentración de 0,35-0,88 onzas (9,9-24,9 g)/L. Se conocen aproximadamente 200 oligosacáridos de leche humana estructuralmente diferentes. El oligosacárido dominante en el 80% de todas las mujeres es el 2′-fucosilactosa, que está presente en la leche materna humana en una concentración de aproximadamente 2,5 g/l.
Como los HMO no se digieren, no contribuyen calóricamente a la nutrición. Al ser carbohidratos indigeribles, funcionan como prebióticos y son fermentados selectivamente por la deseable microflora intestinal, especialmente las bifidobacterias.

Biosíntesis de los oligosacáridos de la leche humana

Las fábricas de células y los sistemas enzimáticos y quimio-enzimáticos son tecnologías actuales utilizadas para la síntesis de HMO. Para la producción de HMO a escala industrial, la fermentación de fábricas de células microbianas, la síntesis bioquímica y las diferentes reacciones enzimáticas son formas viables de bioproducción de HMO. Por razones económicas, la biosíntesis mediante fábricas de células microbianas es actualmente la única técnica utilizada a nivel de producción industrial de HMO.

Fermentación de HMOs usando Fábricas de Células Microbianas

E.coli, Saccharomyces cerevisiae y Lactococcus lactis son fábricas celulares de uso común utilizadas para la bioproducción de moléculas biológicas como las HMO. La fermentación es un proceso bioquímico que utiliza microorganismos para convertir un sustrato en moléculas biológicas específicas. Las fábricas de células microbianas utilizan azúcares simples como sustrato, que convierten en HMO. Dado que los azúcares simples (por ejemplo, la lactosa) son un sustrato abundante y barato, esto hace que el proceso de biosíntesis sea rentable.
El crecimiento y la tasa de bioconversión se ven influidos principalmente por la transferencia masiva de nutrientes (sustrato) a los microorganismos. La tasa de transferencia de masa es un factor principal que afecta a la síntesis del producto durante la fermentación. Es bien sabido que la ultrasonificación promueve la transferencia de masa.
Durante la fermentación, las condiciones en el biorreactor deben vigilarse y regularse constantemente para que las células puedan crecer lo más rápidamente posible a fin de producir luego las biomoléculas seleccionadas (por ejemplo, oligosacáridos como los HMO; insulina; proteínas recombinantes). Teóricamente, la formación del producto comienza tan pronto como el cultivo celular empieza a crecer. Sin embargo, especialmente en las células modificadas genéticamente, como los microorganismos manipulados, suele inducirse más tarde añadiendo una sustancia química al sustrato, lo que aumenta la expresión de la biomolécula seleccionada. Los biorreactores ultrasónicos (sono-biorreactor) pueden ser controlados con precisión y permiten la estimulación específica de los microbios. Esto da como resultado una biosíntesis acelerada y mayores rendimientos.
Lisis y extracción ultrasónica: La fermentación de los HMO complejos podría estar limitada por los bajos títulos de fermentación y los productos que permanecen intracelulares. La lisis y extracción ultrasónica se utiliza para liberar material intracelular antes de la purificación y los procesos posteriores.

Fermentación promovida por ultrasonido

La tasa de crecimiento de microbios como Escherichia coli, E. coli, Saccharomyces cerevisiae y Lactococcus lactis puede acelerarse aumentando la tasa de transferencia de masa y la permeabilidad de la pared celular mediante la aplicación de ultrasonidos de baja frecuencia controlada. Como técnica de procesamiento suave y no térmica, la ultrasonicación aplica fuerzas puramente mecánicas en el caldo de fermentación.
Cavitación acústica: El principio de funcionamiento de la sonicación se basa en la cavitación acústica. La sonda ultrasónica (sonotrodo) acopla ondas ultrasónicas de baja frecuencia en el medio. Las ondas de ultrasonido viajan a través del líquido creando ciclos alternos de alta presión (compresión) / baja presión (rarefacción). Al comprimir y estirar el líquido en ciclos alternativos, surgen diminutas burbujas de vacío. Estas pequeñas burbujas de vacío crecen a lo largo de varios ciclos hasta que alcanzan un tamaño en el que no pueden absorber más energía. En este punto de máximo crecimiento, la burbuja de vacío implosiona violentamente y genera condiciones locales extremas, lo que se conoce como fenómeno de cavitación. En el "punto caliente" de la cavitación se observan elevados diferenciales de presión y temperatura e intensas fuerzas de cizallamiento con chorros de líquido de hasta 280 m/seg. Gracias a estos efectos de cavitación, se consigue una transferencia de masa completa y una sonoporación (la perforación de las paredes y las membranas celulares). Los nutrientes del sustrato flotan hacia las células enteras vivas y se introducen en ellas, de modo que las fábricas celulares se nutren de forma óptima y se aceleran tanto el crecimiento como las tasas de conversión. Los biorreactores ultrasónicos son una estrategia sencilla, pero muy eficaz, para procesar la biomasa en un proceso de biosíntesis de una sola vez.
Se sabe que una sonicación suave y controlada con precisión intensifica los procesos de fermentación.
La sonicación mejora "la productividad de muchos bioprocesos en los que intervienen células vivas mediante el aumento de la captación de sustrato, la mejora de la producción o el crecimiento al aumentar la porosidad de las células y la posible mejora de la liberación de los componentes de las células". (Naveena et al. 2015)
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Naveena y otros (2015) observaron que la intensificación ultrasónica ofrece varias ventajas durante el bioprocesamiento, entre ellas los bajos costos de operación en comparación con otras opciones de tratamiento de mejora, la sencillez de funcionamiento y los modestos requisitos de potencia.

Reactores de fermentación ultrasónicos de alto rendimiento

En los procesos de fermentación participan microorganismos vivos como bacterias o levaduras, que funcionan como fábricas de células. Mientras que la sonicación se aplica para promover la transferencia de masa y aumentar la tasa de crecimiento y conversión de los microorganismos, es crucial controlar la intensidad de los ultrasonidos con precisión para evitar la destrucción de las fábricas celulares.
Hielscher Ultrasonics es especialista en el diseño, la fabricación y la distribución de ultrasonidos de alto rendimiento, que pueden controlarse y supervisarse con precisión para garantizar un rendimiento de fermentación superior.

El control de los procesos no sólo es esencial para obtener altos rendimientos y una calidad superior, sino que permite repetir y reproducir los resultados. Especialmente cuando se trata de la estimulación de las fábricas celulares, la adaptación específica de los parámetros de sonicación es esencial para lograr altos rendimientos y para prevenir la degradación celular. Por lo tanto, todos los modelos digitales de ultrasonidos de Hielscher están equipados con un software inteligente que permite ajustar, controlar y revisar los parámetros de sonicación. Los parámetros de los procesos ultrasónicos como la amplitud, la temperatura, la presión, la duración de la sonicación, los ciclos de trabajo y la entrada de energía son esenciales para promover la producción de HMO a través de la fermentación.
El software inteligente de los ultrasonidos de Hielscher registra automáticamente todos los parámetros importantes del proceso en la tarjeta SD integrada. El registro automático de datos del proceso de sonicación es la base para la estandarización del proceso y la reproducibilidad / repetibilidad, que se requieren para las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF).

Rectores ultrasónicos para la fermentación

Hielscher ofrece sondas de ultrasonidos de varios tamaños, longitudes y geometrías, que pueden utilizarse tanto para tratamientos por lotes como para tratamientos de flujo continuo. Los reactores ultrasónicos, también conocidos como sono-biorreactores, están disponibles para cualquier volumen que cubra el bioprocesamiento ultrasónico desde pequeñas muestras de laboratorio hasta el nivel de producción piloto y totalmente comercial.
Es bien sabido que la ubicación del sonotrodo ultrasónico en el recipiente de reacción influye en la distribución de la cavitación y la microcorriente dentro del medio. El sonotrodo y el reactor ultrasónico deben elegirse de acuerdo con el volumen de procesamiento del caldo celular. Si bien la sonicación puede realizarse tanto por lotes como en modo continuo, para volúmenes de producción elevados se recomienda el uso de una instalación de flujo continuo. Al pasar por una célula de flujo ultrasónico, todo el medio celular recibe exactamente la misma exposición a la sonicación, lo que garantiza el tratamiento más eficaz. La amplia gama de sondas ultrasónicas y reactores de células de flujo de Hielscher Ultrasonics permite montar la instalación ideal de bioprocesamiento ultrasónico.

Hielscher Ultrasonics – Del laboratorio al piloto y a la producción

Hielscher Ultrasonics cubre todo el espectro de equipos de ultrasonidos ofreciendo compactos homogeneizadores de ultrasonidos de mano para la preparación de muestras a sistemas de mesa y piloto, así como potentes unidades industriales de ultrasonidos que procesan fácilmente cargas de camiones por hora. Al ser versátiles y flexibles en cuanto a las opciones de instalación y montaje, los ultrasonidos Hielscher pueden integrarse fácilmente en todo tipo de reactores de lote, de alimentación por lotes o de flujo continuo.
Diversos accesorios, así como piezas personalizadas, permiten la adaptación ideal de su configuración ultrasónica a los requisitos de su proceso.
Construidos para funcionar 24 horas al día, 7 días a la semana, a plena carga y en condiciones exigentes, los procesadores ultrasónicos de Hielscher son fiables y requieren poco mantenimiento.
En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores: