Producción biosintética de oligosacáridos de la leche humana

La biosíntesis de oligosacáridos de la leche humana (HMO) mediante fermentación o reacciones enzimáticas es un proceso complejo, laborioso y a menudo poco productivo. La ultrasonicación aumenta la transferencia de masa entre el sustrato y las fábricas celulares y estimula el crecimiento y el metabolismo de las células. De este modo, la sonicación intensifica la fermentación y los procesos bioquímicos, lo que se traduce en una producción acelerada y más eficaz de HMO.

oligosacáridos de la leche humana

Los oligosacáridos de la leche humana (HMO), también conocidos como glicanos de la leche humana, son moléculas de azúcar que forman parte del grupo de los oligosacáridos. Algunos ejemplos destacados de HMO son la 2'-fucosilactosa (2′-FL), lacto-N-neotetraosa (LNnT), 3'-galactosilactosa (3′-GL), y difucosilactosa (DFL).
Aunque la leche materna humana está compuesta por más de 150 estructuras HMO diferentes, sólo la 2′-fucosilactosa (2′-FL) y la lacto-N-neotetraosa (LNnT) se producen actualmente a nivel comercial y se utilizan como aditivos nutricionales en los preparados para lactantes.
Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) son conocidos por su importancia en la nutrición infantil. Los oligosacáridos de la leche humana son un tipo único de nutrientes que actúan como prebióticos, antimicrobianos antiadhesivos e inmunomoduladores en el intestino del lactante y contribuyen sustancialmente al desarrollo del cerebro. Los HMO se encuentran exclusivamente en la leche materna humana; otras leches de mamíferos (por ejemplo, vaca, cabra, oveja, camello, etc.) no tienen esta forma específica de oligosacáridos.
Los oligosacáridos de la leche humana son el tercer componente sólido más abundante de la leche humana, que puede estar presente tanto en forma disuelta como emulsionada o suspendida en agua. La lactosa y los ácidos grasos son los sólidos más abundantes de la leche humana. Los HMO están presentes en una concentración de 0,35-0,88 onzas (9,9-24,9 g)/ L. Se conocen aproximadamente 200 oligosacáridos de leche humana estructuralmente diferentes. El oligosacárido dominante en el 80% de las mujeres es el 2′-fucosilactosa, que está presente en la leche materna humana en una concentración aproximada de 2,5 g/ L.
Como los HMO no se digieren, no contribuyen calóricamente a la nutrición. Al ser hidratos de carbono no digeribles, funcionan como prebióticos y son fermentados selectivamente por la microflora intestinal deseable, especialmente las bifidobacterias.

Beneficios para la salud de los oligosacáridos de la leche humana (HMO)

  • fomentar el desarrollo de los lactantes
  • son importantes para el desarrollo del cerebro
  • tiene propiedades antiinflamatorias y
  • efectos antiadherentes en el tracto gastrointestinal
  • refuerza el sistema inmunitario en adultos
La ultrasonicación y el uso de biorreactores ultrasónicos (sono-biorreactores) son muy eficaces para promover la transferencia de masa entre el sustrato y las células vivas utilizadas como fábricas celulares.

El procesador ultrasónico UIP2000hdT aumenta la transferencia de masa y activa las fábricas celulares para obtener mayores rendimientos de moléculas biológicas biosintetizadas, como los HMO

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Biosíntesis de los oligosacáridos de la leche humana

Las fábricas celulares y los sistemas enzimáticos/quimioenzimáticos son tecnologías que se utilizan actualmente para la síntesis de HMO. Para la producción de HMO a escala industrial, la fermentación de fábricas celulares microbianas, la síntesis bioquímica y diferentes reacciones enzimáticas son vías viables de bioproducción de HMO. Debido a razones económicas, la biosíntesis mediante fábricas de células microbianas es actualmente la única técnica utilizada a nivel de producción industrial de HMO.

Fermentación de HMO mediante fábricas celulares microbianas

E. coli, Saccharomyces cerevisiae y Lactococcus lactis son fábricas celulares utilizadas habitualmente para la bioproducción de moléculas biológicas como los HMO. La fermentación es un proceso bioquímico que utiliza microorganismos para convertir un sustrato en moléculas biológicas específicas. Las fábricas celulares microbianas utilizan azúcares simples como sustrato, que convierten en HMOs. Dado que los azúcares simples (por ejemplo, la lactosa) son un sustrato abundante y barato, el proceso de biosíntesis resulta rentable.
El crecimiento y la tasa de bioconversión se ven influidos principalmente por la transferencia de masa de nutrientes (sustrato) a los microorganismos. La tasa de transferencia de masa es un factor principal que afecta a la síntesis de productos durante la fermentación. Es bien sabido que la ultrasonicación favorece la transferencia de masa.
Durante la fermentación, las condiciones del biorreactor deben controlarse y regularse constantemente para que las células puedan crecer lo más rápidamente posible y producir así las biomoléculas deseadas (por ejemplo, oligosacáridos como los HMO, insulina o proteínas recombinantes). En teoría, la formación del producto comienza en cuanto el cultivo celular empieza a crecer. Sin embargo, especialmente en las células modificadas genéticamente, como los microorganismos manipulados, suele inducirse posteriormente añadiendo una sustancia química al sustrato, que regula la expresión de la biomolécula objetivo. Los biorreactores ultrasónicos (sono-biorreactores) pueden controlarse con precisión y permiten la estimulación específica de los microbios. El resultado es una biosíntesis acelerada y mayores rendimientos.
Lisis y extracción por ultrasonidos: La fermentación de HMO complejos puede verse limitada por los bajos títulos de fermentación y los productos que permanecen intracelulares. La lisis ultrasónica y la extracción se utilizan para liberar el material intracelular antes de la purificación y los procesos posteriores.

Fermentación ultrasónica

La tasa de crecimiento de microbios como Escherichia coli, E. coli modificada, Saccharomyces cerevisiae y Lactococcus lactis puede acelerarse aumentando la tasa de transferencia de masa y la permeabilidad de la pared celular mediante la aplicación controlada de ultrasonidos de baja frecuencia. Como técnica de procesamiento suave y no térmica, la ultrasonicación aplica fuerzas puramente mecánicas en el caldo de fermentación.
Cavitación acústica: El principio de funcionamiento de la sonicación se basa en la cavitación acústica. La sonda ultrasónica (sonotrodo) acopla ondas ultrasónicas de baja frecuencia en el medio. Las ondas ultrasónicas viajan a través del líquido creando ciclos alternos de alta presión (compresión) / baja presión (rarefacción). Al comprimir y estirar el líquido en ciclos alternos, surgen diminutas burbujas de vacío. Estas pequeñas burbujas de vacío crecen a lo largo de varios ciclos hasta que alcanzan un tamaño tal que ya no pueden absorber más energía. En este punto de máximo crecimiento, la burbuja de vacío implosiona violentamente y genera localmente condiciones extremas, lo que se conoce como fenómeno de cavitación. En el "punto caliente" cavitacional se observan elevados diferenciales de presión y temperatura e intensas fuerzas de cizallamiento con chorros de líquido de hasta 280 m/seg. Gracias a estos efectos cavitacionales, se consigue una transferencia de masa y una sonoporación (perforación de las paredes y membranas celulares) completas. Los nutrientes del sustrato flotan hacia las células enteras vivas y penetran en ellas, de modo que las fábricas celulares se nutren de forma óptima y se aceleran tanto el crecimiento como los índices de conversión. Los biorreactores ultrasónicos son una estrategia sencilla pero muy eficaz para procesar la biomasa en un proceso de biosíntesis de una sola vez.
Una sonicación suave y controlada con precisión es bien conocida por intensificar los procesos de fermentación.
La sonicación mejora "la productividad de muchos bioprocesos que implican células vivas a través de la mejora de la absorción de sustratos, la mejora de la producción o el crecimiento mediante el aumento de la porosidad celular, y la liberación potencialmente mejorada de componentes celulares". (Naveena et al. 2015)
Más información sobre la fermentación asistida por ultrasonidos.

Ventajas de la fermentación intensificada por ultrasonidos

  • Mayor rendimiento
  • Fermentación acelerada
  • Estimulación celular específica
  • Mayor captación de sustratos
  • Aumento de la porosidad celular
  • Fácil de manejar
  • Seguro
  • Retroinstalación sencilla
  • aumento lineal a gran escala de producción industrial
  • Procesamiento por lotes o en línea
  • RoI rápido

Naveena et al. (2015) descubrieron que la intensificación ultrasónica ofrece varias ventajas durante el bioprocesamiento, incluidos los bajos costes operativos en comparación con otras opciones de tratamiento de mejora, la simplicidad de funcionamiento y los modestos requisitos de energía.

Homogeneizador ultrasónico industrial para la biosíntesis intensificada de oligosacáridos de leche humana (HMO).

El MultiSonoReactor MSR-4 es un homogeneizador industrial en línea adecuado para la biosíntesis mejorada de oligosacáridos de leche humana (HMO).


Reactores de fermentación ultrasónicos de alto rendimiento

En los procesos de fermentación intervienen microorganismos vivos, como bacterias o levaduras, que funcionan como fábricas celulares. Aunque la sonicación se aplica para promover la transferencia de masa y aumentar la tasa de crecimiento y conversión de los microorganismos, es crucial controlar con precisión la intensidad de los ultrasonidos para evitar la destrucción de las fábricas celulares.
Hielscher Ultrasonics es especialista en el diseño, la fabricación y la distribución de ultrasonidos de alto rendimiento, que pueden controlarse y supervisarse con precisión para garantizar rendimientos de fermentación superiores.

Control preciso de los parámetros del proceso ultrasónico por Hielscher Ultrasonics' software inteligenteEl control del proceso no sólo es esencial para obtener altos rendimientos y una calidad superior, sino que permite repetir y reproducir los resultados. Especialmente cuando se trata de la estimulación de fábricas celulares, la adaptación específica de los parámetros de sonicación a cada célula es esencial para lograr altos rendimientos y evitar la degradación celular. Por ello, todos los modelos digitales de ultrasonicadores Hielscher están equipados con un software inteligente que permite ajustar, supervisar y revisar los parámetros de sonicación. Los parámetros del proceso ultrasónico, como la amplitud, la temperatura, la presión, la duración de la sonicación, los ciclos de trabajo y la entrada de energía, son esenciales para promover la producción de HMO mediante fermentación.
El software inteligente de los ultrasonicadores Hielscher registra automáticamente todos los parámetros importantes del proceso en la tarjeta SD integrada. El registro automático de datos del proceso de sonicación es la base para la estandarización del proceso y la reproducibilidad/repetibilidad, que se requieren para las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Rectores ultrasónicos para fermentación

Hielscher Ultrasonidos CascatrodeHielscher ofrece sondas ultrasónicas de distintos tamaños, longitudes y geometrías, que pueden utilizarse tanto para tratamientos por lotes como de flujo continuo. Los reactores ultrasónicos, también conocidos como sono-biorreactores, están disponibles para cualquier volumen que abarque el bioprocesamiento ultrasónico desde pequeñas muestras de laboratorio hasta el nivel de producción piloto y totalmente comercial.
Es bien sabido que la ubicación del sonotrodo ultrasónico en el recipiente de reacción influye en la distribución de la cavitación y el microflujo dentro del medio. El sonotrodo y el reactor ultrasónico deben elegirse en función del volumen de procesamiento del caldo celular. Aunque la sonicación puede realizarse tanto en modo discontinuo como continuo, para volúmenes de producción elevados se recomienda el uso de una instalación de flujo continuo. Al pasar a través de una célula de flujo ultrasónico, todo el medio celular recibe exactamente la misma exposición a la sonicación, lo que garantiza el tratamiento más eficaz. La amplia gama de sondas ultrasónicas y reactores de celda de flujo de Hielscher Ultrasonics permite montar la configuración ideal de bioprocesamiento ultrasónico.

SonoStation de Hielscher para la ultrasonicación de lotes de tamaño medio utilizando uno o dos reactores de celdas de flujo. La compacta SonoStation combina un tanque agitado de 38 litros con una bomba de cavidad progresiva ajustable que puede alimentar hasta 3 litros por minuto a uno o dos reactores de celdas de flujo ultrasónicas.

Estación de mezcla por ultrasonidos - SonoStation con 2 homogeneizadores de 2000 vatios

Vídeo en miniatura

Hielscher Ultrasonics – Del laboratorio al piloto y a la producción

Hielscher Ultrasonics cubre todo el espectro de equipos de ultrasonidos, desde homogeneizadores ultrasónicos manuales compactos para la preparación de muestras hasta sistemas piloto y de sobremesa, pasando por potentes unidades industriales de ultrasonidos que procesan fácilmente camiones cargados por hora. Al ser versátiles y flexibles en cuanto a opciones de instalación y montaje, los ultrasonidos de Hielscher pueden integrarse fácilmente en todo tipo de reactores discontinuos, alimentados por lotes o de flujo continuo.
Diversos accesorios, así como piezas personalizadas, permiten la adaptación ideal de su configuración de ultrasonidos a los requisitos de su proceso.
Construidos para funcionar 24 horas al día, 7 días a la semana, a plena carga y en condiciones exigentes, los procesadores ultrasónicos de Hielscher son fiables y requieren poco mantenimiento.
En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:

Volumen del loteTasa de flujoDispositivos recomendados
1 a 500 mL10 a 200 mL/min.UP100H
10 a 2000 mL20 a 400 mL/min.UP200Ht, UP400St
0,1 a 20 L0,2 a 4 L/minUIP2000hdT
10 a 100 L2 a 10 L/minUIP4000hdT
n.a.10 a 100 L/minUIP16000
n.a.mayorGrupo de UIP16000

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Homogeneizadores ultrasónicos de alta potencia de laboratorio a piloto y Uso industrial escala.



Literatura / Referencias

Información interesante

Biosíntesis mediante fábricas celulares

Una fábrica de células microbianas es un método de bioingeniería que utiliza células microbianas como instalaciones de producción. Mediante la ingeniería genética de microbios, se modifica el ADN de microorganismos como bacterias, levaduras, hongos, células de mamíferos o algas, convirtiendo los microbios en fábricas celulares. Las fábricas celulares se utilizan para convertir sustratos en valiosas moléculas biológicas que se emplean, por ejemplo, en alimentación, farmacia, química y producción de combustibles. Las diferentes estrategias de biosíntesis basadas en fábricas celulares tienen como objetivo la producción de metabolitos nativos, la expresión de vías biosintéticas heterólogas o la expresión de proteínas.
Las fábricas celulares pueden utilizarse para sintetizar metabolitos nativos, expresar vías biosintéticas heterólogas o expresar proteínas.

Biosíntesis de metabolitos nativos

Los metabolitos nativos se definen como moléculas biológicas que las células utilizadas como fábrica celular producen de forma natural. Las fábricas celulares producen estas moléculas biológicas bien intracelularmente, bien como sustancia secretada. Se prefiere esta última, ya que facilita la separación y purificación de los compuestos objetivo. Ejemplos de metabolitos nativos son aminoácidos y ácidos nucleicos, antibióticos, vitaminas, enzimas, compuestos bioactivos y proteínas producidas a partir de vías anabólicas de la célula.

Vías biosintéticas del heterólogo

Cuando se intenta producir un compuesto interesante, una de las decisiones más importantes es la elección de la producción en el hospedador nativo, y optimizar este hospedador, o la transferencia de la vía a otro hospedador conocido. Si el huésped original puede adaptarse a un proceso de fermentación industrial, y no existen riesgos para la salud al hacerlo (por ejemplo, la producción de subproductos tóxicos), ésta puede ser una estrategia preferida (como fue el caso, por ejemplo, de la penicilina). Sin embargo, en muchos casos modernos, el potencial de utilizar una fábrica de células preferida industrialmente y los procesos de plataforma relacionados supera la dificultad de transferir la vía.

Expresión de proteínas

La expresión de proteínas puede lograrse por vías homólogas y heterólogas. En la expresión homóloga, se sobreexpresa un gen que está presente de forma natural en un organismo. Mediante esta sobreexpresión, se puede producir un mayor rendimiento de una determinada molécula biológica. En la expresión heteróloga, se transfiere un gen específico a una célula huésped en la que el gen no está presente de forma natural. Mediante la ingeniería celular y la tecnología del ADN recombinante, el gen se inserta en el ADN del huésped para que éste produzca (grandes) cantidades de una proteína que no produciría de forma natural. La expresión de proteínas se realiza en una gran variedad de huéspedes, desde bacterias, como E. coli y Bacillis subtilis, levaduras, como Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, hongos filamentosos, como A. niger, y células derivadas de organismos multicelulares, como mamíferos e insectos. Las proteínas innumerables tienen un gran interés comercial, desde las enzimas a granel hasta los biofármacos complejos, los diagnósticos y los reactivos de investigación. (cf. A.M. Davy et al. 2017)

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