Lisis ultrasónica de muestras de Drosophila melanogaster

La Drosophila melanogaster se utiliza ampliamente en los laboratorios como organismo modelo. Por lo tanto, es necesario realizar con frecuencia los pasos de preparación preanalítica, como lisis, disrupción celular, extracción de proteínas y escisión del ADN de las muestras de Drosophila melanogaster. Los desmembradores ultrasónicos son fiables y eficientes y pueden utilizarse para realizar fácilmente diversas tareas como la lisis, la extracción de proteínas o la fragmentación del ADN, ajustando únicamente los parámetros del proceso ultrasónico. Los homogeneizadores ultrasónicos son, por lo tanto, herramientas flexibles con una amplia gama de aplicaciones.

Lisis ultrasónica y extracción de proteínas

Drosophila melanogaster is widely used as model organism in biological labs. Find here protocols for lysis, protein extracion and DNA shearing of D. melanogaster samples.La lisis, la solubilización de células, la homogeneización de tejidos y la extracción de proteínas son tareas típicas de los desmembradores ultrasónicos en los laboratorios biológicos. Los desmembradores ultrasónicos y los disruptores celulares son muy adecuados para homogeneizar tejidos animales, insectos (por ejemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) o especímenes vegetales. Las aplicaciones subsiguientes de la ecografía son la lisis de suspensiones y gránulos celulares, así como la extracción de proteínas intracelulares.
La lisis ultrasónica y la extracción de proteínas son procesos altamente fiables y reproducibles, que pueden realizarse sobre la base de protocolos establecidos. Dado que la intensidad del proceso ultrasónico puede ajustarse exactamente mediante parámetros de sonicación como la amplitud, el modo de ciclo/pulso, la temperatura y el volumen de la muestra, una vez comprobados los protocolos pueden repetirse una y otra vez con el mismo resultado.

Ventajas de la preparación de muestras ultrasónicas

  • altamente eficiente
  • Ajustable a un material de muestra específico
  • Adecuado para cualquier volumen
  • Tratamiento no térmico
  • resultados reproducibles
  • Simple y seguro

Fragmentación ultrasónica de ADN y ARN

Después de la lisis celular y la extracción de proteínas, un paso comúnmente requerido en la preparación de la muestra es el corte y la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina, por ejemplo, antes de la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). La fragmentación del ADN y el ARN se puede lograr de manera fiable rompiendo los enlaces covalentes que mantienen unido el ADN mediante fuerzas físicas. Utilizando la cizalla física como la sonicación, al principio se rompen las cadenas de ADN, luego el ADN se fragmenta en trozos más pequeños.
La fragmentación ultrasónica del ADN es fiable y eficiente para cortar el ADN hasta una longitud determinada, por ejemplo, 500 pb (pares de bases). Las principales ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN son el control preciso de los parámetros y la intensidad del proceso ultrasónico. Los parámetros del proceso ultrasónico pueden ajustarse ajustando con precisión la intensidad, los ciclos y el tiempo de sonicación. Esto permite crear los tamaños de ADN deseados y la longitud de ADN deseada puede producirse y reproducirse de manera fiable. El cizallamiento ultrasónico del ADN también es ideal para crear fragmentos de ADN de alto peso molecular.

Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of Drosophila samples

Ultrasonicador UP200Ht con 2mm microtip S26d2 para la sonicación de muestras de Drosophila

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Protocolos para la lisis ultrasónica de Drosophila melanogaster

A continuación encontrará varios protocolos para la lisis asistida por ultrasonidos, la extracción de proteínas y la fragmentación de ADN o cromatina de las muestras de Drosophila.

Análisis ultrasónico para el ensayo de inmunoprecipitación de enlace cruzado (CLIP)

El ensayo CLIP se realizó como se informó anteriormente con algunas modificaciones. Aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras de 0 a 1 día de edad de tipo silvestre fueron reticulados por UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogeneizados en hielo en 1 mL de tampón RCB (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Tritón X-100, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT, 1× Inhibidores de Proteasa Completa sin EDTA, 1 mM PMSF) complementados con 300 U RNAseOUT y colocados en hielo durante 30 min. El homogeneizado fue sonicado en hielo, al 80% de potencia, cinco veces en ráfagas de 20 s con un descanso de 60 s entre ellas usando el procesador ultrasónico de Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) y centrifugado (16000 × g durante 5 min a 4°C). El extracto soluble se preclaró con 20 dínadas de proteína-G durante 20 min a 4°C. Tras retirar las muestras para la inmunotransferencia y la cuantificación de la entrada de ARN (1%), se inmunoprecipitó la HP1 con el anticuerpo anti-HP1 9A9 del extracto precleared 450 μl por incubación durante 4 h con 50 μl dinabeads de proteína-G. Los inmunoprecipitados fueron lavados 4 veces con RCB. Para eluir los ARN inmunoprecipitados, las cuentas peletizadas se hirvieron en 100 μL de agua tratada con UltraPure DEPC durante 5 min. 900 μL Se añadió el reactivo Qiazol al sobrenadante recuperado para la preparación del ARN. El ARN purificado se utilizó como plantilla para sintetizar el ADNc utilizando oligo dT, hexámeros aleatorios y la transcriptasa inversa SuperScript III, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Ensayo de lisis ultrasónica para la inmunoprecipitación de cromatina

La inmunoprecipitación de la cromatina se realizó según el método descrito por Menet con pequeñas modificaciones. Se homogeneizaron aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras salvajes de 0 a 1 día de edad en 1 mL de tampón NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8,0.5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Espermidina, 0,15 mM Espermina, 1× inhibidores de la proteasa completa sin EDTA) con un homogeneizador / dispersor de inmersión 1 min (a 3000 rpm). El homogeneizador fue transferido a una dounce de vidrio pre-refrigerado y se aplicaron 15 golpes completos con un mortero apretado. Los núcleos libres se centrifugaron después a 6000xg durante 10 min a 4°C. Los núcleos que contenían gránulos se resuspendieron en 1 mL de NEB y se centrifugaron a 20000 × g durante 20 min en gradiente de sacarosa (0,65 mL de 1,6 M de sacarosa en NEB, 0,35 mL de 0,8 M de sacarosa en NEB). El pellet se resuspendió en 1 mL de NEB y formaldehído hasta una concentración final del 1%. Los núcleos se reticularon durante 10 min a temperatura ambiente y se apagaron añadiendo 1/10 vol de glicina de 1.375 M. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 6000 × g durante 5 min. Los núcleos se lavaron dos veces en 1 mL de NEB y se resuspendieron en 1 mL de tampón de lisis (15 mM de HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM de NaCl, 0,5 mM de EGTA, 1 mM de EDTA a pH 8, 1% de Tritón X-100, 0,5 mM de DTT, 0,1% de desoxicolato de Na, 0,1% de SDS, 0,5% de N-lauroilsarcosina y 1× inhibidores de la proteasa completa sin EDTA). Los núcleos fueron sonicados usando un procesador ultrasónico de Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis veces durante 20 s y 1 min en hielo. Los núcleos sonicados fueron centrifugados a 13000 × g durante 4 min a 4°C. La mayoría de la cromatina sonicada tenía de 500 a 1000 pares de bases (bp) de longitud. Por cada inmunoprecipitación, se incubaron 15 μg de cromatina en presencia de 10 μg de anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4°C en una rueda giratoria). Luego, se añadieron 50 μl de proteína G de las dínades y se continuó la incubación durante la noche a 4°C. Los sobrenadantes se desecharon y las muestras se lavaron dos veces en tampón Lysis (cada lavado 15 min a 4°C) y dos veces en tampón TE (1 mM de EDTA, 10 mM de TrisHCl a pH 8). La cromatina se eluyó de las perlas en dos pasos; primero en 100 μl de Tampón de Elección 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65°C durante 15 min, seguido de centrifugación y recuperación del sobrenadante. El material de las perlas fue reextraído en 100 μl de TE + 0,67% SDS. El eluato combinado (200 μl) se incubó durante la noche a 65°C para invertir los enlaces cruzados y se trató con 50 μg/ml de RNaseA durante 15 min a 65°C y con 500 μg/ml de Proteinasa K durante 3 h a 65°C. Se extrajeron muestras de fenol-cloroformo y se precipitó el etanol. El ADN se resuspendió en 25 μl de agua. Para maximizar los análisis moleculares con ADN inmunoprecipitado, los genes candidatos se amplificaron en pares mediante un protocolo optimizado de PCR dúplex utilizando dos conjuntos diferentes de cebadores con temperaturas de fusión similares en una sola reacción.
(Casale et al. 2019)

UP200St TD_CupHorn para la sonicación indirecta de muestras

UP200St TD_CupHorn para la sonicación indirecta de muestras como el ADN y el corte de cromatina

Disruptores celulares ultrasónicos de alto rendimiento para muestras biológicas

Hielscher Ultrasonics es su socio de larga experiencia cuando se trata de ultrasonidos de alto rendimiento para la disrupción celular, lisis, extracción de proteínas, fragmentación de ADN, ARN y cromatina, así como otros pasos de preparación de muestras pre-analíticas. Al ofrecer una amplia gama de homogeneizadores de laboratorio y unidades de preparación de muestras por ultrasonidos, Hielscher tiene el dispositivo ultrasónico ideal para su aplicación y requisitos biológicos.
Sonda de tipo insonifier UP200St para la lisisEl clásico ultrasonido de tipo sonda con micro-punta como el UP200St (200W; ver foto a la izquierda) o una de las unidades de preparación de muestras ultrasónicas VialTweeter o UP200ST_TD_CupHorn con VialHolder son los modelos favoritos en los laboratorios de investigación y análisis. La clásica sonda ultrasónica es ideal, cuando se preparan menos muestras deben ser lisadas, extraídas o fragmentadas. Las unidades de preparación de muestras VialTweeter y UP200St_TD_CupHorn permiten la sonicación simultánea de hasta 10 o 5 viales, respectivamente.
Si hay que procesar un gran número de muestras (por ejemplo, placas de 96 pozos, placas de microtitulación, etc.), el UIP400MTP es la configuración de sonicación ideal. El UIP400MTP funciona como un cuphorn más grande, que está lleno de agua y tiene suficiente espacio para sostener placas de micropozos. Alimentado por un potente procesador ultrasónico de 400 vatios, el UIP400MTP proporciona una sonicación muy uniforme e intensa de placas de múltiples pozos con el fin de interrumpir las células, lisar las muestras, solubilizar los gránulos, extraer proteínas o cizallar el ADN.

Control preciso a través de un software inteligente

Los procesadores industriales de la serie hdT de Hielscher se pueden manejar de forma remota desde el navegador de forma fácil y cómoda.Todas las soluciones de sonicación de Hielscher a partir de 200 vatios están equipadas con una pantalla táctil digital en color y un software inteligente. A través del protocolo de datos inteligente, todos los parámetros del proceso ultrasónico se guardan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD incorporada, tan pronto como el ultrasonador se pone en marcha. Esto hace que la investigación y el protocolo sean mucho más convenientes. Después de los ensayos de sonicación o de la preparación de la muestra, se pueden revisar simplemente los parámetros de sonicación de cada ejecución de sonicación y compararlos.
A través del menú intuitivo, se pueden preestablecer numerosos parámetros antes de la sonicación: Por ejemplo, para controlar la temperatura de la muestra y evitar su degradación térmica, se puede establecer un límite superior de la temperatura de la muestra. Un sensor de temperatura enchufable, que viene con la unidad de ultrasonidos, da al procesador de ultrasonidos información sobre la temperatura real de sonicación. Cuando se alcanza el límite superior de temperatura, el dispositivo ultrasónico hace una pausa hasta que se alcanza el límite inferior del conjunto ∆T y comienza entonces a sonicar de nuevo automáticamente.
Si se requiere una sonicación con una entrada de energía específica, puede preestablecer la energía ultrasónica final de la ejecución de la sonicación. Por supuesto, la pulsación ultrasónica y el modo de ciclo también pueden ser ajustados individualmente.
Para reutilizar los parámetros de sonicación más exitosos, puede guardar varios modos de sonicación (por ejemplo, tiempo de sonicación, intensidad, modo de ciclo, etc.) como modos preestablecidos, para que puedan ser iniciados de nuevo fácil y rápidamente.
Para mayor comodidad de funcionamiento, todas las unidades ultrasónicas digitales pueden ser operadas por control remoto en cualquier navegador común (por ejemplo, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La conexión LAN es una simple configuración plug-n-play y no requiere la instalación de ningún software adicional.
En Hielscher sabemos que la sonicación exitosa de muestras biológicas requiere precisión y repetibilidad. Por lo tanto, diseñamos nuestros ultrasonidos como dispositivos inteligentes con todas las características que permiten una preparación de muestras eficiente, fiable, reproducible y conveniente.

Contáctenos ahora y cuéntenos acerca de sus muestras biológicas y los pasos de preparación necesarios. Le propondremos el dispositivo de preparación de muestras ultrasónicas más adecuado y le ayudaremos con información adicional como protocolos y recomendaciones.

En la tabla que figura a continuación se indica la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas de ultrasonidos, desde las micropuntas de ultrasonidos y los homogeneizadores de ultrasonidos clásicos hasta los ultrasonidos MultiSample para la preparación cómoda y fiable de numerosas muestras:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
Placas de 96 pozos/microtítulo n.a. UIP400MTP
10 frascos de 0,5 a 1,5 ml. n.a. VialTweeter en UP200St
CupHorn para la sonicación indirecta, por ejemplo, hasta 5 viales n.a. UP200ST_TD_CupHorn
0De 0,01 a 250 ml. 5 a 100mL/min UP50H
0De 0,01 a 500 ml. 10 a 200 mL/min. UP100H
00,02 a 1L 20 a 400 mL/min. UP200Ht / UP200St
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St
0.25 a 5L 0.05 a 1L/min UIP500hdT

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The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

La unidad de preparación de muestras múltiples ultrasónicas VialTweeter permite la sonicación simultánea de hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción VialPress, se pueden presionar hasta 4 tubos adicionales en la parte delantera para una sonicación intensa.

Literatura / Referencias



Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

¡Ultrasonidos de alto rendimiento! La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonido completamente industriales.


Información interesante

Metabolómica

La metabolómica es el estudio de las pequeñas moléculas, conocidas como metabolitos, presentes en el interior de las células, biofluidos, tejidos u organismos. Estas pequeñas moléculas y sus interacciones dentro de un sistema biológico se resumen bajo el término global de "metaboloma" y el campo de investigación se denomina metabolómica. La investigación sobre el metaboloma está estrechamente relacionada con el campo rápidamente emergente de la medicina de precisión. La comprensión del metaboloma y su relación con diversas enfermedades ayuda a desarrollar estrategias de prevención de enfermedades y de atención clínica, así como la variabilidad individual en el entorno, el estilo de vida, la genética y el fenotipo molecular. Con el fin de liberar las moléculas del metabolismo de las células, la ultrasonicación se utiliza con frecuencia en los laboratorios biológicos para la preparación de muestras preanalíticas como la disrupción celular, la lisis y la extracción de proteínas, lípidos y otras moléculas.