Lisis ultrasónica de muestras de Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster se utiliza ampliamente en los laboratorios como organismo modelo. Por ello, es frecuente realizar etapas de preparación preanalítica como la lisis, la ruptura celular, la extracción de proteínas y el cizallamiento del ADN de muestras de Drosophila melanogaster. Los disgregadores ultrasónicos son fiables y eficientes y permiten realizar fácilmente diversas tareas, como la lisis, la extracción de proteínas o la fragmentación del ADN, con solo ajustar los parámetros del proceso ultrasónico. Así, los homogeneizadores ultrasónicos son herramientas flexibles con una amplia gama de aplicaciones.

Lisis ultrasónica y extracción de proteínas

La lisis, la solubilización celular, la homogeneización de tejidos y la extracción de proteínas son tareas habituales de los disgregadores ultrasónicos en los laboratorios de biología. Los disgregadores ultrasónicos y los equipos de ruptura celular son muy adecuados para homogeneizar tejidos animales, insectos (p. ej., Drosophila melanogaster, C. elegans) o especímenes vegetales. Otras aplicaciones de la ultrasonicación son la lisis de suspensiones y sedimentos celulares, así como la extracción de proteínas intracelulares.
La lisis ultrasónica y la extracción de proteínas son procesos muy fiables y reproducibles que pueden realizarse siguiendo protocolos establecidos. Como la intensidad del proceso ultrasónico puede ajustarse con precisión mediante parámetros de sonicación como la amplitud, el modo de ciclos / pulsos, la temperatura y el volumen de la muestra, los protocolos, una vez validados, pueden repetirse una y otra vez con el mismo resultado.

Fragmentación ultrasónica del ADN y el ARN

Tras la lisis celular y la extracción de proteínas, una etapa habitualmente necesaria en la preparación de muestras es el cizallamiento y la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina, por ejemplo, antes de la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). La fragmentación del ADN y el ARN puede lograrse de forma fiable mediante fuerzas físicas que rompen los enlaces covalentes que mantienen unido el ADN. Al aplicar cizallamiento físico, como la sonicación, primero se rompen las hebras de ADN y después el ADN se fragmenta en piezas más pequeñas.
La fragmentación ultrasónica del ADN permite cizallar el ADN de forma fiable y eficiente hasta una longitud objetivo, por ejemplo, 500bp (pares de bases). Entre las principales ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN se encuentra el control preciso de los parámetros y la intensidad del proceso ultrasónico. Los parámetros del proceso ultrasónico pueden ajustarse regulando con precisión la intensidad, los ciclos y el tiempo de sonicación. Esto permite obtener los tamaños de ADN deseados y producir y reproducir de forma fiable la longitud de ADN objetivo. El cizallamiento ultrasónico del ADN también es ideal para obtener fragmentos de ADN de alto peso molecular.

Protocolos para la lisis ultrasónica de Drosophila melanogaster

A continuación encontrará diversos protocolos para la lisis asistida por ultrasonidos, la extracción de proteínas y la fragmentación del ADN o la cromatina de muestras de Drosophila.

Lisis ultrasónica para el ensayo de inmunoprecipitación con entrecruzamiento (CLIP)

El ensayo CLIP se realizó según lo descrito anteriormente, con algunas modificaciones. Se sometieron aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras de tipo silvestre de 0 a 1 días de edad a entrecruzamiento mediante UV (3 × 2000 μJ/cm2), se homogeneizaron sobre hielo en 1 mL de tampón RCB (50 mM HEPES a pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT, 1× inhibidores de proteasas Complete sin EDTA, 1 mM PMSF) suplementado con 300 U de RNAseOUT y se mantuvieron sobre hielo durante 30 min. El homogeneizado se sonicó sobre hielo, al 80% de potencia, cinco veces en pulsos de 20 s con un intervalo de reposo de 60 s entre ellos, utilizando el procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) y se centrifugó (16.000 × g durante 5 min a 4 °C). El extracto soluble se preaclaró con 20 μl de Protein-G dynabeads durante 20 min a 4 °C. Tras retirar muestras para inmunotransferencia y para cuantificar el ARN de entrada (1%), se inmunoprecipitó HP1 con el anticuerpo anti-HP1 9A9 a partir de 450 μl de extracto preaclarado mediante incubación durante 4 h con 50 μl de Protein-G dynabeads. Los inmunoprecipitados se lavaron 4 veces con RCB. Para eluir los ARN inmunoprecipitados, las perlas sedimentadas se hirvieron en 100 μL de agua UltraPure tratada con DEPC durante 5 min. Se añadieron 900 μL de reactivo Qiazol al sobrenadante recuperado para la preparación del ARN. El ARN purificado se utilizó como molde para sintetizar ADNc utilizando oligo dT, hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa SuperScript III según el protocolo del fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lisis ultrasónica para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

La inmunoprecipitación de cromatina se realizó según el método descrito por Menet, con pequeñas modificaciones. Se homogeneizaron aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras de tipo silvestre de 0 a 1 días de edad en 1 mL de tampón NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0,5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM espermidina, 0,15 mM espermina, 1× inhibidores de proteasas Complete sin EDTA) con un homogeneizador / dispersor de inmersión durante 1 min (a 3000 rpm). El homogeneizado se transfirió a un homogeneizador Dounce de vidrio previamente enfriado y se aplicaron 15 recorridos completos con un émbolo de ajuste estrecho. A continuación, los núcleos libres se centrifugaron a 6000xg durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos que contenían los núcleos se resuspendieron en 1 mL de NEB y se centrifugaron a 20.000 × g durante 20 min en un gradiente de sacarosa (0,65 mL de sacarosa 1,6 M en NEB, 0,35 mL de sacarosa 0,8 M en NEB). El sedimento se resuspendió en 1 mL de NEB y se añadió formaldehído hasta una concentración final del 1%. Los núcleos se sometieron a entrecruzamiento durante 10 min a temperatura ambiente y la reacción se detuvo añadiendo 1/10 vol de glicina 1,375 M. Los núcleos se recogieron mediante centrifugación a 6000 × g durante 5 min. Se lavaron dos veces en 1 mL de NEB y se resuspendieron en 1 mL de tampón de lisis (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% desoxicolato de Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarcosina y 1× inhibidores de proteasas Complete sin EDTA). Los núcleos se sonicaron utilizando un procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis veces, con 20 s de sonicación y 1 min sobre hielo. Los núcleos sonicados se centrifugaron a 13.000 × g durante 4 min a 4 °C. La mayor parte de la cromatina sonicada tenía una longitud de 500 a 1000 pares de bases (bp). Para cada inmunoprecipitación, se incubaron 15 μg de cromatina en presencia de 10 μg de anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4 °C en una rueda rotatoria). A continuación, se añadieron 50 μl de dynabeads de proteína G y se continuó la incubación durante toda la noche a 4 °C. Se desecharon los sobrenadantes y las muestras se lavaron dos veces en tampón de lisis (cada lavado durante 15 min a 4 °C) y dos veces en tampón TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). La cromatina se eluyó de las perlas en dos etapas: primero en 100 μl de tampón de elución 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65 °C durante 15 min, seguido de centrifugación y recuperación del sobrenadante. El material de las perlas se extrajo de nuevo en 100 μl de TE + 0,67% SDS. El eluato combinado (200 μl) se incubó durante toda la noche a 65 °C para revertir los entrecruzamientos y se trató con 50 μg/ml de RNaseA durante 15 min a 65 °C y con 500 μg/ml de proteinasa K durante 3 h a 65 °C. Las muestras se extrajeron con fenol–cloroformo y se precipitaron con etanol. El ADN se resuspendió en 25 μl de agua. Para maximizar los análisis moleculares con el ADN inmunoprecipitado, los genes candidatos se amplificaron por parejas mediante un protocolo optimizado de PCR dúplex, utilizando en una única reacción dos conjuntos diferentes de cebadores con temperaturas de fusión similares.
(Casale et al. 2019)
 

Equipos de ruptura celular por ultrasonidos de alto rendimiento para muestras biológicas

Hielscher Ultrasonics es su socio con amplia experiencia en sonicadores de alto rendimiento para la ruptura celular, la lisis, la extracción de proteínas, la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina, así como otras etapas de preparación preanalítica de muestras. Con una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos de laboratorio y unidades de preparación de muestras, Hielscher dispone del equipo ultrasónico ideal para su aplicación biológica y sus requisitos.
El sonicador de sonda clásico con micropunta, como el UP200St (200 W; véase la imagen de la izquierda), o una de las unidades ultrasónicas de preparación de muestras VialTweeter o UP200ST_TD_CupHorn con VialHolder son modelos preferidos en los laboratorios de investigación y análisis. La sonda ultrasónica clásica es ideal cuando se necesita realizar la lisis, la extracción o la fragmentación de un número reducido de muestras. Las unidades de preparación de muestras VialTweeter y UP200St_TD_CupHorn permiten la sonicación simultánea de hasta 10 o 5 viales, respectivamente.
Si se deben procesar grandes cantidades de muestras (p. ej., placas de 96 pocillos, placas de microtitulación, etc.), el UIP400MTP es el sistema de sonicación ideal. El UIP400MTP funciona como un sonotrodo de copa de mayor tamaño, que se llena de agua y dispone de espacio suficiente para alojar placas de micropocillos. Accionado por un potente procesador ultrasónico de 400 vatios, el UIP400MTP proporciona una sonicación muy uniforme e intensa de placas multipocillo para romper células, lisar muestras, solubilizar sedimentos, extraer proteínas o cizallar ADN.

Control preciso mediante software inteligente

Todas las soluciones de sonicación de Hielscher a partir de 200 vatios están equipadas con una pantalla táctil digital en color y software inteligente. Mediante el registro inteligente de datos, todos los parámetros del proceso ultrasónico se guardan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD integrada en cuanto se pone en marcha el sonicador. Esto facilita considerablemente la investigación y el registro de los procesos. Tras los ensayos de sonicación o la preparación de muestras, puede revisar fácilmente los parámetros de sonicación de cada ejecución y compararlos.
El menú intuitivo permite preconfigurar numerosos parámetros antes de la sonicación: por ejemplo, para controlar la temperatura de la muestra y evitar su degradación térmica, se puede establecer un límite superior de temperatura de la muestra. Un sensor de temperatura conectable, incluido con la unidad ultrasónica, informa al procesador ultrasónico de la temperatura real de sonicación. Cuando se alcanza el límite superior de temperatura, el equipo ultrasónico se detiene hasta que se alcanza el límite inferior del ∆T establecido y, entonces, reanuda automáticamente la sonicación.
Si se requiere una sonicación con un aporte de energía específico, puede preconfigurar la energía ultrasónica final de la ejecución de sonicación. Por supuesto, también pueden ajustarse individualmente la pulsación ultrasónica y el modo de ciclos.
Para reutilizar los parámetros de sonicación que hayan dado mejores resultados, puede guardar diversos modos de sonicación (p. ej., tiempo de sonicación, intensidad, modo de ciclos, etc.) como modos preconfigurados, de modo que puedan volver a iniciarse de forma fácil y rápida.
Para facilitar aún más el manejo, todas las unidades ultrasónicas digitales pueden operarse mediante control remoto desde cualquier navegador habitual (p. ej., InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La conexión LAN se configura fácilmente mediante conexión y puesta en marcha y no requiere instalar software adicional.
En Hielscher sabemos que la sonicación satisfactoria de muestras biológicas requiere precisión y repetibilidad. Por ello, hemos diseñado nuestros sonicadores como dispositivos inteligentes con todas las funciones que permiten preparar muestras de forma eficiente, fiable, reproducible y cómoda.

La siguiente tabla ofrece una orientación sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas ultrasónicos, desde micropuntas ultrasónicas y homogeneizadores ultrasónicos clásicos hasta sonicadores MultiSample para la preparación cómoda y fiable de numerosas muestras: