Lisis ultrasónica de muestras de Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster se utiliza ampliamente en los laboratorios como organismo modelo. Por lo tanto, los pasos de preparación preanalítica como la lisis, la disrupción celular, la extracción de proteínas y la fragmentación del ADN de las muestras de Drosophila melanogaster deben llevarse a cabo con frecuencia. Los desmembradores ultrasónicos son fiables y eficientes y pueden utilizarse para realizar fácilmente diversas tareas como la lisis, la extracción de proteínas o la fragmentación del ADN con sólo ajustar los parámetros ultrasónicos del proceso. Así pues, los homogeneizadores ultrasónicos son herramientas flexibles con una amplia gama de aplicaciones.

Lisis ultrasónica y extracción de proteínas

Drosophila melanogaster se utiliza ampliamente como organismo modelo en laboratorios biológicos. Aquí encontrará protocolos para la lisis, extracción de proteínas y cizallamiento de ADN de muestras de D. melanogaster.La lisis, la solubilización celular, la homogeneización de tejidos y la extracción de proteínas son tareas típicas de los desmembradores ultrasónicos en los laboratorios biológicos. Los desmembradores ultrasónicos y los disruptores celulares son muy adecuados para homogeneizar tejidos animales, insectos (por ejemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) o especímenes vegetales. Las aplicaciones posteriores de la ultrasonicación son la lisis de suspensiones y gránulos celulares, así como la extracción de proteínas intracelulares.
La lisis ultrasónica y la extracción de proteínas son procesos altamente fiables y reproducibles, que pueden realizarse sobre la base de protocolos establecidos. Dado que la intensidad del proceso ultrasónico puede ajustarse exactamente mediante parámetros de sonicación como la amplitud, el ciclo/modo de pulso, la temperatura y el volumen de la muestra, los protocolos probados pueden repetirse una y otra vez con el mismo resultado.

Ventajas de la preparación de muestras por ultrasonidos

  • Alta eficiencia
  • Ajustable al material de muestra específico
  • Adecuado para cualquier volumen
  • tratamiento no térmico
  • resultados reproducibles
  • Sencillo y seguro

Fragmentación ultrasónica de ADN y ARN

Tras la lisis celular y la extracción de proteínas, un paso necesario habitual en la preparación de muestras es el cizallamiento y la fragmentación del ADN, el ARN y la cromatina, por ejemplo, antes de la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). La fragmentación del ADN y el ARN puede conseguirse de forma fiable rompiendo los enlaces covalentes que mantienen unido el ADN mediante fuerzas físicas. Mediante el cizallamiento físico, como la sonicación, primero se rompen las hebras de ADN y después el ADN se fragmenta en trozos más pequeños.
La fragmentación ultrasónica del ADN es fiable y eficaz para cizallar el ADN hasta una longitud determinada, por ejemplo 500 pb (pares de bases). Las principales ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN incluyen el control preciso de los parámetros y la intensidad del proceso ultrasónico. Los parámetros del proceso ultrasónico pueden ajustarse sintonizando con precisión la intensidad, los ciclos y el tiempo de sonicación. Esto permite crear tamaños de ADN deseados y producir y reproducir de forma fiable la longitud de ADN deseada. El cizallamiento ultrasónico del ADN también es ideal para crear fragmentos de ADN de alto peso molecular.

Ultrasonicador UP200Ht con microtip S26d2 para lisis ultrasónica de muestras de Drosophila

Ultrasonicador UP200Ht con microtip de 2mm S26d2 para la sonicación de muestras de Drosophila

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Protocolos para la lisis ultrasónica de Drosophila melanogaster

A continuación encontrará varios protocolos para la lisis asistida por ultrasonidos, la extracción de proteínas y la fragmentación del ADN o la cromatina de muestras de Drosophila.

Lisis ultrasónica para el ensayo de inmunoprecipitación por reticulación (CLIP)

El ensayo CLIP se realizó como se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones. Aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras de tipo salvaje de 0 a 1 día de edad se reticularon con UV (3 × 2000 μJ/cm2), se homogeneizaron en hielo en 1 mL de tampón RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT, 1× Inhibidores completos de proteasas sin EDTA, 1 mM PMSF) suplementado con 300 U de RNAseOUT y colocado en hielo durante 30 min. El homogeneizado se sometió a sonicación en hielo, al 80% de potencia, cinco veces en ráfagas de 20 s con un descanso de 60 s entre cada una, utilizando el procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) y se centrifugó (16000 × g durante 5 min a 4°C). El extracto soluble se limpió previamente con 20 μl de dynabeads Protein-G durante 20 min a 4°C. Tras retirar las muestras para inmunotransferencia y cuantificar el ARN de entrada (1%), HP1 se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-HP1 9A9 a partir de 450 μl de extracto previamente aclarado mediante incubación durante 4 h con 50 μl de dynabeads Protein-G. Los inmunoprecipitados se lavaron 4 veces con RCB. Para eluir los ARN inmunoprecipitados, las perlas granuladas se hirvieron en 100 μL de agua ultrapura tratada con DEPC durante 5 min. Se añadieron 900 μL de reactivo Qiazol al sobrenadante recuperado para la preparación del ARN. El ARN purificado se utilizó como molde para sintetizar ADNc utilizando oligo dT, hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa SuperScript III según el protocolo del fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lisis ultrasónica para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

La inmunoprecipitación de la cromatina se realizó según el método descrito por Menet con pequeñas modificaciones. Se homogeneizaron aproximadamente 20 mg de ovarios de hembras de tipo salvaje de 0 a 1 día de edad en 1 mL de tampón NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0.5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Espermidina, 0,15 mM Espermina, 1× Inhibidores completos de proteasas sin EDTA) con un homogeneizador / dispersor de inmersión 1 min (a 3000 rpm). El homogeneizado se transfirió a un recipiente de vidrio previamente enfriado y se aplicaron 15 golpes completos con un mortero apretado. A continuación se centrifugaron los núcleos libres a 6000xg durante 10 min a 4°C. Los pellets que contenían núcleos se resuspendieron en 1 mL de NEB y se centrifugaron a 20000 × g durante 20 min en gradiente de sacarosa (0,65 mL de sacarosa 1,6 M en NEB, 0,35 mL de sacarosa 0,8 M en NEB). El pellet se resuspendió en 1 mL de NEB y formaldehído a una concentración final del 1%. Los núcleos se reticularon durante 10 min a temperatura ambiente y se apagaron añadiendo 1/10 vol de 1,375 M de glicina. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 6000 × g durante 5 min. Los núcleos se lavaron dos veces en 1 mL de NEB y se resuspendieron en 1 mL de tampón de lisis (15 mM de HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM de NaCl, 0,5 mM de EGTA, 1 mM de EDTA a pH 8, 1% de Tritón X-100, 0,5 mM de DTT, 0,1% de Na desoxicolato, 0,1% de SDS, 0,5% de N-lauroilsarcosina y 1× Inhibidores completos de proteasas sin EDTA). Los núcleos se sonicaron con un procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis veces durante 20 s en y 1 min en hielo. Los núcleos sonorizados se centrifugaron a 13000 × g durante 4 min a 4°C. La mayor parte de la cromatina sonicada tenía una longitud de 500 a 1000 pares de bases (pb). Para cada inmunoprecipitación, se incubaron 15 μg de cromatina en presencia de 10 μg de anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4 °C en una rueda giratoria). A continuación, se añadieron 50 μl de proteína G dynabeads y se continuó la incubación durante toda la noche a 4 °C. Se desecharon los sobrenadantes y las muestras se lavaron dos veces en tampón de lisis (cada lavado 15 min a 4 °C) y dos veces en tampón TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). La cromatina se eluyó de las microesferas en dos pasos; primero en 100 μl de tampón de elución 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65 °C durante 15 min, seguido de centrifugación y recuperación del sobrenadante. El material de las microesferas se volvió a extraer en 100 μl de TE + 0,67% SDS. El eluido combinado (200 μl) se incubó durante la noche a 65°C para invertir los enlaces cruzados y se trató con 50 μg/ml de RNasaA durante 15 min a 65°C y con 500 μg/ml de Proteinasa K durante 3 h a 65°C. Las muestras se extrajeron con fenol-cloroformo y se precipitaron con etanol. El ADN se resuspendió en 25 μl de agua. Para maximizar los análisis moleculares con el ADN inmunoprecipitado, los genes candidatos se amplificaron por pares mediante un protocolo optimizado de PCR dúplex utilizando dos conjuntos diferentes de cebadores con temperaturas de fusión similares en una única reacción.
(Casale et al. 2019)
 

Este tutorial explica qué tipo de sonicador es el mejor para sus tareas de preparación de muestras como lisis, disrupción celular, aislamiento de proteínas, fragmentación de ADN y ARN en laboratorios, análisis e investigación. Elija el tipo de sonicador ideal para su aplicación, volumen de muestra, número de muestras y rendimiento. Hielscher Ultrasonics tiene el homogeneizador ultrasónico ideal para usted.

Cómo encontrar el sonicador perfecto para la disrupción celular y la extracción de proteínas en ciencia y análisis

Vídeo en miniatura

UP200St TD_CupHorn para la sonicación indirecta de muestras

UP200St TD_CupHorn para la sonicación indirecta de muestras como ADN y cizallamiento de cromatina

Disruptores celulares ultrasónicos de alto rendimiento para muestras biológicas

Hielscher Ultrasonics es su socio de larga experiencia cuando se trata de ultrasonicadores de alto rendimiento para la disrupción celular, lisis, extracción de proteínas, fragmentación de ADN, ARN y cromatina, así como otros pasos de preparación de muestras preanalíticas. Con una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos de laboratorio y unidades de preparación de muestras, Hielscher tiene el dispositivo ultrasónico ideal para sus aplicaciones y requisitos biológicos.
Insonificador tipo sonda UP200St para lisisUltrasonido clásico tipo sonda con micro-punta como el UP200St (200 W; véase la imagen de la izquierda) o una de las unidades ultrasónicas de preparación de muestras VialTweeter o UP200ST_TD_CupHorn con VialHolder son los modelos favoritos en los laboratorios de investigación y análisis. La sonda ultrasónica clásica es ideal cuando hay que preparar pocas muestras para su lisis, extracción o fragmentación. Las unidades de preparación de muestras VialTweeter y UP200St_TD_CupHorn permiten la sonicación simultánea de hasta 10 o 5 viales, respectivamente.
Si se debe procesar un número elevado de muestras (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas microtiter, etc.), el UIP400MTP es la configuración de sonicación ideal. El UIP400MTP funciona como un cuerno de copa más grande, que se llena con agua y tiene espacio suficiente para alojar placas de micropocillos. Alimentado por un potente procesador ultrasónico de 400 vatios, el UIP400MTP proporciona una sonicación muy uniforme e intensa de placas de múltiples pocillos para disgregar células, lisar muestras, solubilizar pellets, extraer proteínas o cizallar ADN.

Control preciso mediante software inteligente

Los procesadores industriales de la serie hdT de Hielscher se pueden manejar de forma remota desde el navegador de forma fácil y cómoda.Todas las soluciones de sonicación de Hielscher a partir de 200 vatios están equipadas con una pantalla táctil digital en color y un software inteligente. Mediante el protocolling de datos inteligente, todos los parámetros del proceso ultrasónico se guardan automáticamente como archivo CSV en una tarjeta SD integrada en cuanto se pone en marcha el ultrasonicador. Esto hace que la investigación y el protocolling sean mucho más cómodos. Después de los ensayos de sonicación o de la preparación de la muestra, puede simplemente revisar los parámetros de sonicación de cada ciclo de sonicación y compararlos.
A través del menú intuitivo, se pueden preajustar numerosos parámetros antes de la sonicación: Por ejemplo, para controlar la temperatura de la muestra y evitar su degradación térmica, se puede establecer un límite superior de temperatura de la muestra. Un sensor de temperatura enchufable, que se suministra con la unidad de ultrasonidos, proporciona al procesador de ultrasonidos información sobre la temperatura de sonicación real. Cuando se alcanza el límite superior de temperatura, el aparato de ultrasonidos hace una pausa hasta que se alcanza el límite inferior de la ∆T fijada y vuelve a sonicar automáticamente.
Si se requiere una sonicación con una entrada de energía específica, puede preajustar la energía ultrasónica final del ciclo de sonicación. Por supuesto, la pulsación ultrasónica y el modo de ciclo también pueden ajustarse individualmente.
Para reutilizar sus parámetros de sonicación más exitosos, puede guardar varios modos de sonicación (por ejemplo, tiempo de sonicación, intensidad, modo de ciclo, etc.) como modos preestablecidos, de modo que puedan iniciarse de nuevo fácil y rápidamente.
Para mayor comodidad operativa, todas las unidades ultrasónicas digitales pueden manejarse a través del mando a distancia de cualquier navegador común (por ejemplo, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La conexión LAN es una sencilla configuración plug-n-play y no requiere instalación de software adicional.
En Hielscher sabemos que el éxito de la sonicación de muestras biológicas requiere precisión y repetibilidad. Por ello, hemos diseñado nuestros ultrasonicadores como dispositivos inteligentes con todas las características que permiten una preparación de muestras eficiente, fiable, reproducible y cómoda.

Póngase en contacto con nosotros e infórmenos sobre sus muestras biológicas y los pasos de preparación necesarios. Le propondremos el dispositivo ultrasónico de preparación de muestras más adecuado y le ayudaremos con información adicional, como protocolos y recomendaciones.

La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas de ultrasonidos, desde las micropuntas ultrasónicas y los homogeneizadores ultrasónicos clásicos hasta los ultrasonicadores MultiSample para la preparación cómoda y fiable de numerosas muestras:

Volumen del loteTasa de flujoDispositivos recomendados
Placas de 96 pocillos / microtitulaciónn.a.UIP400MTP
10 viales de 0,5 a 1,5 mln.a.VialTweeter en UP200St
CupHorn para sonicación indirecta, por ejemplo, hasta 5 vialesn.a.UP200ST_TD_CupHorn
0De 0,01 a 250 ml5 a 100mL/minUP50H
0.01 a 500mL10 a 200 mL/min.UP100H
0.02 a 1L20 a 400 mL/min.UP200Ht / UP200St
10 a 2000 mL20 a 400 mL/min.UP200Ht, UP400St
0De 0,25 a 5 litros0De 0,05 a 1 l/minUIP500hdT

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El VialTweeter es un ultrasonicador multimuestra que permite una preparación fiable de las muestras en condiciones de temperatura controladas con precisión.

La unidad ultrasónica de preparación de muestras múltiples VialTweeter permite la sonicación simultánea de hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción VialPress, se pueden presionar hasta 4 viales adicionales hacia delante para una sonicación intensa.



Información interesante

metabolómica

La metabolómica es el estudio de pequeñas moléculas, conocidas como metabolitos, presentes en células, biofluidos, tejidos u organismos. Estas pequeñas moléculas y sus interacciones dentro de un sistema biológico se resumen bajo el término "metaboloma" y el campo de investigación se denomina metabolómica. La investigación del metaboloma está estrechamente relacionada con el campo emergente de la medicina de precisión. La comprensión del metaboloma y su relación con diversas enfermedades ayuda a desarrollar estrategias de prevención de enfermedades y atención clínica, al tiempo que se tiene en cuenta la variabilidad individual del entorno, el estilo de vida, la genética y el fenotipo molecular. Con el fin de liberar moléculas de metabolitos de las células, la ultrasonicación se utiliza con frecuencia en los laboratorios biológicos para la preparación preanalítica de muestras, como la disrupción celular, la lisis y la extracción de proteínas, lípidos y otras moléculas.


Literatura / Referencias


Hielscher Ultrasonics suministra homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento desde tamaño de laboratorio hasta industrial.

Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonicador compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

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