Preparación ultrasónica de muestras de C. Elegans

C. elegans, un gusano nematodo, es un organismo modelo ampliamente utilizado en biología. La preparación de muestras antes del análisis requiere lisis, extracción de proteínas y lípidos, así como fragmentación del ARN, procedimientos que pueden realizarse de forma fiable mediante sonicación. Los disruptores celulares ultrasónicos son equipos fiables, avanzados y fáciles de usar para la preparación rápida de muestras de C. elegans.

Preparación ultrasónica de muestras de C. elegans

Caenorhabditis elegans son gusanos cilíndricos ampliamente utilizados en laboratorios de investigación para estudiar la genómica, la biología del desarrollo y las enfermedades. Muchos genes del genoma de C. elegans tienen equivalentes funcionales en los seres humanos. Por ello, este gusano nematodo es un modelo extremadamente útil para las enfermedades humanas. Otras ventajas que explican el uso generalizado de C. elegans son su cultivo sencillo y económico en placas que contienen bacterias (p. ej., E. coli), su transparencia, su facilidad de manejo y la posibilidad de congelar y almacenar los gusanos durante períodos prolongados.
El análisis de proteínas y lípidos es un procedimiento habitual en los laboratorios, y la preparación ultrasónica de muestras es el método establecido para lisar nematodos C. elegans en cualquier etapa del desarrollo (es decir, embriones, larvas L1–L4 y adultos). Dado que C. elegans también se utiliza como sistema de expresión de proteínas para sobreexpresar proteínas específicas, se requiere un método de lisis y extracción de proteínas fiable y reproducible que proporcione un alto rendimiento proteico. Los sistemas de ruptura celular y extracción por ultrasonidos están disponibles como homogeneizadores de sonda y como ultrasonicadores para múltiples muestras. Hielscher Ultrasonics dispone del disruptor celular ultrasónico ideal para su procedimiento de laboratorio, con soluciones que facilitan la preparación de muestras de cualquier tamaño y en cualquier cantidad.

Protocolos ultrasónicos para la ruptura y lisis de C. Elegans

La homogeneización y lisis ultrasónicas de C. elegans, así como la posterior extracción de proteínas y lípidos, pueden realizarse mediante diversos procedimientos que emplean diferentes tampones de homogeneización y lisis, etc. Todos los protocolos de lisis tienen en común que las muestras deben mantenerse continuamente sobre hielo para evitar la degradación de las proteínas. A continuación, presentamos algunos protocolos fiables y rápidos de lisis y extracción por ultrasonidos para preparar muestras de C. elegans de alta calidad que contengan proteínas o lípidos.

Ventajas de la lisis ultrasónica de C. elegans

• fiable
• reproducible
• temperatura controlada con precisión
• control fiable del proceso
• método suave
• fácil de aplicar
• segura

Extracción ultrasónica de proteínas de muestras de C. elegans

La lisis ultrasónica y la extracción de proteínas de gusanos C. elegans pueden realizarse mediante diversos protocolos. A continuación, presentamos algunos protocolos de lisis fiables y rápidos para obtener resultados reproducibles en la extracción de proteínas.

Preparación rápida de extracto citosólico de gusanos C. elegans mediante sonicación

Con el siguiente protocolo puede preparar lisados de C. elegans en menos de 30 minutos.
Recogida de C. elegans
Transfiera los gusanos C. elegans deseados a un tubo de 1,5 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS), o recójalos de una placa mediante un lavado con 1,5 ml de PBS. Centrifugue durante 1 min a 2000rpm para formar un sedimento. Mantenga las muestras sobre hielo en todo momento.
A continuación, lave los gusanos dos veces con PBS.
Después, lave los gusanos dos veces con ddH₂O.
Resuspenda los gusanos en al menos 500ul de tampón de homogeneización (HB). Las muestras de gusanos ya están listas para la lisis ultrasónica.
Para obtener extractos proteicos de mayor calidad, puede reducir la contaminación bacteriana lavando los gusanos durante 5 min en cada uno de los siguientes medios: PBS y agua ultrapura estéril (ddH₂O), o realizar una flotación en sacarosa. Mantenga las muestras de gusanos continuamente sobre hielo.

Protocolo de lisis ultrasónica de C. elegans

• Asegúrese de preparar el ultrasonicador con antelación para que el homogeneizador ultrasónico esté listo para su uso (sonda montada y programa de sonicación preconfigurado). 

Si su ultrasonicador está montado en un soporte, coloque el baño de hielo con los tubos de muestras debajo de la sonda ultrasónica e introduzca la sonda ultrasónica en el tubo de 1,5 ml.

• Para la lisis de C. elegans con el UP200St o el UP200Ht, la sonicación debe realizarse con una micropunta (p. ej., la sonda S26d2 de 2 mm; véase la imagen de la izquierda) a una amplitud del 40% durante 1sec, con pausas de 30sec entre pulsos. Para la lisis de C. elegans, lo ideal son 5 ciclos de sonicación de 1 segundo cada uno, con pausas de 30sec. Si realiza la lisis por primera vez, puede comprobar su avance mediante un microscopio en pequeñas alícuotas de la muestra después de cada pulso.
• La lisis se completa correctamente cuando los gusanos se han roto. La sonicación excesiva provoca la ruptura de los núcleos y se hace evidente cuando la muestra se vuelve viscosa o forma espuma. Para evitar la degradación de la muestra, utilice más pulsos si es necesario. No aumente la duración de cada ciclo de pulsos ultrasónicos para obtener extractos proteicos de alta calidad.
• Clarifique el lisado celular centrifugando los gusanos lisados por ultrasonidos a 14.000rpm durante 10 min a 4ºC.
• A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y prepárelo para la inmunoprecipitación u otros ensayos.

Nota sobre el tampón de homogeneización: prepare el tampón de homogeneización para el protocolo de lisis ultrasónica anterior del siguiente modo:

Lisis de C. elegans de alto rendimiento en placas de 96 pocillos con el sonicador de placas UIP400MTP

Lisis de C. elegans (nematodos adultos)
UIP400MTP a una amplitud del 80%, 20 ciclos (cada ciclo de sonicación: 30 sec de funcionamiento, 30 sec de pausa)
Tampón de lisis:

• Opción 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opción 2) para coinmunoprecipitación (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cóctel de inhibidores de proteinasas Complete)

Fragmentación de ADN de alto rendimiento
ADN de C. elegans (nematodos adultos), 200–300bp: sonicador de placas UIP400MTP – ajustar la amplitud al 80%, 30pulsos – cada uno con 30sec de funcionamiento y 30sec de pausa

El sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento sonica uniformemente las muestras en placas multipocillo, placas de microtitulación y placas de 96 pocillos

Lisis ultrasónica de C. elegans para ensayos cuantitativos de purificación por afinidad

Se recogieron embriones frescos de C. elegans (∼2 millones por réplica) por triplicado biológico mediante tratamiento con lejía de hermafroditas jóvenes grávidos y se sonicaron sobre hielo (ciclo: 0,5 s, amplitud: 40–45%, 5 pulsos/sesión, 5 sesiones, intervalo entre sesiones: 30 s; procesador ultrasónico UP200S con micropunta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) en tampón de lisis (volumen total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% de glicerol, mezcla de inhibidores de proteasas, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Tras la sonicación, se añadió Nonidet P-40 Substitute hasta alcanzar el 1% y los lisados se incubaron con rotación de extremo a extremo a 4 °C durante 30 min, seguido de centrifugación a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C. A continuación, se aspiró el lisado clarificado sin alterar la capa lipídica superior y se dividió en dos mitades, una para las perlas de agarosa anti-GFP y otra para las perlas de control bloqueadas (40–50 μl). Tras una rotación de extremo a extremo a 4 °C durante 60–90 min, las perlas se lavaron una vez con tampón de lisis que contenía 0,1% Nonidet P-40 Substitute, seguido de dos lavados con tampón I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), tampón II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o ambos. Para los ensayos de pull-down de GFP:MBK-2, se realizaron dos experimentos independientes con diferentes condiciones de lavado. Las proteínas se eluyeron mediante agitación orbital en 50 μl de urea 6 m/tiourea 2 M a temperatura ambiente. Para los experimentos de pull-down de MBK-1::GFP, las proteínas se eluyeron dos veces mediante agitación en 50μl de cloruro de guanidinio 8 m a 90 °C, seguido de precipitación con etanol. A continuación, las muestras de proteínas eluidas se digirieron en solución.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogeneización y lisis ultrasónicas de gusanos

Para el procedimiento de lisis y extracción de proteínas de C.elegans, se recogieron 30.000 nematodos de la etapa correspondiente por muestra y se lavaron con S-basal enfriado en hielo, se concentraron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 2 min., se lavaron seis veces con S-basal enfriado en hielo para eliminar las bacterias residuales y se mantuvieron sobre hielo hasta su uso. Para la extracción de proteínas, se dejó que los gusanos adultos grávidos formaran un sedimento compacto después del último lavado con S-basal. A continuación, los sedimentos de gusanos se resuspendieron en 1 ml de tampón de extracción enfriado en hielo [20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibidores de proteasas (Sigma P2714)] y se procesaron inmediatamente.
Se sonicaron ∼30.000 gusanos adultos grávidos (correspondientes a ∼100 mg de peso húmedo) sobre hielo utilizando un ultrasonicador de sonda (p. ej., UP50H con micropunta MS2) a una amplitud del 40% durante 10 ciclos de 3 sec de funcionamiento y 30 sec de pausa, en 1 ml de tampón de extracción enfriado en hielo. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extracción ultrasónica de lípidos de C. elegans

En lipidómica, una rama de la metabolómica, se caracteriza y analiza el conjunto de lípidos de los sistemas biológicos. C. elegans se utiliza ampliamente en lipidómica para investigar la interacción de los lípidos metabólicos y sus efectos sobre la salud y la longevidad.
La lisis y extracción por ultrasonidos se utiliza para liberar lípidos, como los esfingolípidos, de embriones, larvas y gusanos adultos de C. elegans. La sonicación se utiliza para preparar homogeneizados de gusanos y, posteriormente, extraer los lípidos de la muestra.
Protocolo de extracción ultrasónica de lípidos de C. elegans
Descongele el sedimento de C. elegans sobre hielo y resuspéndalo con 0,5 ml de ultrawater. Sonique las muestras de C. elegans en tubos de ensayo de 1,5 mL, manteniéndolas continuamente sobre hielo.
La sonicación puede realizarse con un ultrasonicador de sonda como el UP200Ht, la unidad ultrasónica de preparación de muestras VialTweeter (sonicación simultánea de 10 muestras) o el UIP400MTP (para la sonicación de placas multipocillo, como las placas de 96 pocillos). Para la lisis ultrasónica con el UP200Ht, utilice la micropunta S26d2. Preconfigure el modo de ciclos ultrasónicos en el menú digital. Ajuste la amplitud al 10% y el modo de ciclos de sonicación a 20 ciclos de pulsos de 2 sec con una pausa de 30 sec. entre las ráfagas de pulsos ultrasónicos.
Transfiera los sobrenadantes a tubos de vidrio con tapón de rosca. Realice la extracción de Folch añadiendo 1 ml de ultrawater a cada tubo de vidrio y, a continuación, 6 ml de una mezcla de cloroformo/metanol (proporción = 2:1) a cada tubo de vidrio.
Agite cada tubo de vidrio en un agitador vórtex durante 30 sec, 4 veces. Centrifugue los tubos a 1.258 x g durante 15 min (Eppendorf, 5810 R) para mejorar aún más la separación de fases. Transfiera la fracción hidrófoba inferior a un tubo de vidrio limpio con una pipeta Pasteur de vidrio. Seque la fracción hidrófoba inferior bajo un flujo de nitrógeno en un evaporador de nitrógeno. Almacene el sedimento seco en un congelador a -80 °C hasta su uso. 


Preparación ultrasónica de lisados de gusanos

Lisado de gusanos: se recogieron gusanos en el estadio L4 y se lavaron tres veces con tampón M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl y 0,87 mM MgSO₄) para eliminar todas las bacterias. Tras retirar la mayor cantidad posible de tampón M9, los gusanos se resuspendieron en tampón de lisis: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM de fosfato β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de ortovanadato de sodio, 5 mM de pirofosfato de sodio, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo e inhibidor de proteasas. Los gusanos se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron a 37 °C tres veces; después se sonicaron sobre hielo seco con una unidad ultrasónica VialTweeter para la preparación simultánea de 10 tubos de muestras. La sonicación se realizó a una amplitud del 50% en 10 ciclos de 2 sec. con pausas de 30 sec entre las ráfagas de sonicación. Después, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm a 4 °C durante 15 min. Se recogió el sobrenadante y se almacenó a -70 °C. Se utilizó una alícuota para la cuantificación de proteínas mediante el ensayo de Bradford.
Determinación de glutatión total, GSH y GSSG: para la cuantificación de glutatión, los lisados y la determinación se realizaron el mismo día. Se recogieron larvas L4 alimentadas con glucosa y larvas L4 de control, y se lavaron tres veces con tampón M9. Tras retirar la mayor cantidad posible de tampón M9, los gusanos se resuspendieron en ácido metafosfórico enfriado en hielo (5% w/v); después se sonicaron sobre hielo con un VialTweeter ultrasónico a una amplitud del 50% en diez ciclos de sonicación de 2 sec. con una pausa de 30 sec. entre cada ciclo. A continuación, se centrifugaron a 12.000 rpm a 4 ̊C durante 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparación de muestras de C. elegans antes de la inmunoprecipitación y el Western blot

En resumen, para obtener extractos embrionarios, se cultivaron larvas L1 de C. elegans en cultivos líquidos de medio S a gran escala hasta la edad adulta. Los embriones se recogieron mediante el método estándar con lejía y se suspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% de glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 cóctel de inhibidores de proteasas y 1􏰅 cóctel de inhibidores de fosfatasas I y II), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se lisaron mediante ruptura celular ultrasónica utilizando un ultrasonicador con micropunta como el UP200Ht con S26d2 durante 10 pulsos a lo largo de 10 s a una amplitud del 30%. Si es necesario preparar un mayor número de muestras, se recomiendan el equipo ultrasónico VialTweeter o el ultrasonicador para múltiples muestras UIP400MTP para placas de pocillos. Tras la sonicación, los extractos se preclarificaron mediante centrifugación a 30.000 g durante 20 min a 4 °C. El extracto preclarificado (300µg de proteína total) se incubó con 40µ􏰂g de anticuerpo anti-CDC-25.1 purificado por afinidad (este estudio) y entrecruzado con proteína A-agarosa; como control, se utilizó una cantidad similar de inmunoglobulina (Ig)G de conejo entrecruzada con proteína A-agarosa, en un volumen total de 200µl de tampón de lisis que contenía 1% NP-40, cuya inclusión redujo la unión inespecífica de las proteínas a la matriz. Las muestras se mantuvieron en rotación durante 1 h a 4 °C, las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis y se eluyeron con 30µl de glicina/HCl y 200 mM NaCl, pH 2,2. Tras la inmunoprecipitación, los eluatos se diluyeron en 30µ􏰂l de tampón de muestras para SDS, se calentaron a 95 °C durante 4 min y, habitualmente, se aplicaron a SDS-PAGE el 3% del total como muestra de entrada y el 30% de los eluatos, seguido de Western blot con anticuerpos anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), antiubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) o anti-􏰁β-actina (1:2000). Cuando los extractos no se sometieron a inmunoprecipitación, se resuspendió la misma cantidad de proteína total de esos extractos en tampón de muestras para SDS, se calentó a 95 °C y después se aplicó directamente a SDS-PAGE y se analizó mediante Western blot. (cf. Segref et al. 2020)

Lisis ultrasónica con control preciso de la temperatura

El control preciso y fiable de la temperatura es crucial al manipular muestras biológicas. Las temperaturas elevadas desencadenan la degradación térmica de las proteínas de las muestras.
Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse adecuadamente con el VialTweeter. Presentamos varias opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con el VialTweeter y el VialPress para su análisis.

1. Supervisión de la temperatura de la muestra: el procesador ultrasónico UP200St, que acciona el VialTweeter, incorpora un software inteligente y un sensor de temperatura conectable. Conecte el sensor de temperatura al UP200St e introduzca la punta del sensor en uno de los tubos de muestras. Mediante la pantalla táctil digital en color, puede configurar en el menú del UP200St un intervalo de temperatura específico para la sonicación de sus muestras. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y permanecerá en pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda al valor inferior del intervalo de temperatura ∆ establecido. A continuación, la sonicación se reanudará automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
2. El bloque VialTweeter puede preenfriarse. Introduzca el bloque VialTweeter (¡solo el sonotrodo, sin el transductor!) en el frigorífico o el congelador para preenfriar el bloque de titanio, lo que ayuda a retrasar el aumento de temperatura de la muestra. Si es posible, también puede preenfriarse la propia muestra.
3. Utilice hielo seco para refrigerar durante la sonicación. Utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo seco para que el calor pueda disiparse rápidamente.

Encuentre el disruptor celular ultrasónico óptimo para su aplicación de lisis

Hielscher Ultrasonics es un fabricante con amplia experiencia en disruptores celulares y homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para laboratorios y sistemas de sobremesa y a escala industrial. El tamaño de su cultivo de células bacterianas, su objetivo de investigación o producción y el volumen de células que debe procesar por hora o por día son factores esenciales para encontrar el disruptor celular ultrasónico adecuado para su aplicación.
Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones para la sonicación simultánea de múltiples muestras (hasta 10 viales) y para el procesamiento masivo de muestras (es decir, placas de microtitulación / placas de 96 pocillos), desde el clásico ultrasonicador de sonda para laboratorio con distintos niveles de potencia de 50 a 400 vatios hasta procesadores ultrasónicos plenamente industriales con hasta 16,000vatios por unidad para la ruptura celular comercial y la extracción de proteínas en la producción a gran escala. Todos los ultrasonicadores Hielscher están diseñados para funcionar 24/7/365 a plena carga. La robustez y la fiabilidad son características fundamentales de nuestros equipos ultrasónicos.
Todos los homogeneizadores ultrasónicos digitales incorporan software inteligente, pantalla táctil en color y registro automático de datos, lo que convierte el equipo ultrasónico en una herramienta de trabajo práctica para laboratorios e instalaciones de producción.
Indíquenos qué tipo de células y qué volumen necesita procesar en sus muestras biológicas, con qué frecuencia y con qué objetivo. Le recomendaremos el disruptor celular ultrasónico más adecuado para los requisitos de su proceso.

La siguiente tabla ofrece una orientación sobre la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros sistemas ultrasónicos, desde homogeneizadores compactos de mano y ultrasonicadores para múltiples muestras hasta procesadores ultrasónicos industriales para aplicaciones comerciales: