Preparación ultrasónica de muestras de C. Elegans

C. elegans, un gusano nematodo, es un organismo modelo muy utilizado en biología. La preparación de muestras antes de su análisis requiere lisis, extracción de proteínas y lípidos, así como fragmentación del ARN, lo que puede realizarse de forma fiable mediante sonicación. Los disruptores celulares ultrasónicos son dispositivos fiables, sofisticados y fáciles de usar para la preparación rápida de muestras de C. elegans.

Preparación ultrasónica de muestras de C. Elegans

Los C. elegans son gusanos redondos muy utilizados en los laboratorios de investigación para estudiar la genómica, la biología del desarrollo y las enfermedades. Muchos genes del genoma de C. elegans tienen homólogos funcionales en humanos. Por ello, este gusano nematodo es un modelo extremadamente útil para las enfermedades humanas. Otras ventajas del uso generalizado de C. elegans son su cultivo fácil y barato en placas con bacterias (por ejemplo, E. coli), su transparencia, su cómoda manipulación y la posibilidad de congelar y almacenar los gusanos durante más tiempo.
El análisis de proteínas y lípidos es un procedimiento habitual en los laboratorios y la preparación de muestras por ultrasonidos es el método establecido para lisar nematodos C. elegans en todas las fases de desarrollo (es decir, embriones, larvas L1-L4, adultos). Dado que C. elegans también se utiliza como sistema de expresión de proteínas para sobreexpresar proteínas diana, se requiere un método de lisis y extracción de proteínas fiable y reproducible que proporcione altos rendimientos proteicos. Los sistemas ultrasónicos de disrupción y extracción celular están disponibles como homogeneizadores tipo sonda y como ultrasonicadores multimuestra. Hielscher Ultrasonics tiene el disruptor celular por ultrasonidos ideal para su procedimiento de laboratorio.

Protocolos ultrasónicos para la disrupción y lisis de C. Elegans

La homogeneización por ultrasonidos y la lisis de C. elegans y la posterior extracción de proteínas y lípidos pueden realizarse mediante diversos procedimientos utilizando diferentes tampones de homogeneización y lisis, etc. Todos los protocolos de lisis tienen en común que las muestras deben mantenerse continuamente en hielo para evitar la degradación de las proteínas. A continuación, le presentamos algunos protocolos fiables y rápidos de lisis y extracción por ultrasonidos para la preparación de muestras de C. elegans de alta calidad que contengan proteínas o lípidos.

Ventajas de la lisis ultrasónica de C. elegans

• fiable
• reproducible
• temperatura controlada con precisión
• control fiable del proceso
• método suave
• fácil de aplicar
• Seguro

Extracción ultrasónica de proteínas de muestras de C. elegans

La lisis ultrasónica y la extracción de proteínas de gusanos C. elegans pueden realizarse utilizando varios protocolos. A continuación le presentamos algunos protocolos de lisis fiables y rápidos para obtener resultados reproducibles en la extracción de proteínas.

Preparación rápida de extracto citosólico de gusanos C. elegans mediante sonicación

Con el siguiente protocolo puede preparar lisados de C. elegans en menos de 30 minutos.
Colección de C. elegans
Recoger los gusanos C. elegans deseados en un tubo de 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o lavarlos de una placa con 1,5 ml de PBS. Centrifugar durante 1 minuto a 2000rpm para pellet. Mantener las muestras en hielo en todo momento.
A continuación, lave los gusanos dos veces con PBS.
A continuación, lave los gusanos dos veces con ddH₂O.
Resuspender los gusanos en al menos 500ul de tampón de homogeneización (HB). Las muestras de gusanos ya están listas para la lisis ultrasónica.
Para obtener un extracto de proteínas de mayor calidad, puede reducir la contaminación bacteriana lavando los gusanos durante 5 minutos cada uno en PBS y en agua ultrapura estéril (ddHH₂O) o realizar la flotación con sacarosa. Mantenga las muestras de gusanos continuamente en hielo.

Protocolo de lisis ultrasónica de C. elegans

• Asegúrese de preparar el ultrasonicador por adelantado para que el homogeneizador ultrasónico esté listo para su uso (sonda montada, programa de sonicación preestablecido).

Si su ultrasonicador está montado sobre un soporte, coloque el baño de hielo con los tubos de muestra debajo de la sonda ultrasónica e inserte la sonda ultrasónica en el tubo de 1,5 ml.

• Para la lisis de C. elegans con el UP200St o el UP200Ht, la ultrasonicación debe realizarse con una micropunta (por ejemplo, la sonda S26d2 de 2 mm; véase la imagen de la izquierda) a una amplitud del 40% durante 1 segundo con pausas de 30 segundos entre cada ciclo. 5 ciclos de sonicación por cada 1 segundo con pausas de 30 segundos son ideales para la lisis de C. elegans. Si realiza la lisis por primera vez, puede comprobar la progresión de la lisis en pequeñas alícuotas de la muestra después de cada pulso utilizando un microscopio.
• La lisis se completa con éxito cuando se rompen los gusanos. La sobre-sonicación provoca la rotura de los núcleos y se hace visible cuando la muestra se vuelve viscosa o se forma espuma. Para evitar la degradación de la muestra, utilice más pulsos si es necesario. No aumente el tiempo de cada ciclo de pulsos ultrasónicos para obtener extractos de proteínas de alta calidad.
• Limpiar el lisado celular centrifugando los gusanos lisados por ultrasonidos a 14.000rpm durante 10min a 4ºC.
• A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y prepárelo para la inmunoprecipitación u otros ensayos.

Nota para el tampón de homogeneización: Prepare el tampón de homogeneización para el protocolo de lisis ultrasónica anterior de la siguiente manera:

Lisis de alto rendimiento de C. elegans en placas de 96 pocillos con el sonicador de placas UIP400MTP

C. elegans Lisis (nematodos adultos)
UIP400MTP 80% amplitud, 20 ciclos (cada ciclo de sonicación: 30 seg ON, 30 seg OFF)
Tampón de lisis:

• Opción 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opción 2) para Co-inmunoprecipitación (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cóctel completo de inhibidores de proteinasas)

Fragmentación de ADN de alto rendimiento
C. elegans (nematodos adultos) ADN 200-300bp: UIP400MTP sonicador de placas – ajuste 80% amplitud, 30impulsos – cada 30seg encendido, 30seg apagado

El sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento sonicará uniformemente las muestras en placas multipocillo, placas microtiter y placas de 96 pocillos.

Lisis ultrasónica de C. elegans para ensayos cuantitativos de purificación por afinidad

Los embriones de C. elegans (∼2 millones por réplica) se recolectaron frescos por triplicado biológico blanqueando hermafroditas grávidas jóvenes y se sonicaron en hielo (ciclo: 0,5 s, amplitud: 40-45%, 5 golpes/sesión, 5 sesiones, intervalo entre sesiones: 30 s; Procesador ultrasónico UP200S con microtip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) en tampón de lisis (volumen total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% de glicerol, mezcla de inhibidores de proteasas, 0,1% de Nonidet P-40 Substitute). Tras la sonicación, se añadió Nonidet P-40 Substitute hasta el 1% y los lisados se incubaron con rotación cabeza-cola a 4 °C durante 30 min, seguido de centrifugación a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C. A continuación, se aspiró el lisado aclarado sin alterar la capa lipídica superior y se dividió por la mitad en las perlas de agarosa anti-GFP o en las perlas de control bloqueadas (40-50 μl). Tras la rotación de cabeza sobre cola a 4 °C durante 60-90 min, las perlas se lavaron una vez con tampón de lisis que contenía 0,1% de Nonidet P-40 Substitute, seguido de dos lavados en tampón I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o tampón II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o ambos. Para los pull-downs de GFP:MBK-2, se realizaron dos experimentos distintos utilizando diferentes condiciones de lavado. Las proteínas se eluyeron mediante agitación orbital en 50 μl de 6 m de urea/2 M de tiourea a temperatura ambiente. Para los experimentos de pull-down de MBK-1::GFP, las proteínas se eluyeron dos veces por agitación en 50μl de 8 m de cloruro de guanidinio a 90°C, seguido de precipitación con etanol. A continuación, las muestras de proteínas eluidas se digirieron en solución.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogeneización y lisis de lombrices por ultrasonidos

Para la lisis de C.elegans y el procedimiento de extracción de proteínas, se recogieron 30.000 nematodos del estadio correspondiente por muestra y se lavaron en S-basal helado, se concentraron por centrifugación a 1.500 rpm durante 2 minutos, se lavaron seis veces con S-basal helado para eliminar las bacterias residuales y se almacenaron en hielo hasta que estuvieron listos para su uso. Para la extracción de proteínas, se dejó que los gusanos grávido-adultos formaran un pellet compacto tras el último lavado con S-basal. A continuación, los pellets de gusanos se resuspendieron en 1 ml de tampón de extracción helado [20 mM de fosfato potásico, pH 7,4, 2mM de EDTA, 1% de Triton-X-100, inhibidores de proteasa (Sigma P2714)] y se procesaron inmediatamente.
∼30.000 gusanos grávidos-adultos (correspondientes a ∼100 mg de peso húmedo), se sonicaron en hielo utilizando un ultrasonicador de tipo sonda (por ejemplo, UP50H con microtip MS2) a una amplitud del 40% durante 10 ciclos de 3 s encendido, 30 s apagado, en 1 ml de tampón de extracción helado. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extracción ultrasónica de lípidos de C. elegans

En la lipidómica, una rama de la metabolómica, se caracteriza y analiza el complemento lipídico de los sistemas biológicos. Los C. elegans se utilizan ampliamente en lipidómica para investigar la interacción de los lípidos metabólicos y sus efectos en la salud y la esperanza de vida.
La lisis y extracción por ultrasonidos se utiliza para liberar lípidos como los esfingolípidos de embriones, larvas y gusanos adultos de C. elegans. La ultrasonicación se utiliza para preparar homogeneizados de gusanos y, posteriormente, extraer los lípidos de la muestra.
Protocolo para la extracción ultrasónica de lípidos de C. elegans
Descongelar el sedimento de C. elegans en hielo y resuspenderlo con 0,5 ml de agua ultracongelada. Sonicar las muestras de C. elegans en tubos de ensayo de 1,5 ml, manteniendo las muestras continuamente en hielo.
La sonicación puede llevarse a cabo utilizando una sonda ultrasónica como la UP200Htla unidad de preparación de muestras por ultrasonidos VialTweeter (sonicación simultánea de 10 muestras) o la UIP400MTP (para la sonicación de placas multipocillos como las de 96 pocillos).Para la lisis ultrasónica con el UP200Ht utilice la micro-punta S26d2. Preajuste el modo de ciclo ultrasónico en el menú digital. Ajuste la amplitud al 10% y el modo de ciclo de sonicación de pulsos de 2 seg. de 20 ciclos con una pausa de 30 seg. entre cada ráfaga de pulsación ultrasónica.
Transferir los sobrenadantes a tubos de vidrio con tapón de rosca. Realice la extracción Folch añadiendo 1 ml de agua ultracongelada a cada tubo de vidrio, seguido de la adición de 6 ml de mezcla de cloroformo/metanol (proporción = 2:1) a cada tubo de vidrio.
Vortex cada tubo de vidrio durante 30 seg durante 4 veces. Centrifugar los tubos a 1.258 x g durante 15 min (Eppendorf, 5810 R) para mejorar aún más la separación de fases. Transferir la fracción hidrófoba inferior a un tubo de vidrio limpio con una pipeta Pasteur de vidrio. Secar la fracción hidrófoba inferior bajo flujo de nitrógeno en un evaporador de nitrógeno. Almacenar el pellet seco en un congelador a -80 °C hasta su uso.

Preparación ultrasónica de lisados de lombriz

Lisado de gusanos: Se cosecharon gusanos de estadio L4 y se lavaron tres veces con tampón M9 (42,26 mM Na₂HPO₄22,04 mM KH₂PO₄85,56 mM NaCl y 0,87 mM MgSO₄) para eliminar todas las bacterias. Tras eliminar la mayor cantidad posible de tampón M9, los gusanos se resuspendieron en tampón de lisis: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfato β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoruro sódico, 1 mM ortovanadato sódico, 5 mM pirofosfato sódico, 0,2 mM fenilmetanosulfonilfluoruro e inhibidor de proteasas. Las lombrices se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron a 37 °C durante tres veces; a continuación, las lombrices se sonicaron en hielo seco con una unidad ultrasónica VialTweeter para la preparación simultánea de 10 tubos de muestras. La sonicación se realizó al 50% de amplitud en 10 ciclos de 2 seg. con 30 seg. de pausa entre las ráfagas de sonicación. Después, las muestras se centrifugaron a 12000 rpm a 4°C durante 15 min. Se recogió el sobrenadante y se almacenó a -70°C. Se utilizó una alícuota para la cuantificación de proteínas mediante el ensayo de Bradford.
Determinación del glutatión total, GSH y GSSG: Para la cuantificación del glutatión, los lisados y la determinación se realizaron el mismo día. Las larvas L4 alimentadas con glucosa y las de control se cosecharon y lavaron con tampón M9 tres veces. Tras eliminar todo el tampón M9 posible, los gusanos se resuspendieron en ácido metafosfórico helado (5% p/v) y, a continuación, se sonicaron en hielo con un VialTweeter ultrasónico al 50% de amplitud en diez ciclos de sonicación de 2 seg. con 30 seg. de pausa entre cada ciclo. Después, se centrifugaron a 12000 rpm a 4 ̊C durante 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparación de muestras de C. elegans antes de la inmunoprecipitación y Western Blotting

En resumen, para los extractos embrionarios, las larvas L1 de C. elegans crecieron en cultivos de medio S líquido a gran escala hasta la edad adulta. Los embriones se recogieron utilizando el método estándar de blanqueamiento y se suspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Cóctel inhibidor de proteasas y 1􏰅 Cóctel inhibidor de fosfatasas I y II), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se lisaron mediante disrupción celular por ultrasonidos utilizando un ultrasonicador con microtip como el UP200Ht con S26d2 durante 10 impulsos a lo largo de 10 s con una amplitud del 30%. Si se debe preparar un número mayor de muestras, el ultrasonido VialTweeter o el MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP para placas de pocillos. Tras la sonicación, los extractos se preclarificaron mediante centrifugación a 30.000 g durante 20 minutos a 4 °C. El extracto preclarificado (300 µg de proteína total) se incubó con de anti-CDC-25.1. El extracto previamente aclarado (300µg de proteína total) se incubó con 40µ􏰂g de anticuerpo anti-CDC-25.1 purificado por afinidad (este estudio) reticulado a proteína A-agarosa, o como control, se utilizó una cantidad similar de inmunoglobulina (Ig)G de conejo reticulada a proteína A-agarosa en un volumen total de 200µl de tampón de lisis que contenía un 1% de NP-40, cuya inclusión reducía la unión inespecífica de las proteínas a la matriz. Las muestras se rotaron durante 1 h a 4°C, las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis, y se eluyeron con 30µl de glicina/HCl y 200 mM NaCl, pH 2,2. Tras la inmunoprecipitación, los eluidos se diluyeron en 30µ􏰂l de tampón de muestra SDS, se calentaron a 95°C durante 4 min y, normalmente, el 3% del total para la entrada y el 30% para los eluidos se aplicaron a SDS-PAGE seguido de Western blotting con anticuerpos anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) o anti-􏰁β-actina (1:2000). Cuando los extractos no se sometieron a inmunoprecipitación, la misma cantidad de proteína total derivada de dichos extractos se resuspendió en tampón de muestra SDS, se calentó a 95°C y, a continuación, se aplicó directamente a SDS-PAGE y se analizó mediante Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Lisis ultrasónica con control preciso de la temperatura

El control preciso y fiable de la temperatura es crucial a la hora de manipular muestras biológicas. Las altas temperaturas inician la degradación de proteínas inducida térmicamente en las muestras.
Como todas las técnicas mecánicas de preparación de muestras, la sonicación genera calor. Sin embargo, la temperatura de las muestras puede controlarse bien cuando se utiliza el VialTweeter. Le presentamos varias opciones para supervisar y controlar la temperatura de sus muestras mientras las prepara con el VialTweeter y la VialPress para su análisis.

1. Control de la temperatura de la muestra: El procesador ultrasónico UP200St, que acciona el VialTweeter, está equipado con un software inteligente y un sensor de temperatura enchufable. Conecte el sensor de temperatura al UP200St e inserte la punta del sensor de temperatura en uno de los tubos de muestra. A través de la pantalla táctil digital en color, puede establecer en el menú del UP200St un rango de temperatura específico para la sonicación de su muestra. El ultrasonicador se detendrá automáticamente cuando se alcance la temperatura máxima y hará una pausa hasta que la temperatura de la muestra descienda hasta el valor inferior del ∆ de temperatura establecido. A continuación, la sonicación se reinicia automáticamente. Esta función inteligente evita la degradación inducida por el calor.
2. El bloque VialTweeter puede ser pre-enfriado. Colocar el bloque VialTweeter (¡sólo el sonotrodo sin transductor!) en el frigorífico o congelador para preenfriar el bloque de titanio ayuda a posponer el aumento de temperatura en la muestra. Si es posible, también se puede preenfriar la propia muestra.
3. Utilice hielo seco para enfriar durante la sonicación. Utilice una bandeja poco profunda llena de hielo seco y coloque el VialTweeter sobre el hielo seco para que el calor pueda disiparse rápidamente.

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Hielscher Ultrasonics es un experimentado fabricante de disruptores celulares y homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para laboratorios y sistemas de sobremesa y a escala industrial. El tamaño de su cultivo de células bacterianas, su objetivo de investigación o producción y el volumen de células a procesar por hora o día son factores esenciales para encontrar el disruptor celular ultrasónico adecuado para su aplicación.
Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para la sonicación simultánea de múltiples muestras (hasta 10 viales), así como muestras masivas (es decir, placas de microtitulación / placas de 96 pocillos), el clásico ultrasonicador de laboratorio tipo sonda con diferentes niveles de potencia de 50 a 400 vatios hasta procesadores ultrasónicos totalmente industriales con hasta 16.000 vatios por unidad para la disrupción celular comercial y la extracción de proteínas en grandes producciones. Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para funcionar a plena carga las 24 horas del día, los 7 días de la semana y los 365 días del año. La robustez y la fiabilidad son características esenciales de nuestros dispositivos ultrasónicos.
Todos los homogeneizadores ultrasónicos digitales están equipados con software inteligente, pantalla táctil de color y protocolling automático de datos, que hacen que el dispositivo ultrasónico en una herramienta de trabajo conveniente en las instalaciones de laboratorio y de producción.
Díganos qué tipo de células, qué volumen, con qué frecuencia y con qué objetivo tiene que procesar sus muestras biológicas. Le recomendaremos el disruptor celular ultrasónico más adecuado para los requisitos de su proceso.

La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sistemas ultrasónicos, desde homogeneizadores manuales compactos y ultrasonidos multimuestra hasta procesadores ultrasónicos industriales para aplicaciones comerciales: