Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos

  • La extracción de proteínas es un paso esencial en la preparación de muestras en proteómica.
  • Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos.
  • La sonicación es un método confiable y eficiente de extracción de proteínas que proporciona altos rendimientos de proteínas en un tiempo de extracción corto.

Extracción de proteínas

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es una etapa esencial de preparación de la muestra que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometría de masas, o purificación de proteínas. Ultrasónico Alteración celular, lisis y extracción. Es una técnica precisamente controlable para asegurar altos rendimientos de proteínas.

Extracción de proteínas de tejido animal.

Para la preparación de tejido de tamaño completo (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido se debe diseccionar en trozos muy pequeños con herramientas limpias, preferiblemente en hielo, y lo más rápido posible para evitar la degradación por proteasas (por ejemplo, tampón de lisis, como RIPA o tampón de lisis hipotónico que contiene proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa). Después de la disección, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para congelación rápida. La muestra puede almacenarse a -80 ° C para su uso posterior o conservarse en hielo para una homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción ultrasónica, se agrega rápidamente al tampón de muestra el tampón de lisis enfriado con hielo (con inhibidores de la proteasa DTT, leupeptina y aprotinina) (se recomiendan por aproximadamente 10 mg de tejido aproximadamente ~ 600 μL de tampón). Aprox. Se recomiendan 20-60 mg de tejido por tubo de muestra.
La homogeneización ultrasónica, la lisis y la extracción se realizan con un homogeneizador ultrasónico como el UP200Ht o UP200St, equipado con un microtodo sonotrodo. La duración de la sonicación es de 60-90 seg. en un modo de ciclo ultrasónico de 15 seg. Sonicación y 10 seg. Tiempo de descanso. La muestra debe mantenerse en hielo todo el tiempo.
Después de la homogeneización / extracción ultrasónica, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aprox. 20 minutos. Posteriormente, se recoge el sobrenadante, de modo que la concentración de proteína se puede determinar mediante un ensayo de proteínas como el ensayo de proteínas Pierce BCA.

La sonicación es un método importante para la preparación de muestras

Homogeneizador de tejidos por ultrasonidos UP200St

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Extracción de proteínas del suero sanguíneo

Para una mezcla homogénea del suero y el tampón de fosfato, la muestra se agita en vórtex antes de la lisis celular ultrasónica. Para la lisis ultrasónica, la muestra se sonica con un homogeneizador de laboratorio ultrasónico como el UP100H para 8 ciclos a 20% de amplitud, para ciclos de cada 5 segundos encendidos y 15 segundos apagados. La colocación se realiza mediante sonicación en ciclos y colocando la muestra en hielo para evitar el sobrecalentamiento y la degradación térmica de la muestra. Dado que el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (como la albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, inmunoglobulina G e inmunoglobulina A), que interfieren con la separación de proteínas de bajo peso molecular durante la IEF, se recomienda agotarlas. del suero usando una columna de agotamiento.

Extracción de proteínas de tejido vegetal.

El tejido vegetal fresco y suave, por ejemplo, musgo, etc., se puede romper fácilmente simplemente colocando el material de la muestra picada en tampón de lisis para la sonicación. Los tejidos vegetales ligeros y resistentes, como las semillas, las agujas de abeto, etc., deben secarse en el suelo. Algunos materiales vegetales duros y leñosos deben congelarse y molerse en nitrógeno líquido antes de extraerlos por sonicación. Para las suspensiones de cultivos celulares de plantas, un tratamiento ultrasónico entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis es en su mayoría suficiente. Los materiales más duros, como las semillas de calabaza, requieren una sonicación más intensa como se describe a continuación.

Protocolo para la extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza.

Homogeneizador ultrasónico de tejidos UP400St con S24d40 - para extracción de proteínas de tejidos vegetales y animales (haga clic para ampliar)Para la extracción ultrasónica de proteínas de la albúmina del polvo de semilla de calabaza molida fina, se añaden 10 g de polvo de semilla de calabaza desgrasado y 100 ml de agua desionizada como disolvente en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml. La extracción de proteínas consta de dos pasos: primero, la muestra se trata con un ultrasonizador tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) con sonotrodo montado S24d7. El vaso de vidrio se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El ajuste del ultrasonicador. UP400St con el sensor de temperatura enchufable se aseguró de que la temperatura de la muestra siempre se mantenga por debajo de 30 ° C. Por el control preciso de la temperatura durante la sonicación, se evita la desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, la extracción se realizó con un mezclador a una velocidad de 200 rpm y a 30 ° C. Después el vaso se transfiere a un agitador termostático. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Después de la eliminación de globulina, se puede tomar una muestra del extracto de proteína para determinar el perfil de albúmina y posteriormente se ajusta a pI = 3.0 utilizando HCl 0.1 M para la coagulación de la albúmina. La fase sólida se separa por centrifugación a 5000 g, 20 ° C y se redisuelve en agua desionizada. La coagulación de albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteínas en el concentrado de albúmina.

La extracción ultrasónica de proteínas alcalinas para la preparación de concentrado de proteínas a partir de salvado de arroz muestra que el tratamiento ultrasónico produce un mayor rendimiento de proteínas en un tiempo de extracción significativamente más corto – En comparación con los métodos de extracción convencionales.

Dispositivo ultrasónico VialTweeter para la extracción de proteínas de muestras de tejido (haga clic para ampliar)

VialTweeter para la sonicación indirecta.

Ventajas

  • Rápido
  • Altos rendimientos
  • Altamente eficiente
  • Control preciso sobre los parámetros.
  • Resultados reproducibles
  • Escalabilidad lineal

Protocolo de preparación de muestras para la enzima iNOS funcional.

Para obtener la enzima iNOS completamente funcional (por ejemplo, para la selección de medicamentos), se recomienda el siguiente protocolo: la suspensión celular se debe colocar en hielo y sonicar con una UP100H a 10µm de amplitud en modo ciclo de 5 seg. Sonicación y 25 seg. descansa en el hielo. El procedimiento debe repetirse aprox. 3 veces. El tiempo de reposo entre los ciclos de sonicación reduce el aumento de temperatura y, por lo tanto, reducirá el riesgo de desnaturalización.

Solubilización ultrasónica de proteínas

La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de proteínas, que generalmente requiere varias horas. Para no sobrecalentar la muestra y prevenir la degradación de proteínas y las modificaciones en soluciones que contienen urea, las explosiones ultrasónicas no deben durar más de unos pocos segundos.

Instrucciones generales

Control de temperatura: Para garantizar un alto rendimiento proteico sin desnaturalización térmica, se debe controlar la temperatura durante la extracción. Homogeneizadores ultrasónicos de vanguardia de Hielscher – También llamado desintegrador ultrasónico o sonificador. – son precisamente controlables. Vienen con un sensor de temperatura enchufable. En las opciones de configuración del homogeneizador ultrasónico, se puede configurar una temperatura máxima. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, el ultrasonizador se detiene automáticamente hasta que la muestra se haya enfriado.
Buffer: La elección de un tampón adecuado y el volumen correcto de tampón varía de tejido a tejido y se debe descubrir mediante pruebas de prueba y error.
Aislamiento / purificación: Los lisados de proteínas pueden contener un exceso de biomoléculas, como el ADN o los carbohidratos, que pueden eliminarse mediante precipitación de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) o intercambio de tampón.

Chittapalo y Noomhorm (2009) informaron que el rendimiento de la proteína aumentó con la sonicación y que la homogeneización del tejido ultrasónico y el proceso de lisis pueden mejorar significativamente los procesos de extracción existentes. – permitiendo nuevas oportunidades de extracción comercial.

Sound protection with Hielscher's sound enclosure SPB-L and ultrasonic device UP200St. (Click to enlarge!)

Homogeneizador de tejidos por ultrasonidos UP200St para una eficiente extracción de proteínas

Control preciso del tratamiento ultrasónico (¡haga clic para ampliar!)

Control del navegador para una operación precisa y monitoreo del proceso de sonicación.

Equipos de ultrasonidos para extracción de proteínas.

Hielscher Ultrasonics ofrece una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
Los ultrasonizadores de laboratorio de Hielscher son potentes y fáciles de operar. Diseñados para funcionar las 24 horas, todos los días de la semana, están diseñados como dispositivos de laboratorio y de mesa robustos y eficientes. Para todos los dispositivos, la salida de energía y la amplitud se pueden controlar con precisión. La amplia gama de accesorios abre más opciones de configuración. Los dispositivos digitales como VialTweeter, UP200Ht, UP200Sty UP400St tiene un control de temperatura integrado y una tarjeta SD incorporada para el registro automático de datos.
Para la sonicación indirecta, sin contaminación cruzada y simultánea de múltiples muestras, ofrecemos el VialTweeter o la fabricación de Cuphorn ultrasónico.
Dependiendo de su aplicación, material y volumen de muestra, le recomendaremos la configuración más adecuada para su preparación de muestra. ¡Póngase en contacto con nosotros hoy!

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Literatura/Referencias

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Extracción alcalina asistida por ultrasonidos de proteínas del salvado de arroz desgrasado y propiedades de los concentrados de proteínas. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
  • Simões, André ES :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofía E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Recuperación eficiente de proteínas de muestras de múltiples fuentes después de la extracción de ARN de Trizol o Trizol LS y almacenamiento a largo plazo. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Información interesante

Proteomica

La proteómica es el campo de investigación que investiga las proteínas y el proteoma. Las proteínas cumplen una amplia gama de funciones vitales dentro de los organismos. El proteoma es el conjunto completo de proteínas expresadas por un genoma, célula, tejido u organismo en un momento determinado. El proteoma varía con el tiempo y los distintos requisitos, o tensiones, que sufre una célula u organismo. Más específicamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo dado de célula u organismo, en un momento dado, en condiciones definidas. El término es una mezcla de proteínas y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.

Proteína

Las proteínas son grandes biomoléculas, llamadas macromoléculas. – que se componen de una o más cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos de origen tanto vegetal como animal y son cruciales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que las proteínas contienen una gran cantidad de información biológica, se extraen para fines analíticos, por ejemplo, para investigación proteómica. La función más importante realizada por las proteínas incluye la catálisis de las reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a los estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas difieren entre sí principalmente en su secuencia de aminoácidos, que está dictada por la secuencia de nucleótidos de sus genes, y que generalmente resulta en el plegamiento de proteínas en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son – además de péptidos – Uno de los componentes clave de los alimentos. Por lo tanto, la proteómica es una herramienta poderosa en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, la seguridad alimentaria y la evaluación nutricional.

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es el método principal para la separación y análisis de macromoléculas como el ADN, ARN y proteínas, así como sus fragmentos, según su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga y / o tamaño (agarosa IEF, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica, biología molecular y proteómica para separar una población mixta de ADN y fragmentos de ARN por longitud, para estimar el tamaño del ADN. y fragmentos de ARN o para separar proteínas por carga.

Culturas celulares

El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado mediante el cual las células se cultivan en condiciones controladas. Las condiciones del cultivo celular varían para cada tipo de célula. En general, el entorno de un cultivo celular consiste en un recipiente adecuado (por ejemplo, placa de Petri) con sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO).2O2), y regula el entorno físico-químico (pH buffer, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan un sustrato superficial o artificial, mientras que otros cultivos celulares se pueden cultivar flotando libremente en el medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión celular).
Los cultivos masivos de líneas celulares animales se utilizan en la producción industrial de vacunas virales y otros productos derivados de la biotecnología. Las células madre humanas se cultivan para expandir el número de células y diferenciarlas en varios tipos de células somáticas para fines de trasplante.

Muestras de tejido

El término tejido describe un intermedio celular, donde el material celular está en un nivel organizativo entre las células y un órgano completo. En el tejido, se ensamblan células similares, del mismo origen que juntas realizan una función específica. Por la agrupación funcional de múltiples tejidos, se forman las estructuras complejas de los órganos.
El tejido se muestrea para la investigación en biología, histología / histopatología, parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, así como para cultivar y extraer ADN. Se puede distinguir entre animal (subdivisión: tejido de mamífero) y tejido vegetal. Los tejidos animales se agrupan en los cuatro tipos básicos de tejido conjuntivo, muscular, nervioso y epitelial. El tejido de la planta se subdivide en los siguientes tres sistemas de tejido: la epidermis, el tejido del suelo y el tejido vascular.
Las muestras de tejido pueden prepararse a partir de partes de animales o plantas, por ejemplo, huesos, músculos, hojas, etc.

Fluidos corporales

La sangre, el suero, el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la saliva y el líquido sinovial son líquidos corporales, que ofrecen una gran fuente de información relevante para el diagnóstico. Por lo tanto, una preparación sofisticada de muestras de fluidos corporales para el análisis es importante. La primera dificultad está asociada con el amplio rango dinámico de componentes presentes en los fluidos corporales.

Determinación de la concentración de proteínas.

El ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) son ensayos comunes para determinar la concentración de proteínas. La albúmina sérica bovina (BSA) es una de las proteínas estándar más utilizadas.

Tampón de lisis

El tampón de lisis debe elegirse de acuerdo con el material o tejido celular (cultivo de tejidos, plantas, bacterias, hongos, etc.), y si las células están en una estructura y el tipo de estructura. Una amplia gama de tampones de lisis para la extracción de proteínas, membranas y orgánulos se formulan con uno o más detergentes. El detergente generalmente se selecciona mediante pruebas de prueba y error o – si está disponible – Según un protocolo de extracción de proteínas existente. El detergente debe ser compatible con la fuente de tejido y las proteínas. En general, el detergente más suave que funciona para un tejido / proteína específico, se elige para mantener la máxima funcionalidad del extracto. Además, en el caso de una extracción de membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. Los detergentes comúnmente utilizados en los tampones de lisis son en su mayoría no iónicos o zwitteriónicos, por ejemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40 y Tween 20.
Por ejemplo, los tejidos como el cerebro, el hígado, el intestino, el riñón, el bazo, etc. pueden ser simplemente tamponados con RIPA – sin embargo, deben incluirse inhibidores de la proteasa y DTT (por ejemplo, para electroforesis en gel).
Tampón de lisis para tejido muscular esquelético (frío hielo): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 10% (p / v), EDTA 1 mM , Ditiotreitol 1 mM suplementado con cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa
Tabla de tampones comunes y su rango de pH. En general, estos tampones se usan normalmente en concentraciones de 20-50 mM.

Buffer rango de pH
Ácido cítrico – NaOH 2.2 – 6.5
Citrato de sodio – ácido cítrico 3.0 – 6.2
Acetato de sodio – ácido acético 3.6 – 5.6
Sal sódica del ácido cocodílico – HCl 5,0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Dihidrógeno fosfato de sodio – fosfato de hidrógeno disódico 5.8 – 8.0
Imidazol – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Clorhidrato de trietanolamina – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricina – NaOH 7.6 – 8.6
Tetraborato sódico – ácido bórico 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glicina – NaOH 8.6 – 10.6

La mayoría de los tampones muestran una dependencia del pH con la temperatura. Esto es especialmente cierto para los buffers de Tris. El pKa cambia de 8.06 a 25 ° C a 8.85 a 0 ° C.
(pH y pKa de un tampón: el pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa. pKa (= constante de disociación ácida) es una medida relacionada, pero más específica, ya que ayuda a predecir cómo actuará una molécula a un nivel específico). valor de pH.)

TRIZOL

TRIzol es una solución química que se utiliza para extraer ARN / ADN / proteína durante la extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El uso de la extracción con TRIzol asistida por ultrasonidos da como resultado un alto rendimiento de ADN, ARN y proteínas de la misma muestra y sobresale por lo tanto en otros métodos de extracción.