Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos

  • La extracción de proteínas es un paso de preparación de muestras esencial en la proteómica.
  • Las proteínas pueden ser extraídos de plantas y animales de tejido, levaduras y microorganismos.
  • La sonicación es un método fiable, eficiente extracción de proteína que da altos rendimientos de proteínas dentro de un tiempo de extracción corto.

La extracción de proteínas

La extracción de proteínas a partir de tejidos y células cultivadas es un paso de preparación de muestras esencial que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas tales como ELISA, PAGE, Western Blot, Espectrometría de masas, o la purificación de proteínas. Ultrasónico disrupción celular, lisis y extracción es una técnica controlable con precisión para asegurar altos rendimientos de proteínas.

La extracción de proteínas a partir de tejido animal

Para la preparación de tejido de tamaño completo (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido debe disecarse en piezas muy pequeñas con herramientas limpias, preferiblemente en hielo, y lo más rápido posible para evitar la degradación por proteasas (por ej. tampón de lisis tal como RIPA o tampón de lisis hipotónico que contiene un cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa). Después de la disección, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para congelar rápidamente. La muestra puede almacenarse a -80 ° C para su uso posterior o mantenerse en hielo para su homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción ultrasónica, se agrega rápidamente tampón de lisis helado (con inhibidores de la proteasa DTT, leupeptina y aprotinina) en el tubo de muestra (se recomiendan aproximadamente ~ 10 mg de tejido aproximadamente ~ 600 μL de tampón). Aprox. Se recomiendan 20-60 mg de tejido por tubo de muestra.
homogeneización por ultrasonidos, la lisis y la extracción se realiza con un homogeneizador ultrasónico como el UP200Ht o UP200St, Equipado con un sonotrodo de micro-punta. duración de la sonicación es de 60-90 seg. en un modo de ciclo de ultrasonidos de 15 seg. sonicación y 10 seg. Tiempo de descanso. La muestra debe mantenerse en hielo todo el tiempo.
Después de ultrasonidos homogeneización / extracción, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aprox. 20 minutos. Después se recoge el sobrenadante, de modo que la concentración de proteína se puede determinar por un ensayo de proteína tales como Pierce BCA ensayo de proteínas.

La sonicación es un método importante para la preparación de muestras

homogeneizador de tejido ultrasónico UP200St

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La extracción de proteínas de suero de la sangre

Para una mezcla homogénea de suero y tampón de fosfato, la muestra se agita en vórtex antes de la lisis celular ultrasónica. Para la lisis ultrasónica, la muestra se somete a ultrasonidos con un homogeneizador de laboratorio ultrasónico tal como UP100H para 8 ciclos a 20% de amplitud, para ciclos de cada 5 segundos encendido y 15 segundos apagado. Sonocation se lleva a cabo por sonicationg en ciclos y colocando la muestra en hielo de manera que se evita un sobrecalentamiento y la degradación térmica de la muestra. Desde el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (tales como albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulin, inmunoglobulina G y la inmunoglobulina A), que interfieren con la separación de proteínas de bajo peso molecular durante la IEF, se recomienda para agotar ellos a partir del suero utilizando una columna de agotamiento.

La extracción de proteínas a partir de tejido de la planta

Fresh, tejido vegetal suave, por ejemplo, musgo etc., puede ser fácilmente alterado simplemente colocando el material de muestra picado en tampón de lisis para la sonicación. Tough, tejidos vegetales ligenous, tales como semillas, abeto agujas etc., deben ser molidos en seco. Algunos, materiales de plantas leñosas duro debe ser congeladas y suelo en nitrógeno líquido antes de extraerse por sonicación. Para las suspensiones de cultivo de célula de planta, un tratamiento ultrasónico entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis es sobre todo suficiente. el material más duro tal como semillas de calabaza requiere una sonicación más intensa como se describe a continuación.

Protocolo para la extracción por ultrasonidos de la albúmina a partir de semillas de calabaza

homogeneizador de tejidos por ultrasonidos UP400St con S24d40 - para la extracción de proteínas de plantas y tejidos animales (Haga clic para agrandar!)Para la extracción de proteínas de ultrasonidos de la albúmina a partir de polvo de semilla de calabaza molido fino, se añaden 10 g de polvo de semilla de calabaza desgrasada y 100 ml de agua desionizada como disolvente en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml. La extracción de la proteína consiste en dos pasos: En primer lugar, la muestra se somete a sonicación con un ultrasonicador de tipo sonda UP400St (400W, 24 kHz) con sonotrodo montado S24d7. El vaso de precipitados de vidrio se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El ajuste de la ultrasonicador UP400St con el sensor de temperatura enchufable asegura que la temperatura de la muestra siempre se mantenga por debajo de 30 ° C. Mediante el control preciso de la temperatura durante la sonicación, se evita una desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, la extracción se realizó con un mezclador a velocidad de 200 rpm y a 30 ° C. Después, el vaso se transfiere a un agitador termostático. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Después de la eliminación de globulina, se puede tomar una muestra del extracto de proteína para la determinación del perfil de albúmina y posteriormente se ajusta a pI = 3,0 usando HCl 0,1 M para la coagulación de albúmina. La fase sólida se separa por centrifugación a 5000 g, 20 ° C y se redisuelve en agua desionizada. La coagulación de albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteína en el concentrado de albúmina.

Ultrasonic extracción de proteína alcalina para la preparación de concentrado de proteína del salvado de arroz muestra que los resultados del tratamiento de ultrasonidos en un mayor rendimiento de proteínas en un tiempo de extracción significativamente más corto – en comparación con los métodos de extracción convencionales.

VialTweeter dispositivo ultrasónico para la extracción de proteínas a partir de muestras de tejido (Haga clic para agrandar!)

VialTweeter para la sonicación indirecta.

Ventajas

  • Rápido
  • Altos rendimientos
  • Altamente eficiente
  • El control preciso de los parámetros
  • resultados reproducibles
  • Escalabilidad lineal

protocolo de preparación de muestras para la enzima funcional iNOS

Para obtener la enzima plenamente funcional iNOS (por ejemplo, para la detección de drogas), se recomienda el siguiente protocolo: La suspensión de células se debe colocar en hielo y se somete a ultrasonidos con una UP100H en amplitud 10! m en modo de ciclo de 5 seg. sonicación y 25 seg. descansar sobre hielo. El procedimiento debe repetirse aprox. 3 veces. El tiempo de reposo entre ciclos de sonicación reduce el aumento de temperatura y por lo tanto reducir el riesgo de desnaturalización.

La solubilización de proteínas ultrasónica

La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de proteínas, que normalmente requiere varias horas. Con el fin de no sobrecalentar la muestra y evitar la degradación de proteínas y las modificaciones en soluciones que contienen urea, las ráfagas de ultrasonidos no deben durar más que unos segundos.

Instrucciones generales

Control de temperatura: Para asegurar un alto rendimiento de proteína sin desnaturalización térmica, la temperatura durante la extracción debe ser controlado. homogeneizadores ultrasónicos estado-de-arte de Hielscher – también llamado desintegrador ultrasónico o sonificator – son precisamente controlable. Vienen con un sensor de temperatura enchufable. En las opciones de configuración del homogeneizador de ultrasonidos, una temperatura máxima se puede ajustar. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, la ultrasonicador se para automáticamente hasta que la muestra se haya enfriado.
Buffer: La elección de un tampón adecuado y el volumen correcto de tampón varía de un tejido a otro y debe ser calculado de salida mediante pruebas de ensayo y error.
Aislamiento / purificación: Proteína lisados ​​pueden contener un exceso de biomoléculas tales como ADN o hidratos de carbono, que se pueden eliminar por precipitación de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) o intercambio de tampón.

Chittapalo y Noomhorm (2009) informaron de que el rendimiento de proteína aumentó usando sonicación y que el proceso de homogeneización del tejido y la lisis por ultrasonidos puede mejorar los procesos de extracción existentes significativamente – propicio para nuevas oportunidades comerciales de extracción.

Sound protection with Hielscher's sound enclosure SPB-L and ultrasonic device UP200St. (Click to enlarge!)

homogeneizador de tejido ultrasónico UP200St para la extracción de proteínas eficiente

El control preciso del tratamiento ultrasónico (Haga clic para agrandar!)

control de explorador para un funcionamiento preciso y el seguimiento del proceso de sonicación

Equipo ultrasónico para la extracción de proteínas

Hielscher Ultrasonidos ofrecen una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
ultrasonicators laboratorio Hielscher son de gran alcance y fácil de operar. Construida para la operación 24/7, que están diseñados como dispositivos de laboratorio y de sobremesa robustos y eficientes. Para todos los dispositivos, la producción de energía y la amplitud pueden ser controlados con precisión. La amplia gama de accesorios abre nuevas opciones de configuración. Los dispositivos digitales, tales como VialTweeter, UP200Ht, UP200Sty UP400St tener un control de temperatura integrado y un incorporado en la tarjeta SD para la grabación automática de datos.
Para la indirecta, la contaminación cruzada libre y sonicación simultáneo de múltiples muestras, ofrecemos la VialTweeter o la fabricación de cuphorn ultrasónica.
Dependiendo de la aplicación, el material y volumen de la muestra, vamos a recomendar que la configuración más adecuada para su preparación de muestras. ¡Póngase en contacto con nosotros hoy!

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Literatura/Referencias

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): ultrasónico asistido extracción con álcali de la proteína a partir de salvado de arroz desengrasado y propiedades de los concentrados de proteína. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofía E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): recuperación eficiente de proteínas a partir de múltiples muestras de origen después de Trizol o Trizol LS extracción de RNA y almacenamiento a largo plazo. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Información interesante

proteómica

La proteómica es el campo de la investigación que investiga las proteínas y el proteoma. Las proteínas respetara una amplia gama de funciones vitales dentro de los organismos. El proteoma es todo el conjunto de proteínas expresadas por un genoma, célula, tejido u organismo en un momento determinado. El proteoma varía con los requisitos de tiempo y distintas, o tensiones, que una célula u organismo sufre. Más específicamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo dado de célula u organismo, en un momento dado, en condiciones definidas. El término es una mezcla de proteínas y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.

Proteína

Las proteínas son biomoléculas son grandes, denominadas macromoléculas – que están compuestos de una o más cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos de origen vegetal y animal y son cruciales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que las proteínas contienen mucha información biológica, se extraen con fines analíticos, por ejemplo, para investigación proteómica. La función más importante realizada por las proteínas incluye la catálisis de las reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas difieren entre sí principalmente en su secuencia de aminoácidos, que está dictada por la secuencia de nucleótidos de sus genes, y que generalmente da como resultado el plegamiento de proteínas en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son – Además de los péptidos – uno de los componentes clave de los alimentos. Por lo tanto, la proteómica es una herramienta poderosa en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, seguridad de los alimentos y evaluación nutricional.

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es el principal método para la separación y el análisis de macromoléculas tales como ADN, ARN y proteínas, así como sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en la química clínica para separar proteínas por la carga y / o tamaño (IEF de agarosa, esencialmente tamaño independiente) y en bioquímica, biología molecular y la proteómica para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por la longitud, para estimar el tamaño de DNA y fragmentos de ARN o para separar proteínas por la carga.

Culturas celulares

El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado mediante el cual las células se cultivan bajo condiciones controladas. condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. En general, el medio ambiente de un cultivo celular consiste en un recipiente adecuado (por ejemplo placa de Petri) con sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas, y los gases (CO2, El2), Y regula el entorno físico-químico (tampón de pH, la presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan una superficie o sustrato artificial, mientras que otros cultivos de células pueden ser cultivadas libre flotando en medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión de células).
cultivos en masa de líneas de células de animales se utilizan en la producción industrial de vacunas virales y otros productos biotecnológicamente derivados. Las células madre humanas se cultivan para expandir el número de células y diferenciar las células en diversos tipos de células somáticas con fines de trasplante.

Las muestras de tejido

El término tejido describe un intermedio celular, en el que el material celular está en un nivel de organización entre las células y un órgano completo. En el tejido, células similares, del mismo origen que juntos llevar a cabo una función específica, se ensamblan. Por el agrupamiento funcional de múltiples tejidos, se forman las estructuras complejas de órganos.
El tejido se tomaron muestras para la investigación en biología, histología / histopatología, parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, así como para cultivar y extraer el ADN. Se puede distinguir entre el animal (subdivisión: tejido de mamífero) y tejido de la planta. Los tejidos animales se agrupan en los cuatro tipos básicos de conectivo, muscular, nervioso y tejido epitelial. El tejido vegetal se subdivide en los siguientes tres sistemas de tejidos: la epidermis, el tejido del suelo, y el tejido vascular.
Las muestras de tejido se pueden preparar a partir de partes de animales o plantas, por ejemplo hueso, músculo, hojas, etc.

Fluidos corporales

Sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva y líquido sinovial son fluidos corporales, que ofrecen una gran fuente de información relevante para el diagnóstico. Por lo tanto, una preparación sofisticada de muestras de fluidos corporales para el análisis es importante. La primera dificultad se asocia con el amplio rango dinámico de los componentes presentes en los fluidos corporales.

Determinación de la concentración de proteínas

ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) son ensayos comunes para determinar la concentración de proteínas. albúmina de suero bovino (BSA) es uno de los estándar de proteína más frecuentemente utilizado.

Tampón de lisis

tampón de lisis debe ser elegido de acuerdo con el material celular o tejido (cultivo de tejidos, planta, bacteria, hongos, etc.), y si las células están en una estructura y el tipo de estructura. Una amplia gama de lisis amortigua para la extracción de proteínas, membranas y orgánulos se formulan con uno o más detergentes. El detergente se selecciona normalmente a través de pruebas de ensayo y error o – si está disponible – de acuerdo con un protocolo de extracción de proteína existente. El detergente debe ser compatible con la fuente de tejido y las proteínas. En general, el detergente más suave que funciona para un tejido / proteína específica, se elige con el fin de mantener la funcionalidad máxima del extracto. Además, en caso de una extracción de las membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. detergentes utilizados comúnmente en tampones de lisis son en su mayoría no iónico o zwitteriónico, por ejemplo CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40, y Tween 20.
Por ejemplo, tejidos tales como cerebro, hígado, intestino, riñón, bazo, etc. pueden ser simplemente tamponado con RIPA – sin embargo inhibidores de proteasa y DTT (por ejemplo, para electroforesis en gel) deben ser incluidos.
tampón de lisis para el tejido muscular esquelético (frío hielo): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 1% de Triton (w / v) de glicerol, mM EDTA X-100, 10% 1 , 1 mM ditiotreitol suplementado con proteasa e inhibidor de fosfatasa cóctel
Tabla de tampones comunes y su intervalo de pH. En general, estos tampones se utilizan normalmente en concentraciones de 20-50 mM.

Bufferintervalo de pH
Ácido cítrico – NaOH2.2 – 6.5
Citrato de sodio – ácido cítrico3.0 – 6.2
Acetato de sodio – ácido acético3.6 – 5.6
sal de sodio de ácido cacodílico – HCl5,0 – 7.4
MI – NaOH5.6 – 6.8
De sodio dihidrógeno fosfato – hidrógeno fosfato disódico5.8 – 8.0
imidazol – HCl6.2 – 7.8
MOPS – KOH6.6 – 7.8
clorhidrato de trietanolamina – NaOH6.8 – 8.8
Tris – HCl7.0 – 9.0
HEPES – NaOH7.2 – 8.2
tricina – NaOH7.6 – 8.6
Tetraborato sódico – ácido bórico7.6 – 9.2
bicina – NaOH7.7 – 8.9
glicina – NaOH8.6 – 10.6

La mayoría de los tampones muestran un pH-dependencia con la temperatura. Esto es especialmente cierto para los tampones Tris. El pKa cambia de 8,06 a 25 ° C a 8,85 a 0 ° C.
(PH y pKa de un tampón: pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa pKa (= constante de disociación ácida) es una medida relacionada, pero más específica, en que ayuda a predecir cómo una molécula actuará a una específica. valor de pH).

TRIzol

TRIzol es una solución de producto químico utilizado para extraer el ARN / ADN / proteína durante la extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El uso de la asistida por ultrasonidos de extracción resultados TRIzol en alta DNA, RNA, y rendimientos de proteína de la misma muestra y sobresale de este modo otros métodos de extracción.