Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos

  • La extracción de proteínas es un paso esencial en la preparación de muestras en proteómica.
  • Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos.
  • La sonicación es un método de extracción de proteínas confiable y eficiente que proporciona altos rendimientos de proteína dentro de un corto tiempo de extracción.

Extracción de proteínas

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es una etapa esencial de preparación de muestras que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas tales como ELISA, PAGE, Western blot, Espectrometría de masas o purificación de proteínas. Ultrasónico Disrupción celular, lisis y extracción Es una técnica controlable con precisión para asegurar altos rendimientos de proteínas.

Extracción de proteínas de tejidos animales

Para la preparación de tejido de tamaño entero (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido debe ser disecado en trozos muy pequeños con herramientas limpias, sobre hielo preferiblemente y lo más rápidamente posible para evitar la degradación por proteasas (por ejemplo, Tampón de lisis tal como RIPA o tampón de lisis hipotónico que contiene coadyuvante de proteasa y inhibidor de fosfatasa). Después de disecar, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para congelación rápida. La muestra puede almacenarse a -80 ° C para su uso posterior o mantenerse en hielo para homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción por ultrasonidos, se agrega rápidamente un tampón de lisis helado (con inhibidores de la proteasa DTT, leupeptina y aprotinina) en el tubo de muestra (se recomiendan aproximadamente ~ 10 mg de tejido aproximadamente 600 μl de tampón). Aprox. Se recomienda 20-60 mg de tejido por tubo de muestra.
La homogeneización ultrasónica, la lisis y la extracción se realizan con un homogeneizador ultrasónico tal como el UP200Ht o UP200St, Equipado con un sonotrodo de micro-punta. La duración de la sonicación es 60-90 seg. En un modo de ciclo ultrasónico de 15 seg. Sonicación y 10 seg. Tiempo de descanso. La muestra debe mantenerse en hielo todo el tiempo.
Después de la homogeneización / extracción ultrasónica, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aprox. 20 minutos. Posteriormente se recoge el sobrenadante, de modo que la concentración de proteína puede determinarse mediante un ensayo de proteínas tal como el ensayo de proteína Pierce BCA.

La sonicación es un método importante para la preparación de muestras

Homogenizador de tejido ultrasónico UP200St

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Extracción de proteínas del suero sanguíneo

Para una mezcla homogénea de suero y tampón de fosfato, la muestra se somete a vórtice primero antes de la lisis de células ultrasónicas. Para la lisis ultrasónica, la muestra se somete a ultrasonidos con un homogeneizador ultrasónico de laboratorio, tal como el UP100H Para 8 ciclos a 20% de amplitud, para ciclos de cada 5 segundos encendido y 15 segundos apagado. La sonocación se lleva a cabo por sonicación en ciclos y colocando la muestra sobre hielo de manera que se evita el sobrecalentamiento y la degradación térmica de la muestra. Dado que el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (tales como albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, inmunoglobulina G e inmunoglobulina A), que interfieren con la separación de proteínas de bajo peso molecular durante el IEF, se recomienda su agotamiento A partir del suero utilizando una columna de agotamiento.

Extracción de proteínas del tejido vegetal

Los tejidos vegetales frescos y blandos, por ejemplo musgo, etc., pueden ser fácilmente alterados simplemente colocando el material de muestra cortado en tampón de lisis para sonicación. Los tejidos vegetales resistentes, tales como semillas, agujas de abeto, etc., deben secarse al suelo. Algunos materiales vegetales duros y leñosos deben congelarse y triturarse en nitrógeno líquido antes de ser extraídos mediante sonicación. Para suspensiones de cultivo de células vegetales, en su mayor parte es suficiente un tratamiento ultrasónico entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis. Un material más duro como las semillas de calabaza requiere una sonicación más intensa como se describe a continuación.

Protocolo para la extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza

Homogenizador de tejidos ultrasónicos UP400St con S24d40 - para la extracción de proteínas de tejido vegetal y animal (Click to enlarge!)Para la extracción ultrasónica de proteínas de la albúmina a partir de polvo de semilla de calabaza fina, se añaden 10 g de polvo de semilla de calabaza desgrasada y 100 ml de agua desionizada como disolvente en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml. La extracción de proteínas consiste en dos etapas: Primero, la muestra es sonicada con un ultrasonido tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) Con sonotrodo montado S24d7. El vaso de vidrio se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El ajuste del ultrasonido UP400St Con el sensor de temperatura enchufable aseguró que la temperatura de la muestra se mantenga siempre por debajo de 30 ° C. Mediante el control preciso de la temperatura durante la sonicación, se evita una desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, la extracción se realizó con un mezclador a 200 rpm de velocidad ya 30ºC. Posteriormente, el vaso de precipitados se transfiere a un agitador termostático. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Después de la eliminación de la globulina, el extracto de proteína se puede muestrear para la determinación del perfil de albúmina y se ajusta posteriormente a pI = 3,0 usando HCl 0,1 M para la coagulación de albúmina. La fase sólida se separa por centrifugación a 5000 g, 20 ◦ C y se redisuelve en agua desionizada. La coagulación de albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteína en el concentrado de albúmina.

La extracción ultrasónica de proteína alcalina para la preparación de concentrado de proteína a partir de salvado de arroz muestra que el tratamiento con ultrasonidos da como resultado un mayor rendimiento proteico en un tiempo de extracción significativamente más corto – En comparación con los métodos convencionales de extracción.

Dispositivo ultrasónico VialTweeter para la extracción de proteínas de muestras de tejidos (Click to enlarge!)

VialTweeter para la sonicación indirecta.

Ventajas

  • Rápido
  • Altos rendimientos
  • Altamente eficiente
  • Control preciso de los parámetros
  • Resultados reproducibles
  • Escalabilidad lineal

Protocolo de preparación de muestras para la enzima funcional iNOS

Para obtener la enzima iNOS completamente funcional (por ejemplo, para la detección de fármacos), se recomienda el siguiente protocolo: La suspensión celular debe colocarse sobre hielo y sonicar con un UP100H A una amplitud de 10 μm en el modo de ciclo de 5 seg. Sonicación y 25 seg. Descansar en el hielo. El procedimiento debe repetirse aprox. 3 veces. El tiempo de reposo entre ciclos de sonicación reduce el aumento de temperatura y por lo tanto reduce el riesgo de desnaturalización.

Solubilización de Proteínas Ultrasónicas

La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de las proteínas, que normalmente requiere varias horas. Con el fin de no sobrecalentar la muestra y evitar la degradación de las proteínas y las modificaciones en las soluciones que contienen urea, las ráfagas de ultrasonidos no debe durar más de pocos segundos.

Instrucciones generales

Control de temperatura: Para asegurar un alto rendimiento proteico sin desnaturalización térmica, la temperatura durante la extracción debe ser controlada. Los homogeneizadores ultrasónicos de última generación de Hielscher – También llamado disgregador ultrasónico o sonificador – Son precisamente controlables. Vienen con un sensor de temperatura enchufable. En las opciones de ajuste del homogeneizador ultrasónico, se puede ajustar una temperatura máxima. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, el ultrasonido se detiene automáticamente hasta que la muestra se ha enfriado.
Buffer: La elección de un tampón adecuado y el volumen adecuado de tampón varía de tejido a tejido y debe ser descubierto mediante pruebas de ensayo y error.
Aislamiento / purificación: Los lisados ​​de proteínas pueden contener un exceso de biomoléculas tales como ADN o carbohidratos, que pueden eliminarse mediante precipitación de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) o intercambio de tampón.

Chittapalo y Noomhorm (2009) informaron que el rendimiento de proteína aumentó usando sonicación y que el proceso de homogeneización y lisis de tejido ultrasónico puede mejorar significativamente los procesos de extracción existentes – Permitiendo nuevas oportunidades de extracción comercial.

Sound protection with Hielscher's sound enclosure SPB-L and ultrasonic device UP200St. (Click to enlarge!)

Homogenizador de tejido ultrasónico UP200St Para la extracción eficiente de proteínas

Control preciso del tratamiento ultrasónico (Click to enlarge!)

Control del navegador para una operación precisa y monitoreo del proceso de sonicación

Equipo ultrasónico para la extracción de proteínas

Hielscher Ultrasonics ofrece una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
Los ultrasonitores de laboratorio Hielscher son potentes y fáciles de manejar. Construido para la operación 24/7, se diseñan como dispositivos robustos y eficientes del laboratorio y del bench-top. Para todos los dispositivos, la salida de energía y la amplitud pueden ser controlados con precisión. La amplia gama de accesorios Abre otras opciones de configuración. Los dispositivos digitales como VialTweeter, UP200Ht, UP200Sty UP400St Tienen un control de temperatura integrado y una tarjeta SD integrada para la grabación automática de datos.
Para la sonicación indirecta, sin contaminación cruzada y simultánea de múltiples muestras, ofrecemos la VialTweeter o la fabricación de Cuphorn ultrasónico.
Dependiendo de su aplicación, material y volumen de muestra, le recomendaremos la configuración más adecuada para su preparación de muestra. ¡Póngase en contacto con nosotros hoy!

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Literatura/Referencias

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Extracción de álcalis asistidos por ultrasonidos de proteína de salvado de arroz desgrasado y propiedades de los concentrados de proteínas. Int J Food Sci Technol 44: 1843 - 1849.
  • Simões, André ES :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Recuperación eficiente de proteínas de muestras de múltiples fuentes después de la extracción de ARN trizol o trizol LS y almacenamiento a largo plazo. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Información interesante

Proteómica

La proteómica es el campo de investigación que investiga las proteínas y el proteoma. Las proteínas llenan una amplia gama de funciones vitales dentro de los organismos. El proteoma es el conjunto completo de proteínas expresadas por un genoma, célula, tejido o organismo en un momento determinado. El proteoma varía con el tiempo y los distintos requisitos, o subraya, que sufre una célula o organismo. Más específicamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo dado de célula u organismo, en un momento dado, bajo condiciones definidas. El término es una mezcla de proteínas y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.

Proteína

Las proteínas son grandes biomoléculas, las llamadas macromoléculas – Que se componen de una o más cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos de origen vegetal y animal y son cruciales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que las proteínas contienen una gran cantidad de información biológica, se extraen con fines analíticos, por ejemplo, para la investigación proteómica. La función más importante desempeñada por las proteínas incluye la catálisis de las reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a los estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas difieren entre sí principalmente en su secuencia de aminoácidos, que está dictada por la secuencia de nucleótidos de sus genes, y que generalmente resulta en plegamiento de proteínas en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son – Además de péptidos – Uno de los componentes clave de los alimentos. Por lo tanto, la proteómica es una herramienta poderosa en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, la inocuidad de los alimentos y la evaluación nutricional.

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es el método principal para la separación y análisis de macromoléculas tales como ADN, ARN y proteínas, así como sus fragmentos, basándose en su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga y / o tamaño (IEF agarosa, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica, biología molecular y proteómica para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, para estimar el tamaño del ADN Y fragmentos de ARN o para separar las proteínas por carga.

Culturas celulares

El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado mediante el cual las células se cultivan bajo condiciones controladas. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. En general, el medio ambiente de un cultivo de células consiste en un recipiente adecuado (por ejemplo, placa de Petri) con sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases2O2), Y regula el medio físico-químico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan un sustrato superficial o artificial, mientras que otros cultivos celulares pueden cultivarse flotando libremente en medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión celular).
Los cultivos en masa de líneas celulares animales se usan en la producción industrial de vacunas virales y otros productos derivados de la biotecnología. Las células madre humanas se cultivan para expandir el número de células y diferenciar las células en diversos tipos de células somáticas para propósitos de trasplante.

Muestras de tejido

El término tejido describe un intermedio celular, donde el material celular está a nivel organizativo entre células y un órgano completo. En el tejido, se ensamblan células similares, del mismo origen que llevan a cabo una función específica. Mediante el agrupamiento funcional de múltiples tejidos, se forman las estructuras complejas de los órganos.
El tejido es muestreado para la investigación en biología, histología / histopatología, parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, así como para cultivar y extraer el ADN. Se puede distinguir entre animales (subdivisión: tejido mamífero) y tejido vegetal. Los tejidos animales se agrupan en los cuatro tipos básicos de tejido conectivo, muscular, nervioso y epitelial. El tejido vegetal se subdivide en los tres sistemas de tejidos siguientes: la epidermis, el tejido molido y el tejido vascular.
Las muestras de tejidos pueden prepararse a partir de partes animales o vegetales, por ejemplo hueso, músculo, hojas, etc.

Fluidos corporales

La sangre, el suero, el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la saliva y el líquido sinovial son fluidos corporales, que ofrecen una gran fuente de información diagnósticamente relevante. Por lo tanto, una preparación sofisticada de muestras de fluidos corporales para el análisis es importante. La primera dificultad se asocia con el amplio rango dinámico de los componentes presentes en los fluidos corporales.

Determinación de la concentración de proteínas

El ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) son ensayos comunes para determinar la concentración de proteínas. La albúmina de suero bovino (BSA) es uno de los patrones de proteína más utilizados.

Lysis Buffer

El tampón de lisis debe elegirse de acuerdo con el material celular o tejido (cultivo de tejidos, plantas, bacterias, hongos, etc.) y si las células están en una estructura y el tipo de estructura. Una amplia gama de tampones de lisis para la extracción de proteínas, membranas y organelos se formulan con uno o más detergentes. El detergente se suele seleccionar mediante pruebas de ensayo y error o – si está disponible – De acuerdo con un protocolo de extracción de proteínas existente. El detergente debe ser compatible con la fuente de tejido y las proteínas. En general, se elige el detergente más suave que funciona para un tejido / proteína específico, con el fin de mantener la máxima funcionalidad del extracto. Además, en el caso de una extracción de membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. Los detergentes comúnmente usados ​​en tampones de lisis son en su mayor parte no iónicos o zwitteriónicos, por ejemplo CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40 y Tween 20.
Por ejemplo, tejidos tales como cerebro, hígado, intestino, riñón, bazo, etc. pueden ser simplemente tamponados con RIPA – Sin embargo, los inhibidores de la proteasa y la DTT (por ejemplo, para la electroforesis en gel) deben ser incluidos.
Tampón de lisis para el tejido del músculo esquelético (helado): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 10% (p / v), EDTA 1 mM , Ditiotreitol 1 mM suplementado con cóctel de proteasa y inhibidor de fosfatasa
Tabla de tampones comunes y su rango de pH. En general, estos tampones se usan normalmente a concentraciones de 20-50 mM.

BufferRango de pH
Ácido cítrico – NaOH2.2 – 6.5
Citrato de sodio – ácido cítrico3,0 – 6,2
Acetato de sodio – ácido acético3.6 – 5,6
Sal sódica de ácido cacódico – HCl5,0 – 7,4
MES – NaOH5,6 – 6,8
Dihidrogenofosfato sódico – Hidrógeno fosfato disódico5,8 – 8,0
Imidazol – HCl6,2 – 7,8
MOPS – KOH6,6 – 7,8
Clorhidrato de trietanolamina – NaOH6,8 – 8,8
Tris – HCl7,0 – 9,0
HEPES – NaOH7,2 – 8,2
Tricina – NaOH7,6 – 8,6
Tetraborato de sodio – ácido bórico7,6 – 9,2
Bicine – NaOH7,7 – 8,9
Glicina – NaOH8,6 – 10,6

La mayoría de los tampones muestran una dependencia del pH con la temperatura. Esto es especialmente cierto para los tampones Tris. El pKa cambia de 8,06 a 25 ° C a 8,85 a 0 ° C.
(PH y pKa de un tampón: el pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa, pKa (= constante de disociación de ácido) es una medida relacionada, pero más específica, ya que ayuda a predecir cómo una molécula actuará en una forma específica valor del PH.)

TRIzol

TRIzol es una solución química utilizada para extraer ARN / ADN / proteína durante la extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El uso de la extracción con TRIzol asistida por ultrasonidos da como resultado altos rendimientos de ADN, ARN y proteína de la misma muestra y sobresale por lo tanto otros métodos de extracción.