Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos

  • La extracción de proteínas es un paso esencial en la preparación de muestras en la proteómica.
  • Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos.
  • La sonicación es un método de extracción de proteínas fiable y eficiente que proporciona un alto rendimiento proteínico en un tiempo de extracción corto.

Extracción de proteínas

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es un paso esencial en la preparación de la muestra que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas como ELISA, PAGE, Western blottingla espectrometría de masas o la purificación de proteínas. Ultrasonido disrupción celular, lisis y extracción es una técnica precisamente controlable para asegurar un alto rendimiento de proteínas.

Extracción de proteínas del tejido animal

Para la preparación de tejidos de tamaño completo (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido debe diseccionarse en trozos muy pequeños con herramientas limpias, preferiblemente en hielo y lo más rápidamente posible para evitar su degradación por las proteasas (por ejemplo, tampón de lisis como el RIPA o tampón de lisis hipotónico que contiene proteasa y cóctel de inhibidores de la fosfatasa). Después de la disección, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para su congelación. La muestra puede almacenarse a -80°C para su posterior uso o conservarse en hielo para su homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción ultrasónica, se añade rápidamente al tubo de muestra un tampón para lisis en frío (con inhibidores de la proteasa DTT, leupeptina y aprotinina) (por cada ~10 mg de tejido se recomienda aprox. ~600 μL de tampón). Se recomienda aproximadamente 20-60mg de tejido por tubo de muestra.
La homogeneización, lisis y extracción ultrasónica se realiza con un homogeneizador ultrasónico como el UP200Ht o UP200Stequipado con un sonotrodo de micro puntas. La duración de la sonicación es de 60-90 seg. en un modo de ciclo ultrasónico de 15 seg. de sonicación y 10 seg. de tiempo de reposo. La muestra debe mantenerse en hielo todo el tiempo.
Después de la homogeneización/extracción ultrasónica, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aprox. 20 min. Después se recoge el sobrenadante, de modo que la concentración de proteínas puede determinarse mediante un ensayo de proteínas como el ensayo de proteínas Pierce BCA.

La sonicación es un método importante para la preparación de muestras

Homogeneizador ultrasónico de tejidos UP200St

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Extracción de proteínas del suero sanguíneo

Para obtener una mezcla homogénea del suero y el tampón fosfato, la muestra se vorea primero antes de la lisis celular ultrasónica. Para la lisis ultrasónica, la muestra se sondea con un homogeneizador ultrasónico de laboratorio como el UP100H para 8 ciclos al 20% de amplitud, para ciclos de cada 5 segundos de encendido y 15 segundos de apagado. La sonocación se realiza por sonicación en ciclos y colocando la muestra en hielo para evitar el sobrecalentamiento y la degradación térmica de la muestra. Dado que el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (como albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, inmunoglobulina G e inmunoglobulina A), que interfieren con la separación de las proteínas de bajo peso molecular durante el FEI, se recomienda eliminarlas del suero utilizando una columna de reducción.

Extracción de proteínas del tejido vegetal

Los tejidos frescos y blandos de las plantas, como por ejemplo musgo, etc., pueden ser fácilmente alterados simplemente colocando el material de la muestra picado en un tampón de lisis para su sonicación. Los tejidos vegetales duros y ligeros, como semillas, agujas de abeto, etc., deben secarse con la tierra. Algunos materiales de plantas duras y leñosas deben ser congelados y molidos en nitrógeno líquido antes de ser extraídos por sonicación. Para suspensiones de cultivos celulares de plantas, un tratamiento ultrasónico entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis es en su mayor parte suficiente. Los materiales más resistentes, como las semillas de calabaza, requieren una sonicación más intensa, como se describe a continuación.

Protocolo para la extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza

Homogeneizador ultrasónico de tejidos UP400St con S24d40 - para la extracción de proteínas de tejidos vegetales y animales (Haga clic para ampliar!)Para la extracción ultrasónica de proteínas de albúmina de polvo de semilla de calabaza molido fino, se añaden 10 g de polvo de semilla de calabaza desgrasado y 100 ml de agua desionizada como disolvente en un vaso de vidrio de 250 ml. La extracción de la proteína consiste en dos pasos: Primero, la muestra es sondeada con un ultrasonido tipo sonda. UP400St (400W, 24kHz) con sonotrodo S24d7 montado. El vaso de precipitados se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El ajuste del ultrasonido UP400St con el sensor de temperatura enchufable se asegura de que la temperatura de la muestra se mantenga siempre por debajo de 30°C. Gracias al control preciso de la temperatura durante la sonicación, se evita la desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, la extracción se realizó con un mezclador a 200 rpm y a 30°C. A continuación, el vaso se transfiere a un agitador termostático. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Después de la extracción de la globulina, el extracto de la proteína puede ser muestreado para la determinación del perfil de la albúmina y es posteriormente ajustado a pI=3.0 usando 0.1 M HCl para la coagulación de la albúmina. La fase sólida se separa por centrifugación a 5000g, 20°C y se vuelve a disolver en agua desionizada. La coagulación de albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteínas en el concentrado de albúmina.

La extracción alcalina ultrasónica de proteínas para la preparación de concentrado proteico a partir de salvado de arroz muestra que el tratamiento ultrasónico da como resultado un mayor rendimiento proteico en un tiempo de extracción significativamente más corto. – en comparación con los métodos de extracción convencionales.

Dispositivo ultrasónico VialTweeter para la extracción de proteínas de muestras de tejido (Click para ampliar)

VialTweeter para la sonicación indirecta.

Ventajas

  • Rápido
  • rendimientos elevados
  • muy eficiente
  • Control preciso de los parámetros
  • resultados reproducibles
  • Escalabilidad lineal

Protocolo de preparación de muestras para la enzima funcional iNOS

Para obtener una enzima iNOS totalmente funcional (por ejemplo, para la detección de drogas), se recomienda el siguiente protocolo: La suspensión celular debe colocarse sobre hielo y sonicarse con una UP100H a una amplitud de 10 µm en modo de ciclo de 5 seg. de sonicación y 25 seg. de reposo en hielo. El procedimiento debe repetirse aprox. 3 veces. El tiempo de reposo entre los ciclos de sonicación reduce el aumento de la temperatura y, por lo tanto, reduce el riesgo de desnaturalización.

Solubilización Ultrasónica de Proteínas

La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de la proteína, que generalmente requiere varias horas. Para no sobrecalentar la muestra y evitar la degradación de las proteínas y las modificaciones en soluciones que contengan urea, las ráfagas ultrasónicas no deben durar más de unos segundos.

Instrucciones generales

Control de temperatura: Para asegurar un alto rendimiento proteico sin desnaturalización térmica, se debe controlar la temperatura durante la extracción. Homogeneizadores ultrasónicos de última generación de Hielscher – también llamado desintegrador ultrasónico o sonificador – son precisamente controlables. Vienen con un sensor de temperatura enchufable. En las opciones de configuración del homogeneizador ultrasónico se puede ajustar una temperatura máxima. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, el ultrasonido se detiene automáticamente hasta que la muestra se haya enfriado.
Buffer: La elección de un tampón adecuado y el volumen correcto de tampón varía de un tejido a otro y se debe determinar mediante pruebas de ensayo y error.
Aislamiento / purificación: Los lisados de proteínas pueden contener un exceso de biomoléculas como el ADN o los carbohidratos, que pueden eliminarse mediante la precipitación de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) o el intercambio de tampón.

Chittapalo y Noomhorm (2009) informaron que el rendimiento proteínico aumentó usando sonicación y que el proceso de homogeneización y lisis del tejido ultrasónico puede mejorar significativamente los procesos de extracción existentes. – permitiendo nuevas oportunidades de extracción comercial.

Sound protection with Hielscher's sound enclosure SPB-L and ultrasonic device UP200St. (Click to enlarge!)

Homogeneizador ultrasónico de tejidos UP200St para una extracción eficiente de proteínas

Control preciso del tratamiento ultrasónico (¡haga clic para ampliar!)

Control por navegador para un funcionamiento preciso y supervisión del proceso de sonicación

Equipo de ultrasonido para la extracción de proteínas

Hielscher Ultrasonics ofrece una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
Los ultrasonidos de laboratorio de Hielscher son potentes y fáciles de manejar. Construidos para funcionar las 24 horas del día, los 7 días de la semana, están diseñados como dispositivos robustos y eficientes de laboratorio y sobremesa. Para todos los dispositivos, la salida de energía y la amplitud pueden ser controladas con precisión. La amplia gama de accesorios abre más opciones de configuración. Los dispositivos digitales como VialTweeter, UP200Ht, UP200Sty UP400St disponen de un control de temperatura integrado y de una tarjeta SD integrada para el registro automático de datos.
Para la sonificación indirecta, sin contaminación cruzada y simultánea de múltiples muestras, ofrecemos el método VialTweeter o la fabricación de CupHorn ultrasónico.
Dependiendo de su aplicación, material y volumen de muestra, le recomendaremos la configuración más adecuada para su preparación de muestras. Contáctenos hoy mismo!

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Literatura/Referencias

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Extracción alcalina asistida por ultrasonidos de la proteína del salvado de arroz desgrasado y de las propiedades de los concentrados de proteínas. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Recuperación eficiente de proteínas de muestras de múltiples fuentes después de la extracción y almacenamiento a largo plazo del ARN trizol o trizol LS. BMC Genomics 2013, 14:181.


Información interesante

Proteómica

La proteómica es el campo de investigación que investiga las proteínas y el proteoma. Las proteínas cumplen una amplia gama de funciones vitales dentro de los organismos. El proteoma es el conjunto completo de proteínas expresadas por un genoma, célula, tejido u organismo en un momento dado. El proteoma varía con el tiempo y los distintos requerimientos, o estrés, que sufre una célula u organismo. Más específicamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo dado de célula u organismo, en un momento dado, bajo condiciones definidas. El término es una mezcla de proteínas y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.

Proteína

Las proteínas son grandes biomoléculas, las llamadas macromoléculas. – que se componen de una o más cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos de origen vegetal y animal y son cruciales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que las proteínas contienen mucha información biológica, se extraen con fines analíticos, por ejemplo, para la investigación proteómica. La función más importante que desempeñan las proteínas es la catálisis de las reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a los estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas se diferencian entre sí principalmente en su secuencia de aminoácidos, la cual es dictada por la secuencia de nucleótidos de sus genes, y que usualmente resulta en el plegamiento de la proteína en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son – además de los péptidos – uno de los componentes clave de los alimentos. Por lo tanto, la proteómica es una herramienta poderosa en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, la seguridad alimentaria y la evaluación nutricional.

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es el principal método de separación y análisis de macromoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas, así como de sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga y/o tamaño (agarosa IEF, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica, biología molecular y proteómica para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN y ARN o para separar proteínas por carga.

Cultivos celulares

El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado por el cual las células se cultivan bajo condiciones controladas. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. En general, el medio ambiente de un cultivo celular consiste en un vaso adecuado (por ejemplo, una placa de Petri) con sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO2, O2), y regula el ambiente fisicoquímico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan una superficie o sustrato artificial, mientras que otros cultivos celulares pueden ser cultivados flotando libremente en el medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión celular).
Los cultivos en masa de líneas celulares animales se utilizan en la producción industrial de vacunas virales y otros productos derivados de la biotecnología. Las células madre humanas se cultivan para expandir el número de células y diferenciarlas en varios tipos de células somáticas con fines de trasplante.

Muestras de tejido

El término tejido describe un intermediario celular, en el que el material celular se encuentra a nivel organizativo entre las células y un órgano completo. En el tejido, se ensamblan células similares, del mismo origen, que juntas desempeñan una función específica. Mediante la agrupación funcional de múltiples tejidos, se forman las complejas estructuras de los órganos.
Se toman muestras de tejido para la investigación en biología, histología/histopatología, parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, así como para cultivar y extraer ADN. Se puede distinguir entre tejido animal (subdivisión: tejido de mamífero) y tejido vegetal. Los tejidos animales se agrupan en los cuatro tipos básicos de tejido conectivo, muscular, nervioso y epitelial. El tejido vegetal se subdivide en los siguientes tres sistemas de tejidos: la epidermis, el tejido del suelo y el tejido vascular.
Las muestras de tejido pueden prepararse a partir de partes de animales o plantas, como huesos, músculos, hojas, etc.

Líquidos corporales

La sangre, el suero, el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la saliva y el líquido sinovial son fluidos corporales que ofrecen una gran fuente de información relevante para el diagnóstico. Por lo tanto, es importante una preparación sofisticada de las muestras de fluidos corporales para el análisis. La primera dificultad está asociada con el amplio rango dinámico de los componentes presentes en los fluidos corporales.

Determinación de la concentración de proteínas

El ensayo de Bradford, el ensayo Lowry y el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) son ensayos comunes para determinar la concentración de proteínas. La albúmina sérica bovina (BSA) es uno de los estándares proteicos más utilizados.

Tampón de lisis

El tampón de lisis debe elegirse en función del material o tejido celular (cultivo de tejidos, plantas, bacterias, hongos, etc.), y de si las células están en una estructura y del tipo de estructura. Una amplia gama de tampones de lisis para la extracción de proteínas, membranas y orgánulos están formulados con uno o más detergentes. El detergente suele seleccionarse mediante pruebas de ensayo y error, o bien – si está disponible – de acuerdo con un protocolo de extracción de proteínas existente. El detergente debe ser compatible con la fuente de los tejidos y las proteínas. En general, se elige el detergente más suave que funciona para un tejido/proteína específico, con el fin de mantener la máxima funcionalidad del extracto. Además, en caso de extracción de membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. Los detergentes comúnmente utilizados en los tampones de lisis son en su mayoría no iónicos o zwitteriónicos, por ejemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 y Tween 20.
Por ejemplo, los tejidos como el cerebro, el hígado, el intestino, los riñones, el bazo, etc. pueden protegerse simplemente con RIPA. – sin embargo, deben incluirse los inhibidores de la proteasa y la TDT (por ejemplo, para la electroforesis en gel).
Tampón de lisis para el tejido muscular esquelético (frío glacial): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (p/v) de glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM de ditiotreitol complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa.
Tabla de tampones comunes y su rango de pH. En general, estos tampones se utilizan normalmente a concentraciones de 20-50 mM.

Amortiguador rango de pH
Ácido cítrico – NaOH 2.2 – 6.5
Citrato de sodio – Ácido cítrico 3.0 – 6.2
Acetato de sodio – ácido acético 3.6 – 5.6
Sal sódica del ácido cacodílico – HCl 5,0 – 7.4
EME – NaOH 5.6 – 6.8
Fosfato de dihidrógeno sódico – fosfato de hidrógeno disódico 5.8 – 8.0
Imidazol – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Clorhidrato de trietanolamina – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricina – NaOH 7.6 – 8.6
Tetraborato de sodio – ácido bórico 7.6 – 9.2
Bicina – NaOH 7.7 – 8.9
Glicina – NaOH 8.6 – 10.6

La mayoría de los tampones muestran una dependencia del pH con la temperatura. Esto es especialmente cierto en el caso de los tampones Tris. La pKa cambia de 8,06 a 25°C a 8,85 a 0°C.
(pH y pKa de un tampón: el pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa. pKa (= constante de disociación ácida) es una medida relacionada, pero más específica, ya que ayuda a predecir cómo actuará una molécula a un valor de pH específico.)

TRIzol

TRIzol es una solución química utilizada para extraer ARN/ADN/proteína durante la extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El uso de la extracción TRIzol asistida por ultrasonidos da como resultado un alto rendimiento de ADN, ARN y proteínas de la misma muestra y por lo tanto sobresale en otros métodos de extracción.