Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos
- La extracción de proteínas es un paso esencial de la preparación de muestras en proteómica.
- Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos.
- La sonicación es un método de extracción de proteínas fiable y eficaz que proporciona un alto rendimiento proteínico en un tiempo de extracción corto.
Extracción de proteínas de tejidos y células
La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es un paso esencial de la preparación de muestras que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometría de masas o purificación de proteínas. La disrupción, lisis y extracción celular por ultrasonidos es una técnica no térmica, controlable con precisión, que garantiza un alto rendimiento de proteínas.
Extracción de proteínas de células con el sonda ultrasónica UP200St
- Rápido
- alto rendimiento
- Alta eficiencia
- Control preciso de los parámetros
- resultados reproducibles
- escalabilidad lineal
Instrucciones generales para la lisis ultrasónica y la extracción de proteínas
- Control de temperatura: Para garantizar un alto rendimiento proteínico sin desnaturalización térmica, debe controlarse la temperatura durante la extracción. Los homogeneizadores ultrasónicos de última generación de Hielscher – también llamado desintegrador ultrasónico o ultrasonificador – son controlables con precisión. Disponen de un sensor de temperatura enchufable. En las opciones de ajuste del homogeneizador ultrasónico se puede fijar una temperatura máxima. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, el ultrasonicador se detiene automáticamente hasta que la muestra se haya enfriado.
- Buffer: La elección de un tampón adecuado y del volumen correcto de tampón varía de un tejido a otro y debe determinarse mediante pruebas de ensayo y error.
- Aislamiento / purificación: Los lisados de proteínas pueden contener un exceso de biomoléculas, como ADN o hidratos de carbono, que pueden eliminarse mediante precipitación de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) o intercambio de tampones.
Chittapalo y Noomhorm (2009) informaron en su estudio de que el rendimiento proteico aumentaba utilizando la sonicación y que el proceso de homogeneización y lisis tisular por ultrasonidos puede mejorar significativamente los procesos de extracción existentes. – permitiendo nuevas oportunidades de extracción comercial.
CupHorn ultrasónico para la preparación simultánea y altamente eficaz de múltiples muestras en las mismas condiciones para el aislamiento de proteínas y la fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas de tejidos animales
Para la preparación de tejido de tamaño completo (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido debe diseccionarse en trozos muy pequeños con herramientas limpias, preferiblemente en hielo, y lo más rápidamente posible para evitar la degradación por proteasas (por ejemplo, tampón de lisis como RIPA o tampón de lisis hipotónico que contenga cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas). Tras la disección, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para su congelación instantánea. La muestra puede almacenarse a -80°C para su uso posterior o mantenerse en hielo para su homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción ultrasónica, se añade rápidamente tampón de lisis helado (con inhibidores de proteasa DTT, leupeptina y aprotinina) en el tubo de muestra (por ~10 mg de tejido se recomiendan aproximadamente ~600 μL de tampón). Se recomiendan aproximadamente 20-60 mg de tejido por tubo de muestra.
La homogeneización ultrasónica, la lisis y la extracción se realizan con un homogeneizador ultrasónico como el UP100H o el UP200Ht, equipado con un sonotrodo de micropunta. La duración de la sonicación es de 60-90 seg. en un modo de ciclo ultrasónico de 15 seg. de sonicación y 10 seg. de tiempo de reposo. La muestra debe mantenerse en hielo todo el tiempo.
Tras la homogeneización/extracción por ultrasonidos, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aproximadamente 20 minutos. A continuación se recoge el sobrenadante, para poder determinar la concentración de proteínas mediante un ensayo proteico como el Pierce protein assay BCA.
Extracción de proteínas del suero sanguíneo
Para obtener una mezcla homogénea de suero y tampón fosfato, la muestra se agita primero en un vórtex antes de la lisis celular ultrasónica. Para la lisis ultrasónica, la muestra se sonica con un homogeneizador ultrasónico de laboratorio como el UP100H durante 8 ciclos al 20% de amplitud, por ciclos de cada 5 segundos de encendido y 15 segundos de apagado. La extracción de proteínas se lleva a cabo sonicando en ciclos (modo de pulsación) y colocando la muestra en hielo para evitar el sobrecalentamiento y la degradación térmica de la muestra. Dado que el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (como albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, inmunoglobulina G e inmunoglobulina A), que interfieren con la separación de proteínas de bajo peso molecular durante el IEF, se recomienda eliminarlas del suero utilizando una columna de depleción.
Extracción de proteínas de tejidos vegetales
El tejido vegetal fresco y blando, como el musgo, etc., puede desmenuzarse fácilmente simplemente colocando el material de muestra troceado en tampón de lisis para sonicación. Los tejidos vegetales duros y ligeros, como semillas, agujas de abeto, etc., deben triturarse en seco. Algunos materiales vegetales duros y leñosos deben congelarse y triturarse en nitrógeno líquido antes de la extracción por sonicación. Para las suspensiones de cultivos celulares vegetales, un tratamiento ultrasónico de entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis suele ser suficiente. Los materiales más duros, como las semillas de calabaza, requieren una sonicación más intensa, como se describe a continuación.
Protocolo para la extracción por ultrasonidos de albúmina a partir de semillas de calabaza
Para la extracción proteica por ultrasonidos de albúmina a partir de polvo de semilla de calabaza molido fino, se añaden 10 g de polvo de semilla de calabaza desgrasado y 100 mL de agua desionizada como disolvente en un vaso de precipitados de vidrio de 250 mL. La extracción de proteínas consta de dos pasos: En primer lugar, la muestra se sonicó con un ultrasonicador tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) equipado con un sonotrodo S24d7. El vaso de vidrio se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El sensor de temperatura enchufable y los ajustes de control de temperatura del ultrasonicador UP400St garantizan que la temperatura de la muestra se mantenga siempre por debajo de 30 °C. Gracias al control preciso de la temperatura durante la sonicación, se evita la desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, la extracción se realizó con un mezclador a una velocidad de 200 rpm y a 30°C. A continuación, el vaso se transfiere a un agitador termostático. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Tras la eliminación de la globulina, el extracto proteico puede muestrearse para la determinación del perfil de albúmina y posteriormente se ajusta a pI=3,0 utilizando HCl 0,1 M para la coagulación de la albúmina. La fase sólida se separa por centrifugación a 5000g, 20°C y se redisuelve en agua desionizada. La coagulación de la albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteínas en el concentrado de albúmina.
La extracción alcalina ultrasónica de proteínas para la preparación de concentrado proteico a partir de salvado de arroz demuestra que el tratamiento ultrasónico da lugar a un mayor rendimiento proteico en un tiempo de extracción significativamente más corto. – en comparación con los métodos de extracción convencionales.
Protocolo de preparación de muestras para la enzima iNOS funcional
Para obtener una enzima iNOS completamente funcional (por ejemplo, para el cribado de fármacos), se recomienda el siguiente protocolo: La suspensión celular debe colocarse en hielo y se sonicará con una UP100H a una amplitud de 10µm en un ciclo de 5 seg. de sonicación y 25 seg. de reposo en hielo. El procedimiento debe repetirse unas 3 veces. El tiempo de reposo entre los ciclos de sonicación reduce el aumento de temperatura y, por tanto, el riesgo de desnaturalización.
Solubilización ultrasónica de proteínas
La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de las proteínas, que suele requerir varias horas. Para no sobrecalentar la muestra y evitar la degradación de las proteínas y las modificaciones en las soluciones que contienen urea, las ráfagas ultrasónicas no deben durar más de unos segundos.
Ultrasonidos UP200Ht con microtip S26d2 de 2 mm para la sonicación de muestras pequeñas.
Equipos de ultrasonidos para la extracción de proteínas
Hielscher Ultrasonics ofrece una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
Los ultrasonidos de laboratorio Hielscher son potentes y fáciles de manejar. Diseñados para funcionar las 24 horas del día, los 7 días de la semana, son aparatos de laboratorio y de sobremesa robustos y eficaces. En todos los dispositivos, la salida de energía y la amplitud pueden controlarse con precisión. La amplia gama de accesorios ofrece más opciones de configuración. Los ultrasonicadores digitales como VialTweeter, UP200Ht, UP200St y UP400St tienen un control de temperatura integrado y una tarjeta SD incorporada para el registro automático de datos.
Para la sonicación indirecta, sin contaminación cruzada y simultánea de múltiples muestras, ofrecemos el VialTweeter o el CupHorn ultrasónico.
La tabla siguiente le ofrece una visión general de nuestros ultrasonidos para la preparación de muestras, la disrupción celular y la extracción. Haga clic en el tipo de dispositivo para obtener más información sobre cada homogeneizador ultrasónico. Nuestro personal técnico, bien formado y con una larga experiencia, estará encantado de ayudarle a elegir el ultrasonicador más adecuado para la preparación de sus muestras.
| Volumen del lote | Tasa de flujo | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| hasta 10 viales o tubos | n.a. | VialTweeter |
| placas multipocillo / microtiter | n.a. | UIP400MTP |
| varios tubos / recipientes | n.a. | CupHorn |
| 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. | UP100H |
| De 10 a 1000 ml | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. | UP400St |
En función de su aplicación, material y volumen de muestra, le recomendaremos la configuración más adecuada para la preparación de su muestra. Póngase en contacto con nosotros hoy mismo.
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Los ultrasonidos digitales de Hielscher disponen de un mando a distancia con navegador y protocolización automática de datos en una tarjeta SD integrada.
VialTweeter para la sonicación indirecta.
Información interesante
proteómica
La proteómica es el campo de investigación que estudia las proteínas y el proteoma. Las proteínas desempeñan una amplia gama de funciones vitales en los organismos. El proteoma es el conjunto de proteínas expresadas por un genoma, célula, tejido u organismo en un momento determinado. El proteoma varía en función del tiempo y de los distintos requisitos, o estrés, a los que se somete una célula u organismo. Más concretamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un determinado tipo de célula u organismo, en un momento dado y en condiciones definidas. El término es una mezcla de proteínas y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.
proteína
Las proteínas son grandes biomoléculas, llamadas macromoléculas. – que se componen de una o varias cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos, tanto de origen vegetal como animal, y son cruciales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que las proteínas contienen mucha información biológica, se extraen con fines analíticos, por ejemplo para la investigación proteómica. Entre las funciones más importantes que desempeñan las proteínas se encuentran la catálisis de reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas se diferencian entre sí principalmente por su secuencia de aminoácidos, dictada por la secuencia de nucleótidos de sus genes, y que suele dar lugar al plegamiento de la proteína en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son – además de péptidos – uno de los componentes clave de los alimentos. Por lo tanto, la proteómica es una poderosa herramienta en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, la seguridad alimentaria y la evaluación nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction es un procedimiento preanalítico para separar y preconcentrar analitos. En combinación con la ultrasonicación, la extracción del punto de turbidez puede intensificarse, haciendo que el proceso sea más eficaz, rápido y respetuoso con el medio ambiente. Con ultrasonidos, la extracción del punto de turbidez es un método mucho más eficaz de preparación de analitos. Más información sobre la extracción de puntos nubosos asistida por ultrasonidos.Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es el principal método de separación y análisis de macromoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas, así como de sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga y/o tamaño (agarosa IEF, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica, biología molecular y proteómica para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, estimar el tamaño de los fragmentos de ADN y ARN o separar proteínas por carga.
cultivos celulares
El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado mediante el cual se cultivan células en condiciones controladas. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. En general, el entorno de un cultivo celular consiste en un recipiente adecuado (por ejemplo, una placa de Petri) con sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO2, O2), y regula el entorno fisicoquímico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan un sustrato superficial o artificial, mientras que otros cultivos celulares pueden cultivarse flotando libremente en el medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión celular).
Los cultivos masivos de líneas celulares animales se utilizan en la producción industrial de vacunas víricas y otros productos derivados de la biotecnología. Las células madre humanas se cultivan para ampliar el número de células y diferenciarlas en diversos tipos de células somáticas con fines de trasplante.
Muestras de tejido
El término tejido describe un intermediario celular, en el que el material celular se encuentra en un nivel organizativo intermedio entre las células y un órgano completo. En el tejido se reúnen células similares, del mismo origen, que juntas desempeñan una función específica. Mediante la agrupación funcional de múltiples tejidos se forman las complejas estructuras de los órganos.
Se toman muestras de tejido para la investigación en biología, histología/histopatología, parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, así como para cultivar y extraer ADN. Se puede distinguir entre tejido animal (subdivisión: tejido de mamífero) y tejido vegetal. Los tejidos animales se agrupan en los cuatro tipos básicos de tejido conjuntivo, muscular, nervioso y epitelial. El tejido vegetal se subdivide en los tres sistemas de tejidos siguientes: la epidermis, el tejido del suelo y el tejido vascular.
Las muestras de tejido pueden prepararse a partir de partes de animales o plantas, por ejemplo, hueso, músculo, hojas, etc.
Líquidos corporales
La sangre, el suero, el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la saliva y el líquido sinovial son fluidos corporales que ofrecen una gran fuente de información relevante para el diagnóstico. Por lo tanto, es importante una preparación sofisticada de las muestras de fluidos corporales para su análisis. La primera dificultad está asociada a la amplia gama dinámica de componentes presentes en los fluidos corporales.
Determinación de la concentración de proteínas
El ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) son ensayos habituales para determinar la concentración de proteínas. La albúmina sérica bovina (BSA) es uno de los estándares proteicos más utilizados.
tampón de lisis
El tampón de lisis debe elegirse en función del material o tejido celular (cultivo de tejidos, plantas, bacterias, hongos, etc.), y de si las células se encuentran en una estructura y del tipo de estructura. Una amplia gama de tampones de lisis para la extracción de proteínas, membranas y orgánulos se formulan con uno o más detergentes. El detergente suele seleccionarse mediante pruebas de ensayo y error o – si está disponible – según un protocolo de extracción de proteínas existente. El detergente debe ser compatible con la fuente tisular y las proteínas. En general, se elige el detergente más suave que funcione para un tejido / proteína específicos, con el fin de mantener la máxima funcionalidad del extracto. Además, en el caso de una extracción de membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. Los detergentes comúnmente utilizados en los tampones de lisis son en su mayoría no iónicos o zwitteriónicos, por ejemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 y Tween 20.
Por ejemplo, tejidos como el cerebro, el hígado, el intestino, el riñón, el bazo, etc. pueden tamponarse simplemente con RIPA – No obstante, deben incluirse inhibidores de la proteasa y DTT (por ejemplo, para la electroforesis en gel).
Tampón de lisis para tejido muscular esquelético (frío como el hielo): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (p/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas.
Tabla de tampones habituales y su intervalo de pH. En general, estos tampones se utilizan normalmente a concentraciones de 20-50 mM.
| búfer | Rango de pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrato de sodio – Ácido cítrico | 3.0 – 6.2 |
| Acetato de sodio – ácido acético | 3.6 – 5.6 |
| Sal sódica del ácido cacodílico – HCl | 5,0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Dihidrógeno fosfato sódico – hidrogenofosfato disódico | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Clorhidrato de trietanolamina – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborato de sodio – ácido bórico | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicina – NaOH | 8.6 – 10.6 |
La mayoría de los tampones muestran una dependencia del pH con la temperatura. Esto es especialmente cierto para los tampones Tris. El pKa cambia de 8,06 a 25 °C a 8,85 a 0 °C.
(pH y pKa de un tampón: el pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa. La pKa (= constante de disociación del ácido) es una medida relacionada, pero más específica, ya que ayuda a predecir cómo actuará una molécula a un valor de pH específico).
TRIzol
TRIzol es una solución química utilizada para extraer ARN/ARN/proteínas durante la extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El uso de la extracción TRIzol asistida por ultrasonidos da lugar a altos rendimientos de ADN, ARN y proteínas a partir de la misma muestra y supera así a otros métodos de extracción.
Literatura/Referencias
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.