Extracción ultrasónica de proteínas de tejidos y cultivos celulares
- La extracción de proteínas es un paso esencial de la preparación de muestras en proteómica.
- Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos.
- La sonicación es un método fiable y eficiente de extracción de proteínas que proporciona altos rendimientos de proteínas en un tiempo de extracción breve.
Extracción de proteínas de tejidos y células
La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es un paso esencial de la preparación de muestras que se realiza en numerosas técnicas bioquímicas y analíticas, como ELISA, PAGE, Western blot, espectrometría de masas o purificación de proteínas. La ruptura celular, la lisis y la extracción por ultrasonidos constituyen una técnica no térmica que puede controlarse con precisión para garantizar altos rendimientos de proteínas.
Extracción de proteínas de células con la sonda ultrasónica UP200St
- Rapidez
- Altos rendimientos
- Alta eficiencia
- Control preciso de los parámetros
- Resultados reproducibles
- Escalabilidad lineal
Instrucciones generales para la lisis y la extracción de proteínas por ultrasonidos
- Control de temperatura: Para garantizar un alto rendimiento de proteínas sin desnaturalización térmica, debe controlarse la temperatura durante la extracción. Los homogeneizadores ultrasónicos de última generación de Hielscher –también llamados desintegradores ultrasónicos o sonicadores– pueden controlarse con precisión. Incorporan un sensor de temperatura conectable. En las opciones de configuración del homogeneizador ultrasónico puede establecerse una temperatura máxima. Cuando se alcanza esta temperatura máxima, el sonicador se detiene automáticamente hasta que la muestra se haya enfriado.
- Tampón: La elección de un tampón adecuado y del volumen correcto de tampón varía según el tejido y debe determinarse mediante ensayos de prueba y error.
- Aislamiento / purificación: Los lisados proteicos pueden contener un exceso de biomoléculas, como ADN o carbohidratos, que pueden eliminarse mediante precipitación de proteínas (desoxicolato–ácido tricloroacético) o intercambio de tampón.
Chittapalo y Noomhorm (2009) señalaron en su estudio que el rendimiento de proteínas aumentó con la sonicación y que el proceso de homogeneización y lisis ultrasónica de tejidos puede mejorar considerablemente los procesos de extracción existentes –lo que abre nuevas oportunidades de extracción comercial–.
CupHorn ultrasónico para la preparación simultánea y de gran eficacia de múltiples muestras en las mismas condiciones para el aislamiento de proteínas y la fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas de tejidos animales
Para la preparación de tejidos enteros (p. ej., riñón, corazón, pulmón, músculo, etc.), el tejido debe diseccionarse en trozos muy pequeños con herramientas limpias, preferiblemente sobre hielo y lo más rápidamente posible para evitar la degradación por proteasas (p. ej., con un tampón de lisis como RIPA o un tampón de lisis hipotónico que contenga una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas). Tras la disección, la muestra se sumerge en nitrógeno líquido para su congelación rápida. La muestra puede almacenarse a -80 °C para su uso posterior o mantenerse sobre hielo para su homogeneización inmediata. Inmediatamente antes de la extracción ultrasónica, se añade rápidamente al tubo de muestra un tampón de lisis enfriado en hielo (con los inhibidores de proteasas DTT, leupeptina y aprotinina) (se recomiendan aproximadamente ~600 μL de tampón por cada ~10 mg de tejido). Se recomiendan aproximadamente 20–60 mg de tejido por tubo de muestra.
La homogeneización, la lisis y la extracción por ultrasonidos se realizan con un homogeneizador ultrasónico como el UP100H o el UP200Ht, equipado con un sonotrodo de micropunta. La duración de la sonicación es de 60–90 sec., en un modo de ciclos ultrasónicos de 15 sec. de sonicación y 10 sec. de reposo. La muestra debe mantenerse en hielo en todo momento.
Después de la homogeneización / extracción ultrasónica, el lisado se centrifuga a 27.000 g durante aproximadamente 20 min. A continuación, se recoge el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas mediante un ensayo de proteínas, como el ensayo BCA de Pierce.
Extracción de proteínas del suero sanguíneo
Para obtener una mezcla homogénea del suero y el tampón fosfato, la muestra se agita primero en un mezclador vórtex antes de la lisis celular ultrasónica. Para la lisis ultrasónica, la muestra se somete a sonicación con un homogeneizador ultrasónico de laboratorio como el UP100H durante 8 ciclos al 20% de amplitud, con 5 segundos de funcionamiento y 15 segundos de pausa en cada ciclo. La extracción de proteínas se realiza mediante sonicación por ciclos (modo pulsado) y colocando la muestra sobre hielo para evitar su sobrecalentamiento y degradación térmica. Dado que el suero contiene una gran cantidad de proteínas de alto peso molecular (como albúmina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulin, inmunoglobulina G e inmunoglobulina A), que interfieren en la separación de las proteínas de bajo peso molecular durante el enfoque isoeléctrico (IEF), se recomienda eliminarlas del suero mediante una columna de depleción.
Extracción de proteínas de tejidos vegetales
Los tejidos vegetales frescos y blandos, como el musgo, etc., pueden disgregarse fácilmente colocando el material de muestra troceado en un tampón de lisis para someterlo a sonicación. Los tejidos vegetales resistentes y lignificados, como las semillas, las acículas de abeto, etc., deben molerse en seco. Algunos materiales vegetales duros y leñosos deben congelarse y molerse en nitrógeno líquido antes de la extracción por sonicación. Para las suspensiones de cultivos celulares vegetales, suele ser suficiente un tratamiento ultrasónico de entre 30 y 150 segundos en un tampón de lisis. Los materiales más resistentes, como las semillas de calabaza, requieren una sonicación más intensa, como se describe a continuación.
Protocolo de extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza
Para la extracción ultrasónica de albúmina a partir de semillas de calabaza finamente molidas, se añaden 10 g de polvo de semillas de calabaza desgrasado y 100 mL de agua desionizada como disolvente a un vaso de precipitados de vidrio de 250 mL. La extracción de proteínas consta de dos etapas: primero, la muestra se somete a sonicación con un sonicador de sonda UP400St (400 W, 24 kHz) equipado con el sonotrodo S24d7. El vaso de precipitados de vidrio se coloca en un baño de agua fría durante la homogeneización ultrasónica. El sensor de temperatura conectable y los ajustes de control de temperatura del sonicador UP400St garantizan que la temperatura de la muestra se mantenga siempre por debajo de 30 °C. El control preciso de la temperatura durante la sonicación evita la desnaturalización de la albúmina. En segundo lugar, se realizó la extracción con un mezclador a una velocidad de 200 rpm y a 30 °C. A continuación, el vaso de precipitados se transfiere a un agitador termostatizado. La globulina se elimina mediante diálisis con agua destilada. Tras eliminar la globulina, pueden tomarse muestras del extracto proteico para determinar el perfil de albúmina y, posteriormente, se ajusta a pI=3,0 utilizando 0,1 M HCl para la coagulación de la albúmina. La fase sólida se separa mediante centrifugación a 5000 g y 20 °C y se redisuelve en agua desionizada. La coagulación de la albúmina se realiza dos veces para aumentar la proporción de proteínas en el concentrado de albúmina.
La extracción alcalina ultrasónica de proteínas para la preparación de concentrados proteicos a partir de salvado de arroz demuestra que el tratamiento ultrasónico proporciona un mayor rendimiento de proteínas en un tiempo de extracción considerablemente más corto –en comparación con los métodos de extracción convencionales–.
Protocolo de preparación de muestras para la enzima iNOS funcional
Para obtener una enzima iNOS plenamente funcional (p. ej., para el cribado de fármacos), se recomienda el siguiente protocolo: la suspensión celular debe colocarse sobre hielo y someterse a sonicación con un UP100H a una amplitud de 10 µm, en modo de ciclos de 5 sec. de sonicación y 25 sec. de reposo sobre hielo. El procedimiento debe repetirse aproximadamente 3 veces. El tiempo de reposo entre los ciclos de sonicación reduce el aumento de temperatura y, por tanto, el riesgo de desnaturalización.
Solubilización ultrasónica de proteínas
La sonicación puede acelerar el proceso de solubilización de proteínas, que suele requerir varias horas. Para evitar el sobrecalentamiento de la muestra y prevenir la degradación y las modificaciones de las proteínas en soluciones que contienen urea, los pulsos ultrasónicos no deben durar más de unos pocos segundos.
Sonicador UP200Ht con micropunta S26d2 de 2 mm para la sonicación de muestras pequeñas.
Equipos ultrasónicos para la extracción de proteínas
Hielscher Ultrasonics ofrece una amplia gama de homogeneizadores ultrasónicos para la desintegración de células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras y esporas.
Los sonicadores de laboratorio de Hielscher son potentes y fáciles de utilizar. Fabricados para funcionar 24/7, están diseñados como equipos de laboratorio y de sobremesa robustos y eficientes. En todos los equipos, la energía suministrada y la amplitud pueden controlarse con precisión. La amplia gama de accesorios ofrece más opciones de configuración. Los sonicadores digitales, como VialTweeter, UP200Ht, UP200St y UP400St, incorporan un control de temperatura integrado y una tarjeta SD para el registro automático de datos.
Para la sonicación indirecta y simultánea de múltiples muestras sin contaminación cruzada, ofrecemos VialTweeter o el CupHorn ultrasónico.
La siguiente tabla ofrece una visión general de nuestros sonicadores para la preparación de muestras, la ruptura celular y la extracción. Haga clic en el modelo del equipo para obtener más información sobre cada homogeneizador ultrasónico. Nuestro personal técnico, con amplia formación y muchos años de experiencia, estará encantado de ayudarle a elegir el sonicador más adecuado para la preparación de sus muestras.
| Volumen del lote | Caudal | Equipos recomendados |
|---|---|---|
| hasta 10 viales o tubos | n.a. | VialTweeter |
| placas multipocillo / de microtitulación | n.a. | UIP400MTP |
| múltiples tubos / recipientes | n.a. | CupHorn |
| de 1 a 500 mL | de 10 a 200 mL/min | UP100H |
| de 10 a 1000 mL | de 20 a 200 mL/min | UP200Ht, UP200St |
| de 10 a 2000 mL | de 20 a 400 mL/min | UP400St |
Según su aplicación, el material y el volumen de muestra, le recomendaremos la configuración más adecuada para la preparación de sus muestras. ¡Contacte con nosotros hoy mismo!
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Los sonicadores digitales de Hielscher incorporan control remoto mediante navegador y registro automático de datos en una tarjeta SD integrada.
VialTweeter para sonicación indirecta.
Información de interés
Proteómica
La proteómica es el campo de investigación que estudia las proteínas y el proteoma. Las proteínas desempeñan una gran variedad de funciones vitales en los organismos. El proteoma es el conjunto completo de proteínas expresadas por un genoma, una célula, un tejido o un organismo en un momento determinado. El proteoma varía con el tiempo y con las distintas necesidades o situaciones de estrés a las que se enfrenta una célula o un organismo. Más concretamente, es el conjunto de proteínas expresadas en un tipo determinado de célula u organismo, en un momento dado y bajo condiciones definidas. El término combina las palabras proteína y genoma. La proteómica es el estudio del proteoma.
Proteína
Las proteínas son grandes biomoléculas, denominadas macromoléculas, compuestas por una o más cadenas largas de residuos de aminoácidos. Las proteínas están presentes en todos los organismos, tanto de origen vegetal como animal, y son fundamentales para la mayoría de las funciones biológicas. Dado que contienen una gran cantidad de información biológica, se extraen con fines analíticos, por ejemplo, para la investigación proteómica. Entre las funciones más importantes de las proteínas se incluyen la catálisis de reacciones metabólicas, la replicación del ADN, la respuesta a estímulos y el transporte de moléculas de un lugar a otro. Las proteínas se diferencian entre sí principalmente por su secuencia de aminoácidos, que viene determinada por la secuencia de nucleótidos de sus genes y que suele dar lugar al plegamiento de la proteína en una estructura tridimensional específica que determina su actividad. Las proteínas son –junto con los péptidos– uno de los componentes principales de los alimentos. Por ello, la proteómica es una herramienta potente en la ciencia de los alimentos para optimizar los procesos, la seguridad alimentaria y la evaluación nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction es un procedimiento preanalítico para separar y preconcentrar analitos. En combinación con la sonicación, la extracción por punto de nube puede intensificarse, haciendo que el proceso sea más eficiente, más rápido y más respetuoso con el medio ambiente. Con la sonicación, la extracción por punto de nube es un método considerablemente más eficiente de preparación de analitos. ¡Más información sobre la extracción por punto de nube asistida por ultrasonidos!
Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es el principal método de separación y análisis de macromoléculas como ADN, ARN y proteínas, así como de sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga y/o tamaño (IEF en agarosa, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica, biología molecular y proteómica para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, estimar el tamaño de los fragmentos de ADN y ARN o separar proteínas por carga.
Cultivos celulares
El cultivo celular es el proceso de crecimiento controlado mediante el cual se cultivan células en condiciones controladas. Las condiciones de cultivo varían según el tipo de célula. En general, el entorno de un cultivo celular consiste en un recipiente adecuado (p. ej., una placa de Petri) con un sustrato o medio que aporta los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO2, O2) y regula el entorno fisicoquímico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células necesitan una superficie o un sustrato artificial, mientras que otros cultivos celulares pueden mantenerse flotando libremente en el medio de cultivo (cultivo en suspensión, suspensión celular).
Los cultivos a gran escala de líneas celulares animales se utilizan en la producción industrial de vacunas víricas y otros productos obtenidos mediante biotecnología. Las células madre humanas se cultivan para aumentar el número de células y diferenciarlas en diversos tipos de células somáticas con fines de trasplante.
Muestras de tejido
El término tejido describe un nivel intermedio de organización celular, en el que el material celular se encuentra entre las células y un órgano completo. En un tejido se agrupan células similares, del mismo origen, que desempeñan conjuntamente una función específica. La agrupación funcional de múltiples tejidos forma las estructuras complejas de los órganos.
Se toman muestras de tejido para la investigación en biología, histología/histopatología, parasitología, bioquímica e inmunohistoquímica, así como para su cultivo y la extracción de ADN. Se distingue entre tejido animal (subdivisión: tejido de mamíferos) y tejido vegetal. Los tejidos animales se agrupan en cuatro tipos básicos: conjuntivo, muscular, nervioso y epitelial. El tejido vegetal se subdivide en los siguientes tres sistemas tisulares: la epidermis, el tejido fundamental y el tejido vascular.
Las muestras de tejido pueden prepararse a partir de partes de animales o plantas, como huesos, músculos, hojas, etc.
Líquidos corporales
La sangre, el suero, el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la saliva y el líquido sinovial son líquidos corporales que constituyen una excelente fuente de información de relevancia diagnóstica. Por ello, es importante realizar una preparación rigurosa de las muestras de líquidos corporales para su análisis. La primera dificultad está relacionada con el amplio rango dinámico de los componentes presentes en los líquidos corporales.
Determinación de la concentración de proteínas
El ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) son ensayos habituales para determinar la concentración de proteínas. La albúmina sérica bovina (BSA) es uno de los patrones de proteínas más utilizados.
Tampón de lisis
El tampón de lisis debe elegirse en función del material celular o del tejido (cultivo de tejidos, plantas, bacterias, hongos, etc.), de si las células forman parte de una estructura y del tipo de estructura. Una amplia variedad de tampones de lisis para la extracción de proteínas, membranas y orgánulos se formula con uno o más detergentes. El detergente suele seleccionarse mediante ensayos de prueba y error o –si se dispone de él– siguiendo un protocolo de extracción de proteínas existente. El detergente debe ser compatible con el tejido de origen y con las proteínas. En general, se elige el detergente más suave que resulte eficaz para un tejido / una proteína específicos, con el fin de mantener la máxima funcionalidad del extracto. Además, en la extracción de membranas y orgánulos, un detergente suave mantiene la membrana intacta. Los detergentes utilizados habitualmente en los tampones de lisis son principalmente no iónicos o zwitteriónicos, como CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 y Tween 20.
Por ejemplo, tejidos como el cerebro, el hígado, el intestino, el riñón, el bazo, etc., pueden tratarse simplemente con el tampón RIPA –aunque deben incluirse inhibidores de proteasas y DTT (p. ej., para la electroforesis en gel)–.
Tampón de lisis para tejido muscular esquelético (enfriado en hielo): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas
Tabla de tampones habituales y su intervalo de pH. En general, estos tampones suelen utilizarse a concentraciones de 20–50 mM.
| Tampón | Intervalo de pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrato de sodio – ácido cítrico | 3,0 – 6,2 |
| Acetato de sodio – ácido acético | 3,6 – 5,6 |
| Sal sódica del ácido cacodílico – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihidrogenofosfato de sodio – hidrogenofosfato de disodio | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Clorhidrato de trietanolamina – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricina – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraborato de sodio – ácido bórico | 7,6 – 9,2 |
| Bicina – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicina – NaOH | 8,6 – 10,6 |
El pH de la mayoría de los tampones depende de la temperatura. Esto es especialmente cierto en el caso de los tampones Tris. El pKa cambia de 8,06 a 25 °C a 8,85 a 0 °C.
(pH y pKa de un tampón: el pH mide la concentración de iones de hidrógeno en una solución acuosa. El pKa (= constante de disociación ácida) es una medida relacionada, pero más específica, ya que ayuda a predecir cómo se comportará una molécula a un valor de pH determinado.)
TRIzol
TRIzol es una solución química utilizada para extraer ARN/ADN/proteínas mediante la extracción con tiocianato de guanidinio–fenol–cloroformo. La extracción con TRIzol asistida por ultrasonidos proporciona altos rendimientos de ADN, ARN y proteínas a partir de una misma muestra, superando así a otros métodos de extracción.
Bibliografía/Referencias
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.