Lisis mediante ultrasonidos para western blot

• El western blot es un procedimiento analítico para la detección de proteínas específicas en una muestra de homogeneizado tisular o extracto celular.
• Para realizar un Western blot o medir la actividad enzimática, muchos ensayos requieren acceder a los materiales (por ejemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapados en la célula.
• La sonicación es un método fiable y fácil de manejar para la disrupción y lisis celular controlada.

disrupción celular por ultrasonidos

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es el primer paso para muchas técnicas biológicas, bioquímicas y analíticas (PAGE, Western blotting, ELISA, espectrometría de masas, etc.) o para la purificación de proteínas. Para obtener un alto rendimiento proteico, el material celular y el tejido deben disgregarse/lisarse eficazmente. Tanto si se trata de células vegetales como de tejidos animales, la sonicación es el método para preparar su lisado celular de forma fácil y rápida.

Ventajas de la sonicación

• Rápida & Eficaz
• Fácil manejo
• alto rendimiento proteínico
• reproducible/repetible
• controlada con precisión
• escalable

Protocolo de inmunoprecipitación para Western Immunoblotting

A. Reactivos

Para la preparación de las soluciones, utilice agua purificada como Milli-Q.

• 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS)
• 1X Tampón de Lisis Celular: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato sódico, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptina.
  Importante: Añadir 1 mM PMSF inmediatamente antes de su uso.
• 15 μl de proteína A+15 μl de proteína G es suficiente para IP, pero puede depender de su anticuerpo primario y del volumen de la muestra. También puede utilizar agarosa proteína A/ G premezclada (por ejemplo, proteína A para pull down de IgG de conejo y proteína G para pull down de IgG de ratón).
• Tampón de muestra 3X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% p/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% p/v azul de bromofenol

B. Preparación de lisados celulares

• Recoger las células. Para recolectar células en condiciones de no desnaturalización, elimine el medio y enjuague las células una vez con PBS helado.
• Retire el PBS y añada 0,5 ml de tampón de lisis celular 1X enfriado en hielo a cada placa (10 cm) e incube las placas en hielo durante 5 minutos.
• Raspar las células de las placas y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Mantener en hielo.
• Sonicar dos veces durante 10 segundos en tampón de inmunoprecipitación frío (tampón IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 y la mezcla de inhibidores de proteasas). Para la sonicación, el VialTweeter o un ultrasonicador de sonda como el UP100H o UP200Ht son los más adecuados.
• Centrifugar los lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4°C.
• Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. (Si es necesario, el lisado puede almacenarse a -80 °C).
• Añadir el anticuerpo primario al sobrenadante. El sobrenadante con el anticuerpo primario se incuba durante 1 h a 4°C bajo agitación ligera. El anticuerpo primario se añade normalmente en una cantidad 10 veces más concentrada que la que se utiliza para western blotting. (Se puede empezar con 1μg por 100μL).
• A continuación, el sobrenadante se incuba de nuevo con la mezcla de cantidades iguales de proteína A-agarosa (Invitrogen) y proteína G-agarosa durante 1 h más.
• Lavar los pellets de agarosa tres veces con tampón IP. Después, extraer las proteínas unidas con el tampón de carga SDS-PAGE calentando a 95°C durante 5 minutos.

C. Inmunoprecipitación

• Tomar 200 μl de lisado celular y añadir el anticuerpo primario. Incubar con agitación suave durante la noche a 4 °C.
• Añadir perlas de agarosa de proteína A o G (20 μl de suspensión de perlas al 50%). Incubar con agitación suave durante 1-3 horas a 4 °C.
• Microcentrifugar durante 30 segundos a 4°C. Lavar el pellet cinco veces con 500 µl de tampón de lisis celular 1X. Mantener en hielo durante los lavados.
• Resuspender el pellet con 20 μl de tampón de muestra SDS 3X. Agite en vórtex y microcentrifugue durante 30 segundos.
• Calentar la muestra a 95-100°C durante 2-5 minutos y microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
• Cargar la muestra (15-30 μl) en un gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analizar la muestra mediante Western blotting.

Análisis Western Blot con ultrasonicador UP50H

En el estudio de Kriebisch et al. (2011) se utilizó el siguiente protocolo:
Se aisló la proteína total de células MC3T3-E1 tratadas con 1,25(OH)₂D₃ (10^-8 M) o vehículo. Las células se lisaron con un tampón que contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecil sulfato sódico (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) y 0,5% desoxicolato sódico (Merck). El lisado celular se sometió a sonicación durante 2 × 10 s a ciclo 1 y amplitud 80 con el Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemania). A continuación, el material se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm y el sobrenadante se utilizó para Western blotting. Veinticinco μg de proteína se hirvieron en tampón de muestra y agente reductor (Invitrogen) y posteriormente se separaron por SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 4-12% (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE health care). La membrana se bloqueó durante 1 h con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) que contenía un 1% de caseína (Sigma-Aldrich) y un 1% de Tris (1 M). Tras el bloqueo, la membrana se incubó con ligera agitación durante toda la noche a 4°C con el anticuerpo primario (conejo anti-humano CBS 1/500, desarrollado en el laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EE.UU.). La incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dako) se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Todos los blots se revelaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).

Literatura / Referencias