Lisis ultrasónica para Western blot

• El Western blot es un procedimiento analítico para detectar proteínas específicas en una muestra de homogeneizado tisular o extracto celular.
• Para realizar un Western blot o medir la actividad enzimática, muchos ensayos requieren acceder a los materiales (p. ej., proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) contenidos en la célula.
• La sonicación es un método fiable y fácil de manejar para la ruptura celular y la lisis controladas.

Ruptura celular ultrasónica

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es el primer paso de muchas técnicas biológicas, bioquímicas y analíticas (PAGE, Western blot, ELISA, espectrometría de masas, etc.) o de la purificación de proteínas. Para obtener un alto rendimiento de proteínas, el material celular y los tejidos deben someterse a una ruptura o lisis eficiente. Tanto para células vegetales como para tejidos animales, la sonicación permite preparar el lisado celular de forma fácil y rápida.

Ventajas de la sonicación

• rápida y eficiente
• manejo sencillo
• alto rendimiento de proteínas
• reproducible/repetible
• control preciso
• escalable

Protocolo de inmunoprecipitación para inmunotransferencia Western

A. Reactivos

Para preparar las soluciones, utilice agua purificada, como Milli-Q.

• Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X
• Tampón de lisis celular 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato de sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptina
  Importante: añada 1 mM PMSF inmediatamente antes de su uso.
• 15 μl de proteína A+15 μl de proteína G son suficientes para la IP, aunque esto puede depender del anticuerpo primario y del volumen de muestra. También puede utilizar agarosa con proteínas A/G premezcladas (p. ej., proteína A para la captura de IgG de conejo y proteína G para la captura de IgG de ratón)
• Tampón de muestra con SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25 °C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v azul de bromofenol

B. Preparación de lisados celulares

• Recoja las células. Para recogerlas en condiciones no desnaturalizantes, retire el medio y enjuague las células una vez con PBS enfriado en hielo.
• Retire el PBS, añada 0,5 ml de tampón de lisis celular 1X enfriado en hielo a cada placa (10 cm) e incube las placas sobre hielo durante 5 minutos.
• Desprenda las células de las placas con un raspador y transfiéralas a tubos de microcentrífuga. Manténgalas sobre hielo.
• Sonique dos veces durante 10 segundos en tampón de inmunoprecipitación enfriado en hielo (tampón IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 y la mezcla de inhibidores de proteasas). Para la sonicación, el VialTweeter o un sonicador de sonda, como el UP100H o el UP200Ht son las opciones más adecuadas.
• Centrifugue los lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
• Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. (Si es necesario, el lisado puede conservarse a –80 °C.)
• Añada el anticuerpo primario al sobrenadante. El sobrenadante con el anticuerpo primario se incuba durante 1 h a 4 °C con agitación suave. El anticuerpo primario suele añadirse a una concentración 10x mayor que la utilizada para el Western blot. (Puede comenzar con 1μg por 100 μL.)
• A continuación, el sobrenadante se incuba con una mezcla de cantidades iguales de agarosa con proteína A (Invitrogen) y agarosa con proteína G durante otra 1 h.
• Lave los sedimentos de agarosa tres veces con tampón IP. Después, extraiga las proteínas unidas con el tampón de carga para SDS-PAGE, calentando a 95 °C durante 5 minutos.

C. Inmunoprecipitación

• Tome 200 μl de lisado celular y añada el anticuerpo primario. Incube durante toda la noche a 4 °C con un movimiento de balanceo suave.
• Añada perlas de agarosa con proteína A o G (20 μl de una suspensión de perlas al 50%). Incube con un movimiento de balanceo suave durante 1–3 horas a 4 °C.
• Microcentrifugue durante 30 segundos a 4 °C. Lave el sedimento cinco veces con 500 µl de tampón de lisis celular 1X. Manténgalo sobre hielo durante los lavados.
• Resuspenda el sedimento con 20 μl de tampón de muestra con SDS 3X. Agite en un mezclador vórtex y, a continuación, microcentrifugue durante 30 segundos.
• Caliente la muestra a 95–100 °C durante 2–5 minutos y microcentrifugue durante 1 minuto a 14.000 X g.
• Cargue la muestra (15–30 μl) en un gel de SDS-PAGE (12–15%).
• Analice la muestra mediante Western blot.

Análisis por Western blot con el sonicador UP50H

En el estudio de Kriebisch et al. (2011) se utilizó el siguiente protocolo con el sonicador de sonda UP50H:
Se aisló la proteína total de células MC3T3-E1 tratadas con 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) o con el vehículo. Las células se lisaron con un tampón que contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecilsulfato de sodio (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) y 0,5% desoxicolato de sodio (Merck). El lisado celular se sonicó durante 2 × 10 s con el ciclo ajustado a 1 y la amplitud a 80 utilizando el procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemania). A continuación, el material se centrifugó durante 10 min a 14.000 rpm y el sobrenadante se utilizó para el Western blot. Se hirvieron veinticinco μg de proteína en tampón de muestra y agente reductor (Invitrogen) y, posteriormente, se separaron mediante SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 4–12% (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE health care). La membrana se bloqueó durante 1 h con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) que contenía 1% caseína (Sigma-Aldrich) y 1% Tris (1 M). Tras el bloqueo, la membrana se incubó con agitación suave durante toda la noche a 4 °C con el anticuerpo primario (anticuerpo de conejo contra CBS humana 1/500, desarrollado en el laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). La incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HPR) (Dako) se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Todas las inmunotransferencias se revelaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).
 

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La siguiente tabla indica la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros sonicadores de laboratorio:

Bibliografía / Referencias

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.