Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Lisis mediante ultrasonidos para western blot

  • El Western blot es un procedimiento analítico para la detección de proteínas específicas en una muestra de tejido homogeneizado o extracto celular.
  • Para realizar una Western blot o para medir la actividad enzimática, muchos ensayos requieren acceso a los materiales (por ejemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapados en la célula.
  • La sonicación es un método fiable y fácil de manejar para la interrupción y lisis celular controlada.

Trastorno celular ultrasónico

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es el primer paso para muchas técnicas biológicas, bioquímicas y analíticas (PAGE, Western blotting, ELISA, espectrometría de masas, etc.) o purificación de proteínas. Para obtener un alto rendimiento proteico, el material celular y el tejido deben ser eficientemente interrumpidos/ lisados. Tanto si se trata de células vegetales como de tejidos animales, la sonicación es el método para preparar su lisado celular de forma fácil y rápida.

Ventajas de la sonicación

  • Rápida & eficaz
  • fácil manejo
  • alto rendimiento proteico
  • reproducible/ repetible
  • controlado con precisión
  • ampliable

Protocolo de inmunoprecipitación para la inmunotransferencia occidental

A. Reactivos

Para la preparación de las soluciones, utilice agua purificada como Milli-Q.

  • Solución salina tamponada de fosfato 1X (PBS)
  • 1X Buffer de Lisis Celular: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pirofosfato de sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    Importante: Añadir 1 mM PMSF inmediatamente antes de su uso.
  • 15 μl Proteína A+15 μl La proteína G es suficiente para la IP, pero puede depender de su anticuerpo primario y volumen de muestra. También puede utilizar agarosa A/ G premezclada (por ejemplo, la proteína A para la IgG de conejo y la proteína G para la IgG de ratón).
  • Buffer de muestras 3X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% p/v SDS, 30% glicerol, 150 mM TDT, 0,03% p/v azul de bromofenol
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter para la preparación de muestras por ultrasonidos

Póngase en contacto con nosotros/Envíenos su pregunta





Revise nuestra política de privacidad.


La sonicación es un paso importante durante la preparación de muestras

UP200St con micro-punta para sonicación de muestras

B. Preparación de Lisados Celulares

  • Cosecha las células. Para cosechar células en condiciones no naturales, retire el medio y enjuague las células una vez con PBS frío como el hielo.
  • Retirar el PBS y añadir 0,5 ml de tampón de lisis de 1X células a cada placa (10 cm) e incubar las placas en hielo durante 5 minutos.
  • Raspar las células de las placas y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Manténgase en hielo.
  • Sonicar dos veces durante 10 segundos en un tampón de inmunoprecipitación fría (tampón IP): 50 mM Tris-HCl[pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 y la mezcla de inhibidores de proteasa). Para la sonicación, el VialTweeter o un ultrasonido de sonda como el UP100H o UP200Ht son los más adecuados.
  • Centrifugar los lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
  • Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. (Si es necesario, el lisado puede almacenarse a -80°C.)
  • Añade el anticuerpo primario al sobrenadante. El sobrenadante con el anticuerpo primario se incuba durante 1 h a 4°C bajo agitación ligera. El anticuerpo primario se agrega típicamente en una cantidad 10 veces más concentrada que la que se utiliza para la Western Blotting. (Puede comenzar con 1μg en 100μL.)
  • El sobrenadante se incuba posteriormente con la mezcla de cantidades iguales de proteína A-agarosa (Invitrogen) y agarosa de la proteína G durante 1 hora más.
  • Lavar los gránulos de agarosa tres veces con tampón IP. A continuación, extraer las proteínas ligadas con el tampón de carga SDS-PAGE calentándolas a 95°C durante 5 minutos.

C. Inmunoprecipitación

  • Tome 200 lisado celular μl y añada anticuerpos primarios. Incubar durante la noche a 4°C.
  • Añada perlas de agarosa de proteína A o G (20 μl de lechada de perlas al 50%). Incubar con un balanceo suave durante 1-3 horas a 4°C.
  • Microcentrifugar durante 30 segundos a 4°C. Lavar el precipitado cinco veces con 500 µl de tampón de lisis de 1X células. Manténgase en hielo durante los lavados.
  • Resuspender el precipitado con 20 μl 3X SDS buffer de muestra. Vórtice, luego microcentrifugue durante 30 segundos.
  • Calentar la muestra a 95-100°C durante 2-5 minutos y microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
  • Cargue la muestra (15-30 μl) en el gel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analizar la muestra por Western blotting.

¡Contacte con nosotros y solicítenos más información!

Infórmenos sobre los requerimientos de su proceso. Le recomendaremos tanto el equipo como los parámetros de funcionamiento más adecuados para su proyecto.





Revise nuestra política de privacidad.


Más protocolos de sonicación

Análisis de Western Blot con ultrasonido UP50H

En el estudio de Kriebisch et al. (2011) se utilizó el siguiente protocolo:
La proteína total fue aislada de las células MC3T3-E1 tratadas con 1,25(OH)2D3 (10−8 M) o vehículo. Las células se lisaron con un tampón que contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% de sulfato de sodio y dodecilo (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) y 0,5% de desoxicolato de sodio (Merck). El lisado celular se sonorizó durante 2 × 10 s en el ciclo 1 y la amplitud 80 con el Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemania). A continuación, el material se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm y el sobrenadante se utilizó para el Western blotting. Veinticinco μg de proteína fue hervida en un agente tampón y reductor de la muestra (Invitrogen) y posteriormente separada por SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 4-12% (Invitrogen) y transferida a una membrana de nitrocelulosa (GE health care). La membrana se bloqueó durante 1 h con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) conteniendo 1% de caseína (Sigma-Aldrich) y 1% de Tris (1 M). Después del bloqueo, la membrana fue incubada con una ligera agitación durante la noche a 4°C con el anticuerpo primario (conejo anti-humano CBS 1/500, desarrollado en el laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Se realizó la incubación con un anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante (HPR) (Dako) durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los bloques fueron desarrollados por quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).

Literatura/Referencias



Acerca de Western Blotting

Los bloques son procedimientos analíticos en los que el ADN, el ARN y las proteínas se transfieren a un soporte para que puedan separarse.
El Southern blot se utiliza para la detección de ADN, el Northern blot para ARN y el Western blot para proteínas.
La Western blotting también se denomina inmunotransferencia proteica porque se utiliza un anticuerpo para detectar específicamente su antígeno. El Western Blotting es uno de los métodos de análisis más importantes para detectar proteínas específicas en la muestra. En la Western blot, las proteínas se inmovilizan en las membranas para detectarlas utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales.
Por SDS-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE), las proteínas nativas se separan por la estructura tridimensional o las proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido. Las proteínas se transfieren luego a una membrana (típicamente nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos específicos de la proteína diana. El paso de electroforesis en gel se incluye en el análisis de western blot para resolver el problema de la reactividad cruzada de los anticuerpos.
Después, las proteínas separadas se secan en una matriz (principalmente en una membrana de nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos. Los anticuerpos funcionan como una sonda y se seleccionan específicamente para la proteína diana. El análisis de la localización e intensidad de la reacción específica revela detalles de expresión de las proteínas diana en la muestra dada. La Western blotting podría detectar la proteína diana que es tan baja como 1 ng debido a la alta resolución de la electroforesis en gel y a la fuerte especificidad y alta sensibilidad del inmunoensayo. El método Western blot se utiliza en biología molecular, bioquímica, inmunogenética y otros campos de investigación molecular.
Otras técnicas relacionadas incluyen el análisis por punto, la inmunohistoquímica y la inmunocitoquímica, en las que se utilizan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción, y la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA).