Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Lisis mediante ultrasonidos para western blot

  • El western blot es un procedimiento analítico para la detección de proteínas específicas en una muestra de homogeneizado de tejido o extracto celular.
  • Para ejecutar una transferencia de Western o para medir la actividad enzimática, muchos ensayos requieren el acceso a los materiales (por ejemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapadas en la celda.
  • La sonicación es un método fiable y fácil de manejar para la ruptura celular controlada y lisis.

La disrupción celular ultrasónico

La extracción de proteínas a partir de tejidos y células cultivadas es el primer paso para muchas técnicas biológicas, bioquímicas y analíticas (PAGE, transferencia Western, ELISA, espectrometría de masas, etc.) o la purificación de proteínas. Para obtener un alto rendimiento de proteína, el material celular y de tejido deben ser interrumpidos de manera eficiente / lisadas. Ya sea célula vegetal o tejido animal, sonicación es el método para preparar el lisado celular fácil y rápido.

Ventajas del tratamiento con ultrasonidos

  • Rápida & eficiente
  • operación fácil
  • alto rendimiento de proteínas
  • reproducible / repetible
  • precisamente controlada
  • escalable

Protocolo de inmunoprecipitación para inmunotransferencia Western

A. Reactivos

Para la preparación de las soluciones, utilizar agua purificada como Milli-Q.

  • 1X tampón fosfato salino (PBS)
  • 1X Tampón de Lisis Celular: Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 2,5 pirofosfato mM de sodio, 1 mM β-glicerofosfato, mM Na3VO4 1, 1 g / ml de leupeptina
    Importante: Añadir PMSF 1 mM inmediatamente antes de su uso.
  • 15 Proteína l A Protein + 15 l G es suficiente para IP, pero puede depender de su volumen anticuerpo y muestra primaria. También puede utilizar pre-mezclado proteína A / G agarosa (por ejemplo, proteína A de conejo IgG tire hacia abajo y Proteína G para IgG de ratón tire hacia abajo)
  • 3X SDS tampón de muestras: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25 ° C), 6% w / v de SDS, 30% de glicerol, DTT 150 mM, 0,03% w / v azul de bromofenol
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter para la preparación de muestras por ultrasonidos

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La sonicación es un paso importante durante la preparación de muestras

UP200St con micropunta para sonicación de muestras

B. Preparación de lisados ​​de células

  • Recoger las células. Para cosechar las células en condiciones no desnaturalizantes, eliminar el medio y enjuague células una vez con PBS enfriado en hielo.
  • Retirar PBS y añadir tampón de lisis celular 0,5 ml de hielo-frío 1X a cada placa (10 cm) y se incuban las placas en hielo durante 5 minutos.
  • Raspar las células fuera de las placas y se transfieren a tubos de microcentrífuga. Mantener en hielo.
  • Someter a ultrasonidos dos veces durante 10 segundos en tampón de inmunoprecipitación enfriado en hielo (tampón IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% NP-40 y la mezcla de inhibidor de proteasa). Para la sonicación, la VialTweeter o un ultrasonicador sonda como la UP100H o UP200Ht son los más adecuados.
  • Centrifugar los lisados ​​a 15.000 g durante 10 minutos a 4 ° C.
  • Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. (Si es necesario, el lisado se puede almacenar a -80 ° C.)
  • Añadir el anticuerpo primario al sobrenadante. Se incuba el sobrenadante con el anticuerpo primario durante 1 h a 4 ° C con agitación ligera. El anticuerpo primario se añade típicamente en una cantidad 10 veces más concentrado que se utiliza para la transferencia de western. (Puede comenzar con 1 g por 100 pl.)
  • El sobrenadante se incubó adicionalmente con la mezcla de cantidades iguales de proteína A-agarosa (Invitrogen) y la proteína G agarosa para otra 1 h.
  • Lavar los pellets de agarosa tres veces con tampón IP. Después, extraer las proteínas unidas con el tampón de carga SDS-PAGE por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos.

C. La inmunoprecipitación

  • Tomar 200 l de lisado celular y añadir el anticuerpo primario. Incubar con agitación suave durante la noche a 4 ° C.
  • Añadir ya sea la proteína A o perlas de agarosa G (20 l de suspensión de perlas 50%). Incubar con agitación suave durante 1-3 horas a 4 ° C.
  • Microcentrífuga durante 30 segundos a 4 ° C. Wash sedimentar cinco veces con 500 l de tampón de lisis celular 1X. Mantener en hielo durante el lavado.
  • Resuspender el sedimento con 20 l de tampón de muestra 3X SDS. Vórtice, luego microcentrífuga durante 30 segundos.
  • Calentar la muestra a 95-100 ° C durante 2-5 minutos y microcentrífuga durante 1 minuto a 14.000 X g.
  • Cargar la muestra (15-30 l) en gel de SDS-PAGE (12-15%).
  • Analizar la muestra por Western Blot.

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Más Protocolos de sonicación

El análisis de transferencia Western con UP50H ultrasonicador

Siguiendo el protocolo se utilizó en el estudio de Kriebisch et al. (2011):
La proteína total se aisló a partir de células MC3T3-E1 tratados con 1,25 (OH)2re3 (10-8 M) o vehículo. Las células se lisaron con un tampón que contiene 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); NaCl 150 mM (Fisher Scientific); 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS) (Fisher Scientific); desoxicolato de sodio al 1% de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) y 0,5% (Merck). El lisado celular se sometió a ultrasonidos durante 2 x 10 s en el ciclo 1 y la amplitud 80 con el Procesador UP50H ultrasónico (Hielscher, tecnología de ultrasonido, Teltow, Alemania). A continuación, el material se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm y el sobrenadante se usó para transferencia Western. Veinticinco μg de proteína se hirvieron en tampón de muestra y agente reductor (Invitrogen) y posteriormente se separaron mediante SDS-PAGE usando 4-12% geles de poliacrilamida (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE health care). La membrana se bloqueó durante 1 h con TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM) que contenía 1% de caseína (Sigma-Aldrich) y 1% de Tris (1 M). Después del bloqueo, la membrana se incubó con ligera agitación durante la noche a 4ºC con el anticuerpo primario (conejo antihumano CBS 1/500, desarrollado en el laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EE. UU.). La incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HPR) (Dako) se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente. Todas las transferencias se desarrollaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Perkin Elmer).

Literatura/Referencias



Acerca de Western Blot

Las transferencias son procedimientos analíticos donde el ADN, el ARN y las proteínas se transfieren a un soporte de modo que puedan separarse.
La transferencia de Southern se utiliza para la detección de ADN, la transferencia de Northern para el ARN y la transferencia de Western de las proteínas.
transferencia de Western también se llama inmunotransferencia de proteínas porque se utiliza un anticuerpo para detectar específicamente a su antígeno. La transferencia Western es uno de los métodos de análisis más importantes para detectar proteínas específicas en la muestra. En la transferencia Western, las proteínas se inmovilizan sobre membranas para detectarlas usando anticuerpos monoclonales o policlonales.
Mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) las proteínas nativas se separan mediante una estructura 3-D o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido. Las proteínas se transfieren luego a una membrana (típicamente nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos específicos para la proteína diana. La etapa de electroforesis en gel se incluye en el análisis de transferencia Western para resolver el problema de la reactividad cruzada de los anticuerpos.
Posteriormente, las proteínas separadas se transfieren a una matriz (principalmente en una membrana de nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos. Los anticuerpos funcionan como una sonda y se seleccionan específicamente para la proteína diana. El análisis de la ubicación y la intensidad de la reacción específica revela detalles de expresión de las proteínas diana en la muestra dada. La transferencia de Western pudo detectar proteína diana que es tan baja como 1 ng debido a la alta resolución de la electroforesis en gel y la fuerte especificidad y alta sensibilidad del inmunoensayo. El método de Western blot se utiliza en biología molecular, bioquímica, inmunogenética y otros campos de investigación molecular.
Otras técnicas relacionadas incluyen el análisis dot blot, inmunohistoquímica e inmunocitoquímica donde se usan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células por inmunotinción, y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).