La ultrasonicación es una técnica fiable para fragmentar el ADN plasmídico. La amplitud controlable con precisión, el modo de pulsación y el control de la temperatura son las características más importantes de un ultrasonicador para la fragmentación no dañina del plásmido. Además, el uso de ciertos agentes ayuda a proteger contra la degradación del plásmido. Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones para la fragmentación controlada de plásmidos a partir de viales individuales, la sonicación simultánea de numerosas muestras, así como placas de múltiples pocillos. Obtenga más información sobre el éxito de la fragmentación ultrasónica de plásmidos.

Cizallamiento de plásmidos mediante ultrasonidos

Cuando las muestras de ADN se someten a ondas ultrasónicas, las vibraciones generadas por ultrasonidos crean cavitación acústica en el líquido que cizalla o rompe moléculas de ADN de alto peso molecular mediante fuerzas mecánicas. La sonicación es el método más utilizado para experimentos de cizallamiento de ADN a granel, incluidas aplicaciones como la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), para la que los tamaños de fragmento pequeños son absolutamente cruciales para obtener una alta resolución. (cf. Tseng et al., 2012)
El ADN plasmídico (ADNp) es una forma específica de ADN que se caracteriza por su forma anular y se encuentra en bacterias y algunos eucariotas.
El ADNp superenrollado es la forma deseada de ADN plasmídico, ya que ofrece los mejores resultados en procesos posteriores como la secuenciación automatizada y la transfección. La ultrasonicación es adecuada para fragmentar con éxito el ADNp, incluido el ADNp superenrollado.
Thompson et al. (2008) demostraron que la sonicación de plásmidos, que se sabe que fragmenta el ADN superenrollado, es una forma eficaz de mejorar las longitudes de lectura de la secuencia phred20 hasta el punto de que no son significativamente diferentes de la plantilla de control de Beckman Coulter o de los plásmidos linealizados enzimáticamente.

Uso de vectores plasmídicos

Los plásmidos se utilizan a menudo como herramientas para clonar, transferir y manipular genes. Cuando los plásmidos se utilizan experimentalmente para estos fines, se denominan vectores. Se pueden insertar fragmentos de ADN o genes en un vector plasmídico, creando el llamado plásmido recombinante. Los vectores plasmídicos se utilizan como vehículos para introducir ADN recombinante en una célula huésped y son un componente clave de la clonación molecular.
“Los vectores no virales se están estudiando ampliamente por su posible uso en terapia génica para tratar diversas enfermedades complicadas. Los vectores no virales protegen el ADN plasmídico contra la degradación física, química y enzimática y transportan la molécula de ADN al lugar de destino. Por ejemplo, los liposomas catiónicos, el quitosano y otras nanopartículas cargadas positivamente forman complejos con el ADN plasmídico mediante interacciones electrostáticas. Sin embargo, los complejos liposomas catiónicos/ADN plasmídico que se forman fácilmente son relativamente grandes (es decir, 300-400 nm) y heterogéneos por naturaleza, lo que dificulta su uso en aplicaciones farmacéuticas. Los complejos ADN plasmídico/liposomas, ADN plasmídico/aerosoles y ADN plasmídico/péptidos, grandes y heterogéneos, pueden reducirse a partículas más pequeñas y homogéneas mediante ultrasonidos.” (Sarker et al., 2019)
Un ejemplo destacado del uso de vectores plasmídicos es CRISPR-Cas9. El sistema CRISPR-Cas9 suele administrarse a las células en forma de un único plásmido de gran tamaño o de varios plásmidos más pequeños que codifican una secuencia diana, una guía CRISPR y Cas9.

Preparación por ultrasonidos de nanopartículas de PLGA cargadas con ADN mediante nanoprecipitación

Jo et al. (2020) utilizaron poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de formar un portador de nanopartículas para la entrega de un plásmido CRISPR-Cas9 modelo en macrófagos primarios derivados de médula ósea. Para la nanoprecipitación de las nanopartículas de PLGA, se utilizaron PLGA con dos grupos terminales diferentes (grupos éster y amina) con el objetivo de que los grupos terminales de amina cargados positivamente aumenten la eficacia de encapsulación y la carga debido a las interacciones de carga entre él y la columna vertebral cargada negativamente del ADN. En un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mL, se disolvieron 100 mg de Pluronic F127 en 20 mL de agua desionizada esterilizada en autoclave mediante mezcla en vórtex, seguida de 30 min de sonicación suave utilizando un baño ultrasónico (ver CupHorn). Se añadió una barra de agitación magnética esterilizada en autoclave y la solución se mezcló a 600 RPM durante 30 min mientras se preparaban las demás soluciones. Se utilizó material de laboratorio de plástico en lugar de vidrio para minimizar la adsorción inespecífica del ADN. Se prepararon por separado soluciones de PLGA disueltas en DMF (44,48 mg/ml) y de pentaceno TIPS disuelto en THF (0,667 mg/ml). El PLGA se dejó humedecer en DMF durante 30 minutos antes de sonicarlo durante 30 minutos (para el protocolo completo, véase Jo et al., 2020).

Protección del ADN plasmídico durante la sonicación

El ADN, incluidos los plásmidos y los plásmidos superenrollados, es muy sensible a la degradación. Todos los métodos de fragmentación disponibles presentan ciertas desventajas. La fragmentación ultrasónica del ADN es uno de los métodos preferidos, ya que la sonicación controlada en combinación con medidas de protección permite reducir el daño de las cadenas de ADN inducido por el cizallamiento y el calor.
Además de los ajustes de baja amplitud, el modo de pulsación y el control de la temperatura durante el cizallamiento ultrasónico del ADN, el uso de determinados agentes mostró un efecto protector significativo contra la degradación del ADN. Por ejemplo, varios polímeros, péptidos y lípidos protegen el ADN plasmídico durante la ultrasonicación.

Se investigó la estabilidad del ADN plasmídico y de los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL frente al cizallamiento ultrasónico mediante un ensayo de electroforesis en gel de agarosa. Tanto el ADN plasmídico como los nanocomplejos ADN plasmídico/IL se sometieron a cizallamiento ultrasónico durante diferentes periodos de tiempo. El ADN plasmídico se expuso a cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30 y 40 minutos. Sin embargo, los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL se expusieron a cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos.
(estudio e imagen: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demostraron que cuando las nanoestructuras de ADN plasmídico / líquido iónico (pADN/IL) se sometieron a tensión de cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 min y se acomplejaron con el agente de administración de genes catiónicos disponible comercialmente lipofectamina, el porcentaje de células positivas fluorescentes fue del 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% y 50%, respectivamente (véase el gráfico a continuación). El porcentaje de células fluorescentes positivas aumentó cuando las nanoestructuras se sometieron a cizallamiento ultrasónico durante 10 y 20 minutos, y después disminuyó lentamente.

Influencia del líquido iónico [Bmim][PF6] en el suministro de ADN plasmídico a células COS7. Los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL (líquido iónico) se sometieron a un esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante un máximo de 120 minutos y se complejaron con LA antes de su liberación en células COS7. Los datos muestran el número medio (%) de células HeLa positivas para GFP contadas en 10 campos microscópicos diferentes y el experimento se realizó varias veces en tres días distintos. (Estudio y gráfico: ©Sarker et al., 2019)

Preparación de lisados por ultrasonidos

Protocolo de lisis celular por ultrasonidos
Comience con una muestra enriquecida de células que se haya preparado mediante un método de separación celular (por ejemplo, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), centrifugación en gradiente de densidad, aislamiento celular por inmunodensidad).
Las muestras celulares deben presentar un volumen de tampón de lisis apropiado para el objetivo experimental y el ultrasonicador tipo sonda.
Se prefieren los tampones hipotónicos, ya que mejoran la lisis celular por ultrasonidos. Es importante que los aditivos y la concentración de sal se utilicen de forma adecuada.
Seleccione su dispositivo de lisis ultrasónica: Para la sonicación indirecta de viales, se recomienda el VialTweeter o el CupHorn. Para placas multipocillo, el UIP400MTP es el ultrasonicador ideal. Y para la sonicación clásica tipo sonda, un homogeneizador ultrasónico como el UP100H o el UP200Ht con una micro-punta son los más adecuados.
Protocolo de sonicación tipo sonda: Coloque la sonda del ultrasonicador en el volumen de muestra de un tubo de microcentrífuga y sonique durante unos 10 segundos. Dependiendo de la muestra de ADN, la sonicación puede repetirse una o dos veces más. La entrada de energía ultrasónica necesaria (Ws/mL) depende de la viscosidad de la muestra y del tipo de ADN. La refrigeración mediante baño de hielo y el modo de pulsación del ultrasonicador ayudan a evitar que la muestra se degrade térmicamente.
Tras la lisis ultrasónica, la muestra se centrifuga para separar los restos de pellets (que contienen células no lisadas, núcleos y orgánulos no lisados)
Si la muestra no se procesa inmediatamente, puede conservarse a una temperatura adecuada para preservar su viabilidad.

Ultrasonidos para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas diferentes plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras de múltiples tubos o placas de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas de microtitulación), sonorreactores y cóforos ultrasónicos. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN funcionan con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento y frecuencia sintonizada, que se controlan con precisión y ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos para cualquier número y tamaño de muestra

Con los ultrasonicadores multimuestra de Hielscher VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo) es posible reducir fácilmente el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtiene la distribución de tamaños de fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que los pasos de preparación de plásmidos sean eficientes, fiables y escalables. Los protocolos pueden escalarse linealmente de una a numerosas muestras aplicando parámetros de ultrasonidos constantes.
Los ultrasonicadores de sonda con uno a cinco dedos son ideales para la preparación de un menor número de muestras. Los ultrasonicadores de laboratorio de Hielscher están disponibles con diferentes niveles de potencia para que pueda elegir el disruptor ultrasónico ideal para su aplicación relacionada con el ADN.