Preparación de plásmidos mediante ultrasonidos

La ultrasonicación es una técnica fiable para fragmentar el ADN plasmídico. La amplitud controlable con precisión, el modo de pulsación y el control de la temperatura son las características más importantes de un ultrasonido para la fragmentación no dañina del plásmido. Además, el uso de ciertos agentes ayuda a proteger contra la degradación del plásmido. Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para la fragmentación controlada de plásmidos a partir de viales individuales, la sonicación simultánea de numerosas muestras, así como de placas de múltiples pocillos. Aprenda más sobre el éxito de la fragmentación de plásmidos por ultrasonidos.

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La fragmentación ultrasónica del ADN es una técnica fiable y eficaz que se utiliza habitualmente en la secuenciación de próxima generación (NGS)

El UIP400MTP permite la ultrasonificación controlada con precisión de placas de varios pocillos. Una de las aplicaciones del UIP400MTP es la fragmentación de ADN plasmídico para obtener fragmentos de una longitud específica.

Cizallamiento de plásmidos mediante ultrasonidos

Cuando las muestras de ADN se someten a ondas ultrasónicas, las vibraciones generadas por los ultrasonidos crean una cavitación acústica en el líquido que corta o rompe las moléculas de ADN de alto peso molecular mediante fuerzas mecánicas. La sonicación es el método más utilizado para los experimentos de cizallamiento del ADN a granel, incluyendo aplicaciones como la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), para la que los tamaños de fragmentos pequeños son absolutamente cruciales para obtener una alta resolución. (cf. Tseng et al., 2012)
El ADN plasmídico (ADNp) es una forma específica de ADN, caracterizada por su forma de anillo, que se encuentra en las bacterias y en algunos eucariotas.
El ADNp superenrollado es la forma deseada de ADN plasmídico, ya que muestra los mejores resultados en los procesos posteriores, como la secuenciación y la transfección automatizadas. La ultrasonicación es adecuada para fragmentar el ADNp, incluido el ADNp superenrollado, con éxito.
Thompson et al. (2008) demostraron que la sonicación de plásmidos, que se sabe que fragmenta el ADN superenrollado, es una forma eficaz de mejorar las longitudes de lectura de la secuencia phred20 hasta el punto de que no son significativamente diferentes de la plantilla de control de Beckman Coulter o de los plásmidos linealizados enzimáticamente.

Ventajas de la fragmentación ultrasónica del ADN

  • Precisamente controlable
  • Resultados reproducibles
  • Ajustable a las longitudes de los fragmentos de ADN objetivo
  • control de temperatura
  • Escalable a cualquier tamaño de muestra
El vídeo muestra el sistema de preparación de muestras por ultrasonidos UIP400MTP, que permite la preparación fiable de muestras en cualquier placa multipocillo estándar mediante ultrasonidos de alta intensidad. Las aplicaciones típicas del UIP400MTP incluyen la lisis celular, el cizallamiento de ADN, ARN y cromatina, así como la extracción de proteínas.

Ultrasonidos UIP400MTP para la sonicación de placas multipozo

Uso de vectores plasmídicos

Los plásmidos se utilizan a menudo como herramientas para clonar, transferir y manipular genes. Cuando los plásmidos se utilizan experimentalmente para estos fines, se denominan vectores. Se pueden insertar fragmentos de ADN o genes en un vector plasmídico, creando el llamado plásmido recombinante. Los vectores plasmídicos se utilizan como vehículos para introducir el ADN recombinante en una célula huésped y son un componente clave de la clonación molecular.
“Los vectores no virales se están estudiando ampliamente por su posible uso en la terapia génica para tratar diversas enfermedades complicadas. Los vectores no virales protegen el ADN plasmídico contra la degradación física, química y enzimática y llevan la molécula de ADN al lugar de destino. Por ejemplo, los liposomas catiónicos, el quitosano y otras nanopartículas con carga positiva forman complejos con el ADN plasmídico mediante interacciones electrostáticas. Sin embargo, los complejos liposomas catiónicos/ADN plasmídico que se forman fácilmente son relativamente grandes (es decir, 300-400 nm) y heterogéneos por naturaleza, lo que dificulta su uso en aplicaciones farmacéuticas. Los complejos ADN plasmídico/liposomas, ADN plasmídico/aerosoles y ADN plasmídico/péptidos, grandes y heterogéneos, pueden reducirse a partículas más pequeñas y homogéneas mediante ultrasonidos.” (Sarker et al., 2019)
Un ejemplo destacado del uso de vectores plasmídicos es CRISPR-Cas9. El sistema CRISPR-Cas9 suele introducirse en las células en forma de un único plásmido de gran tamaño o de varios plásmidos más pequeños que codifican una secuencia objetivo, una guía CRISPR y Cas9.

Preparación por ultrasonidos de nanopartículas de PLGA cargadas de ADN mediante nanoprecipitación

Jo et al. (2020) utilizaron poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de formar un portador de nanopartículas para la entrega de un plásmido CRISPR-Cas9 modelo en macrófagos primarios derivados de la médula ósea. Para la nanoprecipitación de las nanopartículas de PLGA, se utilizó PLGA con dos grupos finales diferentes (grupos éster y amina) con el objetivo de que las tapas finales de amina con carga positiva aumenten la eficiencia de encapsulación y la carga debido a las interacciones de carga entre ella y la columna vertebral del ADN con carga negativa. En un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mL, se disolvieron 100 mg de Pluronic F127 en 20 mL de agua destilada en autoclave mediante una mezcla en vórtex, seguida de 30 minutos de sonicación suave utilizando un baño de ultrasonidos (ver CupHorn). Se añadió una barra de agitación magnética esterilizada en autoclave y la solución se mezcló a 600 RPM durante 30 minutos mientras se hacían las otras soluciones. Se utilizó material de laboratorio de plástico en lugar de cristal para minimizar la adsorción inespecífica del ADN. Se hicieron por separado soluciones de PLGA disueltas en DMF (44,48 mg/ml) y de pentaceno TIPS disuelto en THF (0,667 mg/ml). El PLGA se dejó humedecer en DMF durante 30 minutos antes de ser sonicado durante 30 minutos (para el protocolo completo véase Jo et al., 2020)

Aplicaciones relacionadas:

  • Extracción de ADN
  • Encapsulación del ADN
  • Dispersión del ADN recubierto de nanopartículas
  • Entrega de ADN plasmídico en las células
UP200St TD_CupHorn para la sonicación indirecta de muestras

El UP200St CupHorn para la sonicación indirecta de muestras, por ejemplo, para la extracción y fragmentación del ADN.

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Protección del ADN plasmídico durante la sonicación

El ADN, incluidos los plásmidos y los plásmidos superenrollados, es muy sensible a la degradación. Todos los métodos de fragmentación disponibles tienen ciertas desventajas. La fragmentación ultrasónica del ADN es uno de los métodos preferidos, ya que la sonicación controlada en combinación con medidas de protección permite reducir el daño inducido por el cizallamiento y el calor de las cadenas de ADN.
Además de los ajustes de baja amplitud, el modo de pulsación y el control de la temperatura durante el cizallamiento ultrasónico del ADN, el uso de ciertos agentes mostró un efecto protector significativo contra la degradación del ADN. Por ejemplo, varios polímeros, péptidos y lípidos protegen el ADN plasmídico durante la ultrasonicación.

Los líquidos iónicos pueden proteger el ADN del plásmido contra daños durante la sonicación.

Se investigó la estabilidad del ADN plasmídico y de los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL frente al estrés por cizallamiento ultrasónico mediante un ensayo de electroforesis en gel de agarosa. Tanto el ADN plasmídico como los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL fueron sometidos a estrés por cizallamiento ultrasónico durante diferentes puntos de tiempo. El ADN plasmídico se expuso al esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30 y 40 minutos. Sin embargo, los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL se expusieron a la tensión de cizallamiento ultrasónica durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos.
(estudio y foto: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demostraron que cuando las nanoestructuras de ADN plasmídico/líquido iónico (pADN/IL) se sometieron a una tensión de cizallamiento ultrasónica durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 min y se acomplejaron con el agente de administración de genes catiónicos disponible en el mercado lipofectamina, el porcentaje de células positivas fluorescentes fue del 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% y 50%, respectivamente (véase el gráfico siguiente). El porcentaje de células fluorescentes positivas aumentó cuando las nanoestructuras se sometieron a un esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 10 y 20 minutos, y después disminuyó lentamente.

Fragmentación ultrasónica del ADN plasmídico

Influencia del líquido iónico [Bmim][PF6] en el suministro de ADN plasmídico a las células COS7. Los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL (líquido iónico) se sometieron a un esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante un máximo de 120 minutos y se acomplejaron con LA antes de entregarlos a las células COS7. Los datos muestran el número medio (%) de células HeLa positivas a la GFP contadas en 10 campos microscópicos diferentes y el experimento se realizó varias veces en tres días diferentes. (Estudio y gráfico: ©Sarker et al., 2019)

El ADN plasmídico puede protegerse añadiendo un agente antes de la fragmentación por ultrasonidos.

El ADN plasmídico puede protegerse añadiendo un agente antes de la fragmentación por ultrasonidos: Degradación inducida por la sonicación del ADNp desnudo (A) y del ADNp formulado con 1,5 mM de CaCl2 y 20% (v/v) de t-butanol (B)
Las muestras se sonicaron con una sonda de 20W durante un máximo de 120s, como se indica en la parte superior de cada carril. El carril H corresponde al marcador Hyperladder I ™️. Se indican las bandas del plásmido OC y SC.
(estudio e imágenes: ©Wu et al., 2009)

Preparación de lisados por ultrasonidos

Protocolo de lisis celular por ultrasonidos
Ultrasonicador UP200Ht con microtip S26d2 para la lisis ultrasónica de muestras biológicasComience con una muestra enriquecida de células que haya sido preparada mediante un método de separación celular (por ejemplo, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), centrifugación en gradiente de densidad, aislamiento celular por inmunodensidad).
Las muestras celulares deben presentar un volumen de tampón de lisis adecuado al objetivo experimental y al ultrasonido tipo sonda.
Se prefieren los tampones hipotónicos porque mejoran la lisis celular por ultrasonidos. Es importante que los aditivos y la concentración de sal se utilicen de forma adecuada.
Seleccione su dispositivo de lisis ultrasónica: Para la sonicación indirecta de viales, se recomienda el VialTweeter o el CupHorn. Para las placas multipocillos, el UIP400MTP es el ultrasonido ideal. Y para la sonicación clásica de tipo sonda, un homogeneizador ultrasónico como el UP100H o el UP200Ht con una micropunta son los más adecuados.
Protocolo de sonicación tipo sonda: Coloque la sonda del ultrasonido en el volumen de la muestra en un tubo de microcentrífuga y sonique durante aproximadamente 10 segundos. Dependiendo de la muestra de ADN, la sonicación puede repetirse una o dos veces más. La energía ultrasónica necesaria (Ws/mL) depende de la viscosidad de la muestra y del tipo de ADN. El enfriamiento mediante un baño de hielo y el modo de pulsación del ultrasonido ayudan a evitar que la muestra se degrade térmicamente.
Después de la lisis ultrasónica, la muestra se centrifuga para separar los restos de pellets (que contienen células no lisadas, núcleos y orgánulos no lisados)
Si la muestra no se procesa inmediatamente, puede almacenarse a una temperatura adecuada para preservar su viabilidad.

Ultrasonidos para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece varias plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas diferentes plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras en múltiples tubos o placas de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de 96 pocillos, placas de microtitulación), sonoreactores y cúpulas ultrasónicas. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN están equipadas con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento y frecuencia ajustada, que se pueden controlar con precisión y ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores de ultrasonidos para cualquier número y tamaño de muestra

Con los ultrasonidos multimuestra de Hielscher VialTweeter (para hasta 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo) es posible reducir fácilmente el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtiene la distribución de tamaños de fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que los pasos de preparación de plásmidos sean eficientes, fiables y escalables. Los protocolos pueden escalarse linealmente desde una hasta numerosas muestras aplicando parámetros de ultrasonidos constantes.
Los ultrasonidos de sonda con uno a cinco dedos son ideales para la preparación de un número menor de muestras. Los ultrasonidos de laboratorio de Hielscher están disponibles con diferentes niveles de potencia para que pueda elegir el disruptor ultrasónico ideal para su aplicación relacionada con el ADN.

El VialTweeter es un ultrasonido multimuestra que permite una preparación fiable de las muestras en condiciones de temperatura controladas con precisión.

La unidad de preparación de muestras múltiples por ultrasonidos VialTweeter permite la sonicación simultánea de hasta 10 viales. Con el dispositivo de sujeción VialPress, se pueden presionar hasta 4 tubos adicionales en la parte delantera para una sonicación intensa.

control de proceso exacto

Los ultrasonidos de Hielscher pueden controlarse a distancia a través de un navegador. Los parámetros de sonicación se pueden supervisar y ajustar con precisión a los requisitos del proceso.Los ajustes de sonicación controlables con precisión son cruciales, ya que una sonificación exhaustiva puede destruir el ADN, el ARN y la cromatina, pero un cizallamiento ultrasónico inadecuado da lugar a fragmentos de ADN y cromatina demasiado largos. Los ultrasonidos digitales de Hielscher pueden ajustarse fácilmente con parámetros de sonicación precisos. Los ajustes de sonicación específicos también pueden guardarse como ajustes programados para repetir rápidamente el mismo procedimiento.
Todas las sonicaciones se protocolizan automáticamente y se almacenan como archivo CSV en una tarjeta SD integrada. Esto permite una documentación precisa de los ensayos realizados y hace posible la revisión de las ejecuciones de sonicación fácilmente.
Mediante el control remoto por navegador, todos los ultrasonidos digitales pueden manejarse y supervisarse a través de cualquier navegador estándar. No se requiere la instalación de software adicional, ya que la conexión LAN es una configuración plug-n-play muy sencilla.

Máxima facilidad de uso durante la preparación del ADN por ultrasonidos

Todos los ultrasonidos de Hielscher están diseñados para ofrecer ultrasonidos de alto rendimiento y, al mismo tiempo, son muy fáciles de usar y de manejar. Todos los ajustes están bien estructurados en un menú claro, al que se puede acceder fácilmente a través de la pantalla táctil de color o del mando a distancia del navegador. El software inteligente con ajustes programables y registro automático de datos garantiza unos ajustes de sonicación óptimos para obtener resultados fiables y reproducibles. La interfaz de menú limpia y fácil de usar convierte a los ultrasonidos de Hielscher en dispositivos fáciles de usar y eficientes.
La siguiente tabla le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonidos de laboratorio para la lisis celular y la fragmentación del ADN:

Volumen del lote Tasa de flujo Dispositivos recomendados
placas multipocillos n/a UIP400MTP
frascos, vaso pequeño n/a CupHorn ultrasónico
hasta 10 viales n/a VialTweeter
1 a 500 mL 10 a 200 mL/min. UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL/min. UP200Ht, UP400St

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Literatura / Referencias

Información interesante

¿Qué son los plásmidos?
Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que está físicamente separada del ADN cromosómico y se replica de forma independiente. Los plásmidos suelen estar asociados a genes que contribuyen a la supervivencia de un organismo y le confieren ventajas específicas, como la resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se encuentran más comúnmente como pequeñas moléculas de ADN circular de doble cadena en las bacterias; sin embargo, los plásmidos están a veces presentes en las arqueas y los organismos eucariotas. Los plásmidos son herramientas importantes en biología molecular, genética, bioquímica y ciencias de la vida. Conocidos como vectores en ingeniería genética, los plásmidos se utilizan para replicar o expresar determinados genes. La alteración selectiva de un vector se denomina diseño de vectores.

Análisis de GFP en la investigación celular
La proteína verde fluorescente (GFP) es un marcador biológico versátil para monitorizar procesos fisiológicos, visualizar la localización de proteínas y detectar la expresión transgénica in vivo. La GFP puede ser excitada por la línea láser de 488 nm y se detecta de forma óptima a 510 nm.


Ultrasonidos de alto rendimiento La gama de productos de Hielscher cubre todo el espectro, desde el ultrasonido compacto de laboratorio, pasando por las unidades de sobremesa, hasta los sistemas de ultrasonidos totalmente industriales.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.