Preparación de plásmidos mediante ultrasonicación

La ultrasonicación es una técnica fiable para fragmentar el ADN plasmídico. Una amplitud controlable con precisión, el modo pulsado y el control de la temperatura son las características más importantes de un ultrasonicador para fragmentar plásmidos sin dañarlos. Además, el uso de determinados agentes ayuda a protegerlos frente a la degradación. Hielscher Ultrasonics ofrece diversas soluciones para la fragmentación controlada de plásmidos, desde viales individuales hasta la sonicación simultánea de numerosas muestras y placas multipocillo. ¡Descubra cómo lograr una fragmentación ultrasónica eficaz de plásmidos!

Cizallamiento de plásmidos mediante ultrasonicación

Cuando las muestras de ADN se someten a ondas ultrasónicas, las vibraciones generadas por los ultrasonidos crean cavitación acústica en el líquido, que cizalla o rompe las moléculas de ADN de alto peso molecular mediante fuerzas mecánicas. La sonicación es el método más utilizado en experimentos de cizallamiento de ADN a gran escala, incluidas aplicaciones como la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), para las que los fragmentos de pequeño tamaño son absolutamente cruciales para obtener una alta resolución. (véase Tseng et al., 2012)
El ADN plasmídico (pDNA) es una forma específica de ADN, caracterizada por su forma de anillo, que se encuentra en bacterias y algunos eucariotas.
El pDNA superenrollado es la forma deseada del ADN plasmídico, ya que proporciona los mejores resultados en procesos posteriores, como la secuenciación automatizada y la transfección. La ultrasonicación es adecuada para fragmentar eficazmente el pDNA, incluido el pDNA superenrollado.
Thompson et al. (2008) demostraron que la sonicación de plásmidos, que se sabe que fragmenta el ADN superenrollado, es una forma eficaz de mejorar las longitudes de lectura de secuencias con calidad phred20 hasta el punto de que no difieren significativamente de las obtenidas con el molde de control de Beckman Coulter o con plásmidos linealizados enzimáticamente.

Uso de vectores plasmídicos

Los plásmidos se utilizan a menudo como herramientas para clonar, transferir y manipular genes. Cuando los plásmidos se utilizan experimentalmente con estos fines, se denominan vectores. Los fragmentos de ADN o los genes pueden insertarse en un vector plasmídico, creando lo que se conoce como un plásmido recombinante. Los vectores plasmídicos se utilizan como vehículos para introducir ADN recombinante en una célula huésped y son un componente clave de la clonación molecular.
«Los vectores no virales se están estudiando ampliamente por su posible uso en terapia génica para tratar diversas enfermedades complejas. Los vectores no virales protegen el ADN plasmídico frente a la degradación física, química y enzimática y transportan la molécula de ADN al sitio objetivo. Por ejemplo, los liposomas catiónicos, el quitosano y otras nanopartículas con carga positiva forman complejos con el ADN plasmídico mediante interacciones electrostáticas. Sin embargo, los complejos de liposomas catiónicos/ADN plasmídico que se forman con facilidad son relativamente grandes (es decir, 300–400 nm) y de naturaleza heterogénea, lo que dificulta su uso en aplicaciones farmacéuticas. Los complejos grandes y heterogéneos de ADN plasmídico/liposomas, ADN plasmídico/aerosoles y ADN plasmídico/péptidos pueden reducirse a partículas más pequeñas y homogéneas mediante ultrasonicación.» (Sarker et al., 2019)
Un ejemplo destacado del uso de vectores plasmídicos es CRISPR–Cas9. El sistema CRISPR–Cas9 suele introducirse en las células como un único plásmido grande o como varios plásmidos más pequeños que codifican una secuencia objetivo, una guía CRISPR y Cas9.

Preparación ultrasónica de nanopartículas de PLGA cargadas con ADN mediante nanoprecipitación

Jo et al. (2020) utilizaron poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para formar un vehículo nanoparticulado destinado a introducir un plásmido modelo CRISPR–Cas9 en macrófagos primarios derivados de médula ósea. Para la nanoprecipitación de las nanopartículas de PLGA, se utilizó PLGA con dos grupos terminales diferentes (grupos éster y amina), con el objetivo de que los grupos terminales amina con carga positiva aumentaran la eficiencia de encapsulación y la carga gracias a las interacciones electrostáticas entre estos grupos y el esqueleto del ADN, con carga negativa. En un tubo cónico de centrifugación de polipropileno de 50 mL, se disolvieron 100 mg de Pluronic F127 en 20 mL de agua desionizada esterilizada en autoclave mediante agitación con vórtex, seguida de 30 min de sonicación suave en un baño ultrasónico (véase CupHorn). Se añadió una barra de agitación magnética esterilizada en autoclave y la solución se agitó a 600 RPM durante 30 min mientras se preparaban las demás soluciones. Durante todo el procedimiento se utilizó material de laboratorio de plástico en lugar de vidrio para minimizar la adsorción inespecífica del ADN. Se prepararon por separado soluciones de PLGA disuelto en DMF (44,48 mg/ ml) y de pentaceno TIPS disuelto en THF (0,667 mg/ml). El PLGA se dejó humectar en DMF, en reposo, durante 30 min antes de someterlo a sonicación durante 30 min. (para consultar el protocolo completo, véase Jo et al., 2020)

Protección del ADN plasmídico durante la sonicación

El ADN, incluidos los plásmidos y los plásmidos superenrollados, es muy susceptible a la degradación. Todos los métodos de fragmentación disponibles presentan ciertos inconvenientes conocidos. La fragmentación ultrasónica del ADN es uno de los métodos preferidos, ya que la sonicación controlada, combinada con medidas de protección, permite reducir el daño de las hebras de ADN inducido por el cizallamiento y el calor.
Además de los ajustes de baja amplitud, el modo pulsado y el control de la temperatura durante el cizallamiento ultrasónico del ADN, el uso de determinados agentes mostró un efecto protector significativo frente a la degradación del ADN. Por ejemplo, diversos polímeros, péptidos y lípidos protegen el ADN plasmídico durante la ultrasonicación.

La estabilidad del ADN plasmídico y de los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL frente al esfuerzo de cizallamiento ultrasónico se investigó mediante un ensayo de electroforesis en gel de agarosa. Tanto el ADN plasmídico como los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL se sometieron a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante distintos tiempos. El ADN plasmídico se expuso a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30 y 40 minutos. Por su parte, los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL se expusieron a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos.
(estudio e imagen: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demostraron que, cuando las nanoestructuras de ADN plasmídico / líquido iónico (pDNA/IL) se sometieron a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 min y se complejaron con lipofectamina, un agente catiónico comercial para la transferencia génica, los porcentajes de células positivas para fluorescencia fueron del 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% y 50%, respectivamente (véase el gráfico siguiente). El porcentaje de células positivas para fluorescencia aumentó cuando las nanoestructuras se sometieron a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante 10 y 20 min, y después disminuyó lentamente.

Influencia del líquido iónico [Bmim][PF6] en la introducción de ADN plasmídico en células COS7. Los nanocomplejos de ADN plasmídico/IL (líquido iónico) se sometieron a esfuerzo de cizallamiento ultrasónico durante un máximo de 120 minutos y se complejaron con LA antes de introducirlos en células COS7. Los datos muestran el número medio (%) de células HeLa positivas para GFP contadas en 10 campos microscópicos diferentes, y el experimento se realizó varias veces en tres días distintos. (Estudio y gráfico: ©Sarker et al., 2019)

Preparación ultrasónica de lisados

Protocolo de lisis celular ultrasónica
Comience con una muestra enriquecida de células preparada mediante un método de separación celular (por ejemplo, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), centrifugación en gradiente de densidad o aislamiento celular por inmunodensidad).
Las muestras celulares deben contener un volumen de tampón de lisis adecuado para el objetivo experimental y el ultrasonicador de sonda.
Se prefieren los tampones hipotónicos, ya que favorecen la lisis celular ultrasónica. Es importante utilizar adecuadamente los aditivos y la concentración de sales.
Seleccione su dispositivo de lisis ultrasónica: para la sonicación indirecta de viales, se recomiendan el VialTweeter o el CupHorn. Para las placas multipocillo, el UIP400MTP es el ultrasonicador ideal. Para la sonicación clásica con sonda, lo más adecuado es un homogeneizador ultrasónico como el UP100H o el UP200Ht con micropunta.
Protocolo de sonicación con sonda: Introduzca la sonda del ultrasonicador en el volumen de muestra contenido en un tubo de microcentrífuga y aplique sonicación durante aproximadamente 10 segundos. Según la muestra de ADN, la sonicación puede repetirse una o dos veces más. El aporte de energía ultrasónica necesario (Ws/mL) depende de la viscosidad de la muestra y del tipo de ADN. La refrigeración mediante un baño de hielo y el modo pulsado del ultrasonicador ayudan a evitar la degradación térmica de la muestra.
Tras la lisis ultrasónica, la muestra se centrifuga para separar los restos del sedimento (que contiene células sin lisar, núcleos y orgánulos sin lisar).
Si la muestra no se procesa inmediatamente después, puede almacenarse a una temperatura adecuada para preservar su viabilidad.

Ultrasonicadores para la fragmentación del ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece diversas plataformas basadas en ultrasonidos para la fragmentación de ADN, ARN y cromatina. Estas plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones de sonicación indirecta para la preparación simultánea de muestras en varios tubos o placas multipocillo (por ejemplo, placas de 96 pocillos y placas de microtitulación), sonorreactores y CupHorn ultrasónicos. Todas las plataformas para el cizallamiento del ADN funcionan con procesadores ultrasónicos de alto rendimiento sintonizados en frecuencia, que permiten un control preciso y proporcionan resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos para cualquier número y tamaño de muestras

Con los ultrasonicadores para múltiples muestras de Hielscher, VialTweeter (para un máximo de 10 tubos de ensayo) y UIP400MTP (para microplacas/placas multipocillo), resulta sencillo reducir el tiempo de procesamiento de las muestras gracias a una ultrasonicación intensa y controlable con precisión, al tiempo que se obtienen la distribución de tamaños de los fragmentos de ADN y el rendimiento deseados. La fragmentación ultrasónica del ADN hace que las etapas de preparación de plásmidos sean eficientes, fiables y escalables. Los protocolos pueden escalarse linealmente de una a numerosas muestras aplicando parámetros ultrasónicos constantes.
Los ultrasonicadores de sonda con entre uno y cinco dedos son ideales para preparar un número reducido de muestras. Los ultrasonicadores de laboratorio de Hielscher están disponibles con distintos niveles de potencia, de modo que puede elegir el disruptor ultrasónico ideal para su aplicación relacionada con el ADN.