Preparación de muestras asistida por filtración (FASP) con ultrasonidos: mejora de los flujos de trabajo proteómicos mediante sonicación avanzada
La preparación de muestras asistida por filtración (FASP) con ultrasonidos está consolidándose como un método muy eficiente y reproducible en la proteómica moderna. Al integrar la sonicación controlada en los flujos de trabajo de FASP establecidos, los investigadores pueden mejorar significativamente la extracción de proteínas, la eficiencia de la digestión y la calidad general de los datos. Ante la creciente demanda de una preparación de muestras reproducible y de alta capacidad de procesamiento, los sonicadores que aplican ultrasonidos focalizados, como el sonicador de microplacas UIP400MTP, están adquiriendo relevancia científica y práctica.
Contexto científico: por qué la FASP es importante en proteómica
La preparación de muestras asistida por filtración (FASP) se ha convertido en un método de referencia en la proteómica bottom-up gracias a su capacidad para eliminar detergentes, sales y otros contaminantes, al tiempo que permite una digestión enzimática eficiente. Sin embargo, los protocolos clásicos de FASP suelen presentar limitaciones relacionadas con una lisis incompleta, una digestión poco uniforme y la variabilidad de las muestras – especialmente al trabajar con células o tejidos biológicos complejos o resistentes.
Es aquí donde la energía ultrasónica focalizada (sonicación) ofrece una ventaja decisiva. Al introducir fuerzas mecánicas de cizallamiento y cavitación, la sonicación mejora varias etapas críticas del flujo de trabajo de FASP sin comprometer la integridad de las proteínas.
Sonicador de placas multipocillo UIP400MTP facilita la preparación de muestras asistida por filtración (FASP)
Efectos positivos de la sonicación en la FASP con ultrasonidos
La sonicación introduce cavitación acústica controlada – formación y colapso de burbujas microscópicas – que genera fuerzas de cizallamiento localizadas y microcorrientes.
La sonicación mejora tanto la etapa de alquilación como la de digestión en la FASP con ultrasonidos al mejorar la transferencia de masa y acelerar la cinética de las reacciones. La aplicación de energía ultrasónica genera cavitación, que da lugar a microcorrientes localizadas y fuerzas transitorias de cizallamiento que favorecen una mezcla rápida y una penetración eficiente de los reactivos en la matriz proteica o en el entorno del filtro. Durante la alquilación, esto permite una modificación más uniforme y rápida de los residuos de cisteína por la yodoacetamida. En la etapa de digestión, la sonicación aumenta la accesibilidad de los sitios de escisión proteolítica y mejora las interacciones enzima–sustrato, acelerando así la actividad de la tripsina y mejorando la eficiencia de la digestión. En conjunto, el tratamiento ultrasónico reduce el tiempo de procesamiento y mantiene o mejora el grado de finalización de las reacciones y su reproducibilidad.
En la preparación de muestras para proteómica, la FASP con ultrasonidos se traduce en:
- Ruptura celular y extracción de proteínas más eficientes, incluso en tejidos resistentes o muestras microbianas
- Mayor solubilización de las proteínas
- Mayor accesibilidad de las enzimas durante la digestión
- Menor tiempo de procesamiento y mayor reproducibilidad
A diferencia de los métodos convencionales de lisis mecánica o química, el procesamiento ultrasónico ofrece un alto grado de control y es escalable, por lo que resulta especialmente adecuado para flujos de trabajo proteómicos estandarizados.
Ventajas de la FASP con ultrasonidos frente a los métodos convencionales
La integración de la sonicación en los protocolos de FASP aporta beneficios medibles que repercuten directamente en los resultados de la espectrometría de masas posterior.
La FASP con ultrasonidos permite una recuperación más completa de las proteínas, especialmente de muestras difíciles, como tejidos fibrosos o biopelículas. La distribución uniforme de la energía garantiza un tratamiento homogéneo entre réplicas y reduce la variabilidad – un requisito esencial para la proteómica cuantitativa.
Además, la sonicación acelera la cinética de la digestión al mejorar la interacción enzima–sustrato. Esto suele traducirse en tiempos de digestión más cortos y un mayor rendimiento de péptidos, manteniendo la cobertura de secuencia.
Desde el punto de vista del flujo de trabajo, los sistemas ultrasónicos reducen la intervención manual y eliminan la necesidad de tratamientos químicos agresivos, preservando la integridad de las muestras y simplificando la estandarización de los protocolos.
Diagrama de Venn que muestra el aumento del número de proteínas identificadas mediante FASP con ultrasonidos en comparación con FASP con incubación durante la noche
Imagen y estudio: ©Carvalho et al., 2020
Sonicador de placas multipocillo UIP400MTP para la preparación de muestras asistida por filtración (FASP)
Protocolo: FASP con ultrasonidos de alta capacidad de procesamiento con el UIP400MTP
Para los laboratorios que procesan grandes conjuntos de muestras, el sonicador de microplacas UIP400MTP permite la sonicación simultánea de placas multipocillo estándar (p. ej., placas de 96 pocillos), lo que aumenta significativamente la capacidad de procesamiento y la reproducibilidad.
En este formato, las muestras (habitualmente 50–200 µL por pocillo) se preparan directamente en microplacas compatibles con la ultrafiltración o el procesamiento posterior. Los tampones de lisis son similares a los utilizados en los protocolos estándar de FASP.
El UIP400MTP aplica energía ultrasónica uniforme en todos los pocillos. La sonicación suele realizarse a una amplitud del 60–80% durante 2–4 minutos, según el tipo de muestra. Controle la temperatura mediante el sensor de temperatura conectable. Utilice sonicación pulsada y, opcionalmente, un refrigerador de laboratorio.
Protocolo de ejemplo:
- Para la etapa de alquilación, las muestras se sonican con el sonicador de microplacas (UIP400MTP) a una amplitud del 40% durante 7 ciclos (30 s de sonicación, 15 s de pausa; tiempo total de sonicación: 5 min 45 s).
- Tras la sonicación, la solución de yodoacetamida (IAA) se elimina mediante centrifugación. Antes de la digestión con tripsina, las muestras deben lavarse para eliminar la urea residual, un potente agente caotrópico que inhibe la actividad enzimática. Por ello, las muestras se lavan dos veces con 200 μL de bicarbonato de amonio (AmBic) 25 mM.
- A continuación, se añaden 100 μL de solución de tripsina (proporción enzima/proteína de 1:30) preparada en bicarbonato de amonio 12,5 mM. La digestión de las proteínas se realiza entonces con el UIP400MTP en las mismas condiciones de sonicación (amplitud del 40%, 7 ciclos, 30 s de sonicación / 15 s de pausa; tiempo total: 5 min 45 s).
- Tras la sonicación, las muestras se transfieren a placas de filtración o se procesan mediante sistemas de FASP basados en placas. Las etapas de reducción y alquilación se realizan en la propia placa, manteniendo un flujo de trabajo ágil.
- La digestión con tripsina se realiza en condiciones controladas (p. ej., 37 °C, 4–16 horas), con la opción de aplicar una breve estimulación ultrasónica para acelerar la actividad enzimática y mejorar el rendimiento de péptidos.
- Los péptidos se recuperan mediante centrifugación y quedan listos para el análisis por LC-MS/MS.
La principal ventaja de este sistema reside en su capacidad para proporcionar condiciones de procesamiento idénticas en todos los pocillos, minimizando los efectos de lote y permitiendo comparaciones cuantitativas robustas en estudios proteómicos a gran escala.
El sonicador multitubo VialTweeter acelera y mejora la preparación de muestras asistida por filtración (FASP) en proteómica
Relevancia científica
La integración de la sonicación en los flujos de trabajo de FASP no es simplemente un perfeccionamiento técnico – representa un avance metodológico en la preparación de muestras para proteómica. A medida que el campo avanza hacia una mayor capacidad de procesamiento, automatización y reproducibilidad, las tecnologías ultrasónicas resuelven cuellos de botella fundamentales en el procesamiento de muestras.
Los estudios recientes destacan cada vez más la importancia de una preparación uniforme de las muestras para el descubrimiento fiable de biomarcadores y la proteómica cuantitativa. La FASP con ultrasonidos contribuye directamente a este objetivo al mejorar la eficiencia de la extracción, la uniformidad de la digestión y la robustez general del flujo de trabajo.
Además, la escalabilidad de los sistemas ultrasónicos – desde viales individuales con el VialTweeter hasta microplacas completas con el UIP400MTP – responde a la creciente demanda de estudios proteómicos tanto exploratorios como con grandes cohortes.
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La preparación de muestras asistida por filtración con ultrasonidos combina las ventajas demostradas de la FASP con las ventajas físicas de la sonicación. Al potenciar la lisis, mejorar la digestión y estandarizar los flujos de trabajo, los sistemas ultrasónicos ofrecen una solución potente para la proteómica moderna.
El sonicador multitubo VialTweeter y el sonicador de microplacas UIP400MTP ejemplifican cómo la energía ultrasónica focalizada puede transformar la preparación rutinaria de muestras en un proceso más eficiente, reproducible y científicamente robusto – lo que, en última instancia, permite obtener datos proteómicos de mayor calidad y conocimientos biológicos más profundos.
Elija el sonicador más adecuado para su preparación de muestras asistida por filtración
| Modelo de sonicador | Ventajas para la FASP | Uso más adecuado |
| Sonicador de microplacas UIP400MTP | Sonicación uniforme en microplacas completas; aporte de energía altamente reproducible; acelera la alquilación y la digestión enzimática en flujos de trabajo de alta capacidad de procesamiento; compatible con la preparación automatizada de muestras. | Flujos de trabajo de FASP de alta capacidad de procesamiento en placas de 96 pocillos o formatos similares, incluidas las aplicaciones de cribado proteómico. |
| Sonicador multitubo VialTweeter | Sonicación simultánea y uniforme de varios tubos cerrados; minimiza la contaminación cruzada y la pérdida de muestras; mejora la penetración y la mezcla de los reactivos, aumentando la eficiencia de la alquilación y la digestión. | Procesamiento en paralelo de varias muestras de FASP con una capacidad de procesamiento moderada y alta reproducibilidad. |
| CupHorn (sonicación indirecta mediante un «baño de alta intensidad» para tubos sellados) | Sonicación indirecta de alta intensidad para recipientes sellados; excelente control de la temperatura y procesamiento sin contaminación; favorece una transferencia de masa eficiente sin contacto directo con la sonda. | Procesamiento de muestras en distintos recipientes / muestras sensibles o peligrosas que requieren recipientes cerrados y una distribución uniforme de la energía. |
| Sonicadores de sonda para laboratorio (sonicación directa) | Máxima intensidad ultrasónica y transferencia de energía; ruptura rápida y aceleración de las reacciones; eficaz para muestras proteicas difíciles de digerir o muy complejas. | Procesamiento de muestras individuales, muestras de mayor tamaño o matrices difíciles que requieren la máxima potencia y velocidad. |
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Preguntas frecuentes
¿Para qué se utiliza la preparación de muestras asistida por filtración?
La preparación de muestras asistida por filtración (FASP) se utiliza para preparar muestras proteicas destinadas al análisis proteómico basado en espectrometría de masas. Permite eliminar de forma eficiente detergentes, sales y otros contaminantes de bajo peso molecular, al tiempo que retiene las proteínas en un filtro con un umbral de corte de peso molecular, donde pueden desnaturalizarse, reducirse, alquilarse y digerirse enzimáticamente para obtener péptidos adecuados para el análisis por LC–MS/MS.
¿Cuáles son las ventajas de la FASP en proteómica?
Las principales ventajas de la FASP en proteómica son su capacidad para procesar muestras complejas y ricas en detergentes y, al mismo tiempo, producir mezclas de péptidos de gran pureza compatibles con la espectrometría de masas. Mejora la eficiencia y la reproducibilidad de la digestión al realizar las reacciones en el entorno confinado del filtro, reduce la pérdida de muestras en comparación con los métodos basados en precipitación y permite un intercambio eficaz de tampones. En conjunto, la FASP mejora la recuperación de péptidos, la calidad de los datos y la cobertura del proteoma, lo que la convierte en un flujo de trabajo robusto y ampliamente adoptado en la proteómica bottom-up.
Bibliografía / referencias
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FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
El sonicador sin contacto UIP400MTP facilita la FASP en placas de 96 pocillos
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento desde escala de laboratorio hasta escala industrial.