Hochdurchsatz-Probenvorbereitung für die Mitochondrien-Diagnostik
Die mitochondriale Diagnostik in Forschung und Klinik wird mit verschiedenen Techniken wie Sequenzierung, PCR und biochemischen Tests durchgeführt. Mit diesen Methoden werden DNA-Mutationen identifiziert und die mitochondriale Funktion gemessen. Mit Hilfe der Sequenzierung lassen sich genetische Mutationen nachweisen, während mit der PCR bestimmte DNA-Sequenzen quantifiziert werden können. Biochemische Tests bewerten die Funktionalität mitochondrialer Proteine und Enzyme.
Die Diagnostik mitochondrialer Erkrankungen ist aufgrund der ausgeprägten klinischen Variabilität dieser Erkrankungen sowie aufgrund der komplexen Interaktion zwischen zwei unterschiedlich vererbten Genomen, der mitochondrialen DNA (mtDNA) und dem Kerngenom, besonders schwierig.
DNA-Extraktion und -Fragmentierung durch Sonikation
Die DNA-Extraktion aus Muskelgewebe ist besonders nützlich, wenn gewebespezifische Veränderungen der mtDNA vermutet werden. Zu diesen Veränderungen können Deletionen der mtDNA bei chronisch progressiver externer Ophthalmoplegie (CPEO), Punktmutationen der mtDNA bei mitochondrialen Myopathien oder eine Depletion der mtDNA beim Alpers-Syndrom gehören. Die aus dem Muskelgewebe extrahierte DNA kann dann für verschiedene genetische Tests verwendet werden, z. B. Southern Blot und Langstrecken-PCR für Deletionen, Echtzeit-PCR für Depletionen oder Sequenzierung für Punktmutationen.
Die Beschallung mit intensiven Ultraschallwellen wird für verschiedene Anwendungen in der Mitochondriendiagnostik eingesetzt. Sie wird verwendet, um Zellen zu lysieren, um intrazelluläre Inhalte wie Mitochondrien und DNA zu extrahieren, um DNA wie mtDNA und nDNA für die Sequenzierung zu scheren und um Proben zu homogenisieren.
UIP400MTP Plate Sonicator für die Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz beschallt gleichmäßig Proben in Multiwell- und 96-Well-Platten
Wie isoliert man Mitochondrien aus Zellen und Geweben?
Die Isolierung der Mitochondrien umfasst zwei wesentliche Schritte: das Aufbrechen der Zellen, um ihren Inhalt freizusetzen, und die Anwendung der differentiellen Zentrifugation, um die mitochondrialen Fraktionen zu trennen und zu gewinnen.
Beschallung
Hielscher Sonicators sind mit Standard-Lysepuffern und -Kits kompatibel und eignen sich daher für die Isolierung von Mitochondrien. Die Sonikation dient zwei Hauptzwecken:
- Zellaufschluss: Die Ultraschallwellen zerreißen die Zellmembranen und setzen intrazelluläre Inhalte frei.
- Störung der Mitochondrien: In einem weiteren Schritt kann die Sonikation die Mitochondrien aufbrechen und mitochondriale Proteine oder mitochondriale DNA freisetzen.
- mtDNA-Fragmentierung: Die Sonikation ist eine zuverlässige Technik zum Scheren mitochondrialer DNA für die Sequenzierung.
Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP ermöglicht die Probenvorbereitung von mitochondrialen Proben im Hochdurchsatz. In Verbindung mit der differentiellen Zentrifugation steigert die Beschallung die Effizienz der Mitochondrienisolierung und gewährleistet eine hohe Ausbeute an intakten Mitochondrien, die für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen geeignet sind.
Hielscher UIP400MTP Multiwell-Plattenbeschallungsgerät funktioniert mit jeder Standardplatte
Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP bietet zahlreiche Vorteile für die Probenvorbereitung im Hochdurchsatz, z. B. in der Mitochondrien-Diagnostik.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator für die Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz in der Biomarker-Diagnostik.
Beispielhafte Anweisungen für die mtDNA-Fragmentierung mit Ultraschall
Vorbereitung und Extraktion:
- C57BL/6-Mäuse wurden durch Auskugeln des Halses getötet.
- Die Lebern wurden schnell extrahiert und in eiskaltem, sterilem PBS gewaschen.
Isolierung von Mitochondrien:
- Die Mitochondrien wurden mit einem 2-mL-Dounce-Gewebezerkleinerer und einem Mitochondrien-Isolierungskit für Gewebe isoliert.
- Erste Zentrifugation bei 700× g und 3.000× g.
- Führen Sie zwei weitere Waschschritte mit Puffer C durch.
DNA-Isolierung:
- Das Pellet aus der ersten Zentrifugation bei 700× g wurde zur Isolierung der Kern-DNA (nDNA) verwendet.
- Die DNA wurde mit Hilfe von Spin-Säulen isoliert.
- Die mitochondriale DNA (mtDNA) wurde aus isolierten Mitochondrien extrahiert.
- Die Kern-DNA (nDNA) wurde aus rohen Kernextrakten, beides aus Mauslebergewebe, extrahiert.
DNA-Fragmentierung:
- Die DNA wurde auf Eis mit einem 30-kHz/50-W-Ultraschallsonicator UP50H mit einer 0,5-mm-Mikrospitzen-Sonotrode bei 14 μm für 2 × 30 Sekunden fragmentiert.
Visualisierung und Quantifizierung der Fragmentierung:
- Die Fragmentierung nach der Ultraschallbehandlung wurde auf einem 1%igen Agarosegel mit dem DNA-Farbstoff SYBR safe sichtbar gemacht.
- Die relative Häufigkeit von mtDNA und nDNA wurde mittels qPCR bestimmt.
(vgl. Mariero et al., 2019)
Für die Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz erleichtert der Multiwell-Plattenschalldämpfer UIP400MTP die Vorbereitung einer großen Anzahl von Proben in Standard 96-Well-, Multi-Well- und Mikrotiterplatten.
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Tipps für die optimale Isolierung von Mitochondrien durch Sonikation:
- Temperaturregelung: Führen Sie alle Schritte in einem Temperaturbereich von 0°C bis 4°C durch. Dies ist entscheidend für die Erhaltung der Integrität und Funktionalität der Mitochondrien.
- Effizienz und Geschwindigkeit: Arbeiten Sie zügig und reinigen Sie die Mitochondrien nur so weit, wie es für Ihre spezifische Anwendung erforderlich ist. Eine übermäßige Manipulation kann zu erheblichen Verlusten an Mitochondrieninhalt führen.
- Verdünnung von Suspensionen: Behalten Sie während des gesamten Isolierungsprozesses niedrige Konzentrationen von Zell- und Organellensuspensionen bei. Dies trägt dazu bei, das Risiko von Trapping und Agglutination zu minimieren und damit die Reinheit der isolierten Mitochondrien zu verbessern.
- Probenvolumen: Entscheiden Sie sich für mehrere kleine Präparate anstelle eines einzigen großen Präparats. Dieser Ansatz führt in der Regel zu einer besseren Ausbeute, da eine Vergrößerung die Menge der rückgewinnbaren Mitochondrien nicht proportional erhöht. Der Multiwell-Platten-Sonicator UIP400MTP erleichtert die schnelle und zuverlässige Lyse von Zellen für die Mitochondrienisolierung sowie die Proteinextraktion aus Mitochondrien.
Diese Leitlinien werden den Isolierungsprozess mittels Ultraschalllyse und Zentrifugation effizienter machen, so dass qualitativ hochwertige Mitochondrienpräparate entstehen, die sich für nachgeschaltete Anwendungen eignen.
Hielscher Sonicators – Qualität Made in Germany
Hielscher Ultraschallgeräte sind bekannt für höchste Qualität und Designstandards. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die problemlose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen sind für Hielscher Ultraschallgeräte kein Problem.
Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Sonicators CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.
Microplate Sonicator UIP400MTP für die Beschallung von 96-Well- und Multiwell-Platten
Literatur / Literaturhinweise
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Häufig gestellte Fragen zu Mitochondrien und mitochondrialer Diagnostik
Was sind Mitochondrien?
Mitochondrien sind membrangebundene Organellen, die sich in den Zellen der meisten eukaryontischen Organismen befinden. Sie werden als die Kraftwerke der Zelle bezeichnet, weil sie durch den Prozess der Zellatmung Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) produzieren. Darüber hinaus haben Mitochondrien ihre eigene DNA und spielen eine Schlüsselrolle bei anderen zellulären Prozessen, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus und des Zelltods.
Was unterscheidet die mtDNA von der genomischen DNA?
Die mitochondriale DNA (mtDNA) unterscheidet sich von der genomischen DNA (gDNA) in mehreren wesentlichen Punkten. MtDNA befindet sich in den Mitochondrien, ist zirkulär und wird mütterlicherseits vererbt, während sich gDNA im Zellkern befindet, linear ist und von beiden Eltern vererbt wird. MtDNA ist viel kleiner und kodiert nur 37 Gene, während gDNA etwa 20.000-25.000 Gene enthält. MtDNA liegt in mehreren Kopien pro Zelle vor, hat eine höhere Mutationsrate und kodiert hauptsächlich für Proteine, die an der mitochondrialen Funktion beteiligt sind. Im Gegensatz dazu ist die gDNA in der Regel diploid, hat eine geringere Mutationsrate und kodiert eine Vielzahl von Genen, die für die Entwicklung und Funktion des Organismus notwendig sind. Außerdem finden Transkription und Translation der mtDNA in den Mitochondrien statt, während die Transkription der gDNA im Zellkern und die Translation im Zytoplasma erfolgt. Diese Unterschiede spiegeln ihre unterschiedlichen Aufgaben und evolutionären Ursprünge wider.
Was ist Cell-Free Extract?
Ein zellfreier Extrakt ist eine Lösung, die den Inhalt lysierter Zellen enthält, einschließlich Proteine, Nukleinsäuren und anderer zellulärer Bestandteile, jedoch ohne intakte Zellmembranen. Dieser Extrakt wird in der biochemischen und molekularbiologischen Forschung verwendet, um zelluläre Prozesse in vitro zu untersuchen, so dass die Forscher Reaktionen und Mechanismen außerhalb lebender Zellen analysieren können.
Welche Rolle spielen PCR-Tests in der Mitochondrien-Diagnostik?
PCR-Tests spielen in der mitochondrialen Diagnostik eine entscheidende Rolle, da sie den Nachweis von Mutationen, Deletionen oder Kopienzahlvariationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) ermöglichen. Sie ermöglichen die Amplifikation spezifischer mtDNA-Regionen, um pathogene Varianten zu identifizieren, die mit mitochondrialen Erkrankungen in Verbindung stehen. PCR-basierte Techniken wie die quantitative PCR (qPCR) und die Long-Range-PCR werden auch zur Bewertung der mtDNA-Integrität, des Heteroplasmaspiegels und der mtDNA-Depletion eingesetzt und liefern wichtige Erkenntnisse über mitochondriale Funktionen und Krankheiten.
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Was ist Differenzialzentrifugation?
Die Differenzialzentrifugation ist eine weit verbreitete Technik für die Zellfraktionierung und die Isolierung von Mitochondrien. Bei dieser Methode werden zelluläre Strukturen auf der Grundlage ihres Sedimentationskoeffizienten getrennt, der sowohl von der Dichte als auch von der Form abhängt. Bei diesem Verfahren werden die Proben in gepufferten Salzlösungen mit bestimmten Dichten mit unterschiedlich starken Zentrifugalkräften beaufschlagt. Strukturen mit ähnlichem Sedimentationskoeffizienten setzen sich gleichzeitig am Boden des Sammelröhrchens ab, so dass sie wiedergewonnen werden können.
Wie wird die Differenzialzentrifugation zur Isolierung von Mitochondrien eingesetzt?
Die Differenzialzentrifugation ermöglicht es den Forschern, mitochondriale Fraktionen effektiv von anderen zellulären Komponenten zu trennen. Die Isolierung von Mitochondrien umfasst mehrere Zentrifugationsschritte und die anschließende Gewinnung des Isolats.
Erste Zentrifugation: Wenden Sie eine geringe Zentrifugalkraft an, um große Zelltrümmer und Zellkerne zu sedimentieren.
Anschließende Zentrifugationen: Erhöhen Sie die Zentrifugalkraft schrittweise, um mit Mitochondrien angereicherte Fraktionen zu pelletieren. Mit jedem Zentrifugationsschritt werden Strukturen mit zunehmend höheren Sedimentationskoeffizienten entfernt.
Rückgewinnung von Fraktionen: Nach jeder Zentrifugation wird das Pellet gesammelt, und der Überstand wird höheren g-Kräften ausgesetzt, um die nächste Fraktion zu isolieren. Dies wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Reinheit der Mitochondrien erreicht ist.