Hochdurchsatz-Probenvorbereitung für die mitochondriale Diagnostik
Die mitochondriale Diagnostik in Forschung und Klinik erfolgt mit verschiedenen Verfahren wie Sequenzierung, PCR und biochemischen Assays. Diese Methoden dienen dazu, DNA-Mutationen zu identifizieren und die mitochondriale Funktion zu messen. Die Sequenzierung hilft beim Nachweis genetischer Mutationen, während mittels PCR bestimmte DNA-Sequenzen quantifiziert werden können. Biochemische Assays untersuchen die Funktionsfähigkeit mitochondrialer Proteine und Enzyme.
Die Diagnostik mitochondrialer Erkrankungen ist aufgrund der ausgeprägten klinischen Variabilität dieser Erkrankungen sowie aufgrund der komplexen Interaktion zwischen zwei unterschiedlich vererbten Genomen, der mitochondrialen DNA (mtDNA) und dem Kerngenom, besonders schwierig.
DNA-Extraktion und -Fragmentierung mittels Ultraschallbehandlung
Die DNA-Extraktion aus Muskelgewebe ist besonders nützlich, wenn gewebespezifische Veränderungen der mtDNA vermutet werden. Zu diesen Veränderungen können mtDNA-Deletionen bei chronisch progressiver externer Ophthalmoplegie (CPEO), mtDNA-Punktmutationen bei mitochondrialen Myopathien oder eine mtDNA-Depletion beim Alpers-Syndrom gehören. Die aus Muskelgewebe extrahierte DNA kann anschließend für verschiedene genetische Tests verwendet werden, etwa Southern-Blot und Long-Range-PCR zum Nachweis von Deletionen, Real-Time-PCR zum Nachweis einer Depletion oder Sequenzierung zum Nachweis von Punktmutationen.
Die Ultraschallbehandlung mit intensiven Ultraschallwellen wird für verschiedene Anwendungen in der mitochondrialen Diagnostik eingesetzt. Sie dient zur Lyse von Zellen, um intrazelluläre Bestandteile wie Mitochondrien und DNA zu extrahieren, zur Scherung von DNA wie mtDNA und nDNA für die Sequenzierung sowie zur Homogenisierung von Proben.
Das Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP für die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung beschallt Proben in Multiwell- und 96-Well-Platten gleichmäßig
So isolieren Sie Mitochondrien aus Zellen und Geweben
Die Isolierung von Mitochondrien umfasst zwei wesentliche Schritte: den Aufschluss von Zellen zur Freisetzung ihrer Bestandteile und die Anwendung der differenziellen Zentrifugation zur Trennung und Gewinnung mitochondrialer Fraktionen.
Ultraschallbehandlung
Die Ultraschallgeräte von Hielscher sind mit Standard-Lysepuffern und -Kits kompatibel und eignen sich daher zur Isolierung von Mitochondrien. Die Ultraschallbehandlung erfüllt zwei Hauptzwecke:
- Zelllyse: Die Ultraschallwellen zerstören Zellmembranen und setzen dabei intrazelluläre Bestandteile frei.
- Aufschluss von Mitochondrien: Eine Ultraschallbehandlung in einem nachfolgenden Schritt kann die Mitochondrien aufbrechen, um mitochondriale Proteine oder mitochondriale DNA freizusetzen.
- mtDNA-Fragmentierung: Die Ultraschallbehandlung ist ein zuverlässiges Verfahren zur Scherung mitochondrialer DNA für die Sequenzierung.
Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten ermöglicht die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung mitochondrialer Proben. In Verbindung mit der differenziellen Zentrifugation verbessert die Ultraschallbehandlung die Effizienz der Mitochondrienisolierung und gewährleistet hohe Ausbeuten an intakten Mitochondrien, die sich für verschiedene nachfolgende Anwendungen eignen.
Das Ultraschallgerät UIP400MTP von Hielscher für Multiwell-Platten ist mit jeder Standardplatte verwendbar
Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten bietet zahlreiche Vorteile für die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung, z. B. in der mitochondrialen Diagnostik.
Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten zur Hochdurchsatz-Probenvorbereitung in der Biomarkerdiagnostik.
Beispielanleitung zur mtDNA-Fragmentierung mittels Ultraschall
Vorbereitung und Extraktion:
- C57BL/6-Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet.
- Die Lebern wurden zügig entnommen und in eiskaltem sterilem PBS gewaschen.
Isolierung von Mitochondrien:
- Mitochondrien wurden mit einem 2-mL-Dounce-Gewebehomogenisator und einem Kit zur Isolierung von Mitochondrien aus Gewebe isoliert.
- Initiale Zentrifugation bei 700× g und 3.000× g.
- Führen Sie zwei zusätzliche Waschschritte mit Puffer C durch.
DNA-Isolierung:
- Das Pellet aus der ersten Zentrifugation bei 700× g wurde zur Isolierung nukleärer DNA (nDNA) verwendet.
- Die DNA wurde mithilfe von Zentrifugationssäulen isoliert.
- Mitochondriale DNA (mtDNA) wurde aus isolierten Mitochondrien extrahiert.
- Nukleäre DNA (nDNA) wurde aus rohen Kernextrakten extrahiert; sowohl die mtDNA als auch die nDNA stammten aus Mauslebergewebe.
DNA-Fragmentierung:
- Die DNA wurde auf Eis mit einem 30-kHz/50-W-Ultraschallgerät UP50H mit einer 0,5-mm-Mikrospitzen-Sonotrode bei 14 μm für 2 × 30 Sekunden fragmentiert.
Visualisierung und Quantifizierung der Fragmentierung:
- Die Fragmentierung nach der Ultraschallbehandlung wurde auf einem 1%igen Agarosegel mit dem DNA-Farbstoff SYBR safe visualisiert.
- Die relative Häufigkeit von mtDNA und nDNA wurde mittels qPCR bestimmt.
(vgl. Mariero et al., 2019)
Für die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung erleichtert das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten die Aufbereitung großer Probenzahlen in standardmäßigen 96-Well-, Multiwell- und Mikrotiterplatten.
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Tipps für die optimale Isolierung von Mitochondrien mittels Ultraschallbehandlung:
- Temperaturkontrolle: Führen Sie alle Schritte in einem Temperaturbereich von 0°C bis 4°C durch. Dies ist entscheidend für den Erhalt der Integrität und Funktionsfähigkeit der Mitochondrien.
- Effizienz und Geschwindigkeit: Arbeiten Sie zügig und reinigen Sie die Mitochondrien nur in dem Umfang, der für Ihre spezifische Anwendung erforderlich ist. Übermäßige Bearbeitung kann zu erheblichen Verlusten mitochondrialer Bestandteile führen.
- Verdünnung von Suspensionen: Halten Sie die Konzentrationen der Zell- und Organellensuspensionen während des gesamten Isolierungsprozesses niedrig. Dies trägt dazu bei, die Risiken des Einschlusses und der Agglutination zu minimieren und dadurch die Reinheit der isolierten Mitochondrien zu verbessern.
- Probenvolumen: Wählen Sie mehrere Präparationen im kleinen Maßstab anstelle einer einzigen großen Präparation. Dieser Ansatz führt in der Regel zu besseren Ausbeuten, da eine Maßstabsvergrößerung die Menge der gewinnbaren Mitochondrien nicht proportional erhöht. Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten erleichtert die schnelle und zuverlässige Lyse von Zellen zur Mitochondrienisolierung sowie die Proteinextraktion aus Mitochondrien.
Diese Richtlinien machen den Isolierungsprozess mittels Ultraschalllyse und Zentrifugation effizienter und liefern hochwertige mitochondriale Präparationen, die sich für nachfolgende Anwendungen eignen.
Ultraschallgeräte von Hielscher – Qualität Made in Germany
Die Ultraschallgeräte von Hielscher sind für höchste Qualitäts- und Designstandards bekannt. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Die Ultraschallgeräte von Hielscher bewältigen raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen problemlos.
Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt besonderen Wert auf leistungsstarke Ultraschallgeräte mit modernster Technologie und hoher Benutzerfreundlichkeit. Selbstverständlich sind die Ultraschallgeräte von Hielscher CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.
Ultraschallgerät UIP400MTP für 96-Well-Platten zur Beschallung von Mikrotiter- und Multiwell-Platten
Literatur / Quellen
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Häufig gestellte Fragen zu Mitochondrien und mitochondrialer Diagnostik
Was sind Mitochondrien?
Mitochondrien sind membranumschlossene Organellen, die in den Zellen der meisten eukaryotischen Organismen vorkommen. Sie sind als Kraftwerke der Zelle bekannt, weil sie durch den Prozess der Zellatmung Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) erzeugen. Darüber hinaus besitzen Mitochondrien ihre eigene DNA und spielen eine zentrale Rolle bei weiteren zellulären Prozessen, darunter die Regulation des Zellzyklus und des Zelltods.
Was unterscheidet mtDNA von genomischer DNA?
Mitochondriale DNA (mtDNA) unterscheidet sich in mehreren wesentlichen Punkten von genomischer DNA (gDNA). Die mtDNA befindet sich in den Mitochondrien, ist ringförmig und wird mütterlich vererbt, während sich die gDNA im Zellkern befindet, linear ist und von beiden Elternteilen vererbt wird. Die mtDNA ist wesentlich kleiner und kodiert nur 37 Gene, während die gDNA etwa 20.000–25.000 Gene enthält. Die mtDNA liegt in mehreren Kopien pro Zelle vor, weist eine höhere Mutationsrate auf und kodiert hauptsächlich für Proteine, die an der mitochondrialen Funktion beteiligt sind. Im Gegensatz dazu ist die gDNA typischerweise diploid, weist eine niedrigere Mutationsrate auf und kodiert eine Vielzahl von Genen, die für die Entwicklung und Funktion des Organismus erforderlich sind. Außerdem finden die Transkription und Translation der mtDNA innerhalb der Mitochondrien statt, während die Transkription der gDNA im Zellkern und die Translation im Zytoplasma erfolgen. Diese Unterschiede spiegeln ihre unterschiedlichen Rollen und evolutionären Ursprünge wider.
Was ist ein zellfreier Extrakt?
Ein zellfreier Extrakt ist eine Lösung, die die Bestandteile lysierter Zellen enthält, darunter Proteine, Nukleinsäuren und andere zelluläre Komponenten, jedoch keine intakten Zellmembranen. Dieser Extrakt wird in der biochemischen und molekularbiologischen Forschung zur Untersuchung zellulärer Prozesse in vitro verwendet und ermöglicht es Forschenden, Reaktionen und Mechanismen außerhalb lebender Zellen zu analysieren.
Welche Rolle spielen PCR-Tests in der mitochondrialen Diagnostik?
PCR-Tests spielen eine entscheidende Rolle in der mitochondrialen Diagnostik, da sie den Nachweis von Mutationen, Deletionen oder Kopienzahlvariationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) ermöglichen. Sie erlauben die Amplifikation bestimmter mtDNA-Regionen, um pathogene Varianten zu identifizieren, die mit mitochondrialen Erkrankungen verbunden sind. PCR-basierte Verfahren wie die quantitative PCR (qPCR) und die Long-Range-PCR werden auch zur Beurteilung der mtDNA-Integrität, des Heteroplasmiegrads und der mtDNA-Depletion eingesetzt und liefern wesentliche Einblicke in die mitochondriale Funktion und mitochondriale Erkrankungen.
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Was ist differenzielle Zentrifugation?
Die differenzielle Zentrifugation ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Zellfraktionierung und Mitochondrienisolierung. Diese Methode trennt zelluläre Strukturen anhand ihres Sedimentationskoeffizienten, der sowohl von der Dichte als auch von der Form abhängt. Bei diesem Verfahren werden Proben in gepufferten Salzlösungen mit bestimmten Dichten unterschiedlich hohen Zentrifugalkräften ausgesetzt. Strukturen mit ähnlichen Sedimentationskoeffizienten setzen sich gleichzeitig am Boden des Auffangröhrchens ab und können dadurch gewonnen werden.
Wie wird die differenzielle Zentrifugation zur Isolierung von Mitochondrien eingesetzt?
Die differenzielle Zentrifugation ermöglicht es Forschenden, mitochondriale Fraktionen effektiv von anderen zellulären Bestandteilen zu trennen. Die Isolierung von Mitochondrien umfasst mehrere Zentrifugationsschritte und die anschließende Gewinnung des Isolats.
Initiale Zentrifugation: Wenden Sie eine niedrige Zentrifugalkraft an, um große Zelltrümmer und Zellkerne zu sedimentieren.
Nachfolgende Zentrifugationen: Erhöhen Sie die Zentrifugalkraft schrittweise, um mit Mitochondrien angereicherte Fraktionen zu pelletieren. Jeder Zentrifugationsschritt entfernt Strukturen mit zunehmend höheren Sedimentationskoeffizienten.
Gewinnung der Fraktionen: Nach jeder Zentrifugation wird das Pellet gesammelt und der Überstand höheren g-Kräften ausgesetzt, um die nächste Fraktion zu isolieren. Dies wird wiederholt, bis die gewünschte Reinheit der Mitochondrien erreicht ist.