Ultralyd stamcelle isolering
- Ultralydskavitation er en yderst effektiv mekanisk metode til at isolere stamceller fra humant fedtvæv.
- Ultralydsisoleret stromal vaskulær fraktion (SVF) viser et højt regenerativt potentiale til medicinske anvendelser.
- Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige muligheder for direkte og indirekte sonikering til høst af stamceller.
Ultralydsisolering af stamceller
Fra den menneskelige krop ekstraheres fedtvæv (via fedtsugning) behandles ved ultralydbehandling for at fjerne vævet fra stamcellerne og andre vækstceller. Denne adskilte del af cellerne er kendt som stromale vaskulære fraktionsceller (SVF).
Ultralydsisoleringsteknikken af stamceller fra fedtvæv er udelukkende baseret på arbejdsprincippet for ultralydsafledt kavitation, som er mekanisk forskydning. De kavitationelle forskydningskræfter forstyrrer fedtvævet, så stamcellerne frigøres fra fedtvævets struktur. Ultralydsstamcelleisoleringen er en enzymfri procedure, der undgår brugen af kollagenase, trypsin eller dispase.
For at adskille de ekstraherede stamceller, mesenkymale stamceller, endotelforstadier og andre vækstcelletyper centrifugeres det sonikerede fedtvæv.
De adskilte stamceller indsamles og analyseres for deres kvalitet, herunder celleantal, levedygtighed, endotoksin og gramfarvning, før de straks bruges til autolog transplantation eller konserveres i kryoopbevaring.
Hvorfor undgå enzymer?
Da den enzymatiske fordøjelse til stamcelleisolering er ledsaget af høje omkostninger og mulige sikkerhedsrisici samt manglende effektivitet [Oberbauer et al. 2015], foretrækkes ikke-enzymatiske isoleringsmetoder såsom ultralydskavitation. Ultralydsisoleringstrinnet erstatter den enzymatiske fordøjelse ved at adskille cellerne og celleaggregaterne mekanisk fra fedtvævet.
GDmini2 ved UP200St-TD-transducer (200 watt)
- Hurtig
- Effektiv
- Reproducerbare
- Sikker
- Enzymfri
- Omkostningseffektiv
- Sterile muligheder
Fedtafledte stamceller
Stamcelle udbytte
Offentliggjort SVF-isoleringsmetode ved hjælp af ultralydskavitationsudbytte i 1,67-2,24 × 107 celler med en levedygtighed på 97,1-98,9 % [Victor, S., 2014]. Celleudbytter på ca. 2-4 millioner celler / gram fedtvæv blev opnået ved ultralydslysering af modne adipocytter i dissocieret fedtvæv [Bright et al., 2014].
Ultralydsforberedte celler har lige så højt adipogent og osteogent differentieringspotentiale sammenlignet med en standard enzymatisk isoleringsmetode [Oberbauer et al. 2015].
Ultralydssystemer til stamcelleisolering
For at sikre højeste sikkerhed og bedste kvalitet er pålideligt ultralydsudstyr, der giver mulighed for præcis kontrol over stamcellebehandlingen, en nøglefaktor for en vellykket behandling af patienterne. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige muligheder for en autolog ultralydskavitationsseparationsproces til at isolere og høste stam- og endotelforforløberceller.
Direkte sonikering
Til stamcelleisoleringsprocessen via direkte sonikering nedsænkes ultralydshornet (sonotrode, ultralydsspids / sonde) i fedtvævet. Via sonotroden kobles ultralydsbølgerne direkte ind i det autologe fedt, så ultralydskavitationen frigiver stamcellerne og stromaceller fra det resterende væv. Hielscher ultralydsprocessorer UP200Ht og UP200St med sonotrode S26d14 er almindeligt anvendte systemer til autolog stamcellebehandling. SVF-isoleringen ved direkte sonikering er mest velegnet til brug i renrumsfaciliteter.
indirekte sonikering
Da stamcellerne bruges til autologe applikationer, er sterilitet af processen meget vigtig. Derfor har Hielscher udviklet flere muligheder for indirekte sonikering, såsom GDmini2, VialTweeter og andre tilpassede systemer. Ved indirekte sonikering kobles ultralydsbølgerne gennem vægbeholderen ind i fedtvævet. Den stromale vaskulære fraktion (SVF) dissocieres fra fedtvævet ved ultralydkavitation som det samme som under direkte sonikering.
Den indirekte sonikeringsproces giver den fordel at behandle cellerne i en lukket beholder under kontamineringsfrie forhold da risikoen for krydskontaminering ved indsættelse af ultralydshornet (SONOTRODE) er elimineret. Celleisoleringen udføres i et lukket system, der sikrer sterile procesforhold.
Hielschers digitale ultralydsenheder kan styres præcist via berøringsskærm eller browserstyring. Sonikeringsprocedurer kan forudindstilles via den intuitive menu. Ultralydsenhederne er udstyret med en automatisk dataoptagelse (alle sonikeringsprocesdata gemmes på et integreret SD-kort). Ultralydsstrømindgangen kan justeres nøjagtigt til celleisoleringsprotokollen.
Litteratur/Referencer
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatiske og ikke-enzymatiske isolationssystemer til fedtvævsafledte celler: nuværende state of the art. Cellefornyelse (2015) 4:7.
Fakta, der er værd at vide
Stamceller
Stamceller er udifferentierede celler i en flercellet organisme, som har evnen til at producere flere celler af samme type på ubestemt tid. De er kendetegnet ved det bemærkelsesværdige potentiale til at udvikle sig til mange forskellige celletyper i kroppen i den tidlige tilstand af liv og vækst. Det mest karakteristiske træk ved stamceller er deres evne til at forny sig selv ved celledeling og deres evne til at blive til vævs- eller organspecifikke celler med særlige funktioner. Pluripotente stamceller har potentiale til at differentiere sig til en af de tre kønsceller: endoderm (indre maveslimhinde, mave-tarmkanal, lunger), mesoderm (muskel, knogle, blod, urogenitale) eller ektoderm (epidermalt væv og nervesystem).
I nogle organer, såsom tarmen og knoglemarven, deler stamceller sig regelmæssigt for at reparere og erstatte slidt eller beskadiget væv. I andre organer, såsom bugspytkirtlen og hjertet, deler stamceller sig kun under særlige forhold.
Mesenkymale stromal-/stamceller (MSC), som tilbyder et stort potentiale for mangfoldige terapeutiske anvendelser inden for regenerativ og æstetisk medicin, findes hovedsageligt i knoglemarven, men de kan også isoleres fra andre væv (f.eks. brusk, fedt, muskelceller). Mesenkymale stamceller betragtes som prototypiske voksne stamceller, der er kendetegnet ved deres evne til selvfornyelse.
Stamcelleforskning og -behandlinger bruges til at dyrke væv og organer til transplantationsformål (vævsteknologi). Andre medicinske områder til anvendelse af stamceller kan findes inden for behandling af hjernesygdomme (f.eks. Parkinsons og Alzheimers sygdom), cellemangelbehandling, blodsygdom (f.eks. leukæmi), led- og bruskdegeneration (f.eks. slidgigt) samt kosmetiske behandlinger (f.eks. anti-aging behandlinger). Stamceller har generelt en størrelse på ca. 15-25 mikron i diameter.
mesenkymale stamceller (MSC) er multipotente stromale celler, som har evnen til at differentiere sig til en række forskellige celletyper, herunder osteoblaster (knogleceller), kondrocytter (bruskceller), myocytter (muskelceller) og adipocytter (fedtceller).
Stromal vaskulær fraktion (SVF)
Stromal vaskulær fraktion (SVF) er en komponent i lipoaspiratet, som kan ekstraheres via fedtsugning fra fedtvæv i den menneskelige krop. Lipoaspiratet består af en heterogen blanding af celler og har et højt indhold af stamceller, kendt som fedtafledte stamceller (ASC eller ADSC), som viser ligheder med knoglemarvsstamceller, såsom deres evne til at differentiere til multilineage-celler.
Den heterogene population af SVF omfatter blandt andet endotelceller, erytrocytter, fibroblaster, lymfocytter, monocytter/makrofager og pericytter samt en vigtig fraktion af fedtafledte stamceller.
Fedt-afledte stromal-/stamceller (ASC)
Fedtafledte stromal/stamceller (ASC / ADSC) frigiver høje niveauer af bioaktive vækstfaktorer såsom epidermal vækstfaktor (EGF), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), keratinocytvækstfaktor (KGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), hepatocytvækstfaktor (HGF), transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β), insulinvækstfaktor (IGF) og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF). ACS frigiver ikke kun vækstfaktorer, de udskiller også cytokiner, herunder fms-relateret tyrosinkinase 3 (Flt-3) ligand, granulocyt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytmakrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF), interleukin (IL) såsom IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 og IL-12, leukæmihæmmende faktor (LIF) og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α).
Ekstraktion af stamcelletyper
Autologe voksne stamceller fra mennesker kan udvindes fra følgende kilder:
- Knoglemarv, som kræver ekstraktion ved høst, det vil sige boring i knogle.
- Fedtvæv (lipidceller), som kræver ekstraktion ved fedtsugning.
- Blod, som kræver ekstraktion gennem aferese, hvor blodet fra donoren passerer gennem en “dialyse” maskine, hvor stamcellerne udtages, mens de øvrige blodkomponenter returneres til donoren.