Forbedr HPLC-analyser med pålidelig prøveforberedelse
Højtydende væskekromatografi (HPLC) er fortsat en af de vigtigste analyseteknikker til identifikation og kvantificering af forbindelser i komplekse matricer. Fra farmaceutisk kvalitetskontrol til miljøovervågning og fødevareanalyse værdsættes HPLC-metoder for deres følsomhed, selektivitet og reproducerbarhed. Pålideligheden af kromatografiske data afhænger dog i høj grad af ét afgørende trin: prøveforberedelse til HPLC.
Forskning og rutiner for prøveforberedelse viser, at sonikeringsassisteret ekstraktion og prøveforberedelse forbedrer HPLC-analysers effektivitet, nøjagtighed og hastighed betydeligt. Ved at bruge ultralydsenergi til at nedbryde matricer og forbedre overførslen af analytter til opløsningsmidler kan laboratorier opnå højere genfinding, kortere ekstraktionstider og mere reproducerbare analyseresultater.
Hvorfor prøveforberedelse er vigtig ved HPLC
I mange analytiske arbejdsgange indeholder prøvematricen – såsom plantemateriale, biologisk væv, jord eller vand – komplekse blandinger af forbindelser, der kan interferere med den kromatografiske separation. Effektiv prøveforberedelse er derfor nødvendig for at isolere analytter, fjerne interfererende stoffer og koncentrere målforbindelserne før injektion i HPLC-systemet.
Traditionelle ekstraktionsteknikker indebærer ofte langvarige procedurer, store mængder organiske opløsningsmidler og flere oprensningstrin. Disse metoder kan medføre variation, øge driftsomkostningerne og forlænge den samlede analysetid.
Prøveforberedelse med ultralyd er et effektivt alternativ. Sonikering tilfører højfrekvent akustisk energi til et flydende medium og danner mikroskopiske kavitationsbobler. Når disse bobler kollapser, skaber de lokale forskydningskræfter og mikroblandingseffekter, der nedbryder faste matricer og accelererer masseoverførslen. Denne proces forbedrer ekstraktionseffektiviteten markant.
Ultralydsapparat med høj prøvekapacitet UIP400MTP med rørstativ til autosamplervials
Videnskabelig dokumentation: Sonikering forbedrer den analytiske ydeevne
Flere fagfællebedømte studier har påvist fordelene ved ultralydsekstraktion i arbejdsgange med HPLC.
For eksempel anvendte en metode udviklet til overvågning af pesticidrester i vandprøver sonikering kombineret med analyse med LC–MS/MS til at bestemme koncentrationer af pesticidet carbaryl. Ved denne fremgangsmåde blev vandprøver ekstraheret med acetonitril under ultralydsbehandling før den kromatografiske analyse. Metoden opnåede høj analytisk ydeevne, herunder genfinding mellem 89,53% og 101,72%, hvilket bekræftede nøjagtigheden og pålideligheden af proceduren for prøveforberedelse med ultralyd.
Ultralydsekstraktionstrinnet muliggjorde effektiv overførsel af analytter fra den vandige matrix til det organiske opløsningsmiddel, reducerede forbruget af opløsningsmiddel og eliminerede behovet for omfattende oprensningsprocedurer. Den validerede analysemetode viste fremragende linearitet, præcision og kvantificeringsgrænser, hvilket fremhæver sonikeringens effektivitet i moderne kromatografiske arbejdsgange. (jf. Roudani et al., 2018)
Et andet studie introducerede ultralydsassisteret matrix-fastfasedispersion (UA-MSPD) til bestemmelse af oleuropein i olivenblade ved hjælp af HPLC-analyse. Ved denne teknik blev plantepulver og sorbentmateriale blandet og derefter udsat for ultralydsbølger under elueringstrinnet. Ultralyd forbedrede desorptionen af analytter fra sorbentens overflade og forbedrede samtidig ekstraktionen fra prøvematricen. (jf. Rashidipour og Heydari, 2018)
Den optimerede ultralydsprocedure gav betydelige analytiske forbedringer, herunder:
- Lineære kalibreringskurver med R² = 0,9979
- Detektionsgrænser helt ned til 0,03 µg mL⁻¹
- Genfinding mellem 90,2% og 96,7%
Disse resultater bekræfter, at ultralydsassisteret ekstraktion ikke blot accelererer prøveforberedelsen, men også øger ekstraktionsudbyttet sammenlignet med klassiske teknikker til matrix-fastfasedispersion.
Ultralydsapparat med probe UP200St til prøveforberedelse til HPLC
Vigtige fordele ved prøveforberedelse med ultralyd til HPLC
Den stigende anvendelse af ultralydsekstraktion i analyselaboratorier er drevet af flere målbare fordele.
- Højere ekstraktionseffektivitet
Akustisk kavitation nedbryder faste matricer og forbedrer opløsningsmidlets indtrængning. Dette forbedrer frigivelsen af analytter og øger genfindingen, især for forbindelser på sporniveau i komplekse prøver. - Kortere prøveforberedelsestid
Ultralydsekstraktion kan ofte fuldføre prøveforberedelsen inden for sekunder eller minutter. For eksempel gav optimerede parametre for ultralydsekstraktion i UA-MSPD effektiv genfinding af analytter efter omkring 30 sekunders sonikering, hvilket viser, hvor markant analysearbejdsgange kan accelereres. - Lavere forbrug af opløsningsmidler
Da ultralyd forbedrer masseoverførslen, kræves der typisk mindre mængder opløsningsmiddel. Et reduceret forbrug af opløsningsmidler forbedrer laboratoriets bæredygtighed og sænker driftsomkostningerne. - Forbedret reproducerbarhed
Ensartet fordeling af ultralydsenergi sikrer ensartet nedbrydning og ekstraktion af prøver på tværs af replikater, hvilket giver bedre præcision i analytiske målinger. - Kompatibilitet med moderne kromatografiske metoder
Ultralydsekstraktion integreres let med systemer til HPLC, UHPLC og LC-MS, hvilket gør den velegnet til analysemiljøer med høj prøvekapacitet.
HPLC-kromatogram af fenoliske forbindelser fra et ekstrakt af Annona muricata-blade isoleret med ultralyd ved hjælp af ultralydsapparatet UP400S.
(Studie og grafik: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktiske sonikeringsløsninger til prøveforberedelse til HPLC
Til laboratorier, der implementerer ultralydsekstraktion, giver Hielschers ultralydsapparater præcis kontrol over parametre som amplitude, tid og pulstilstand. Derfor er Hielschers laboratorieultralydsapparater særligt velegnede til analyselaboratorier.
Vælg det bedst egnede laboratorieultralydsapparat til dine HPLC-prøver
| Ultralydsapparatmodel | Fordele ved HPLC | Bedste anvendelse ved prøveforberedelse til HPLC |
| VialTweeter ultralydsapparat til flere rør |
• Samtidig sonikering af op til 10 forseglede vials med identisk ultralydsenergi • Sterilt: Ingen krydskontaminering, fordi prøverne forbliver lukkede • Meget reproducerbare ekstraktionsbetingelser på tværs af batcher • Effektiv kavitation til analytiske prøver med lille volumen |
• Forberedelse af miljøprøver, fødevareprøver eller farmaceutiske prøver med høj prøvekapacitet • Ekstraktion af sporanalytter før analyse med HPLC, UHPLC eller LC-MS • Standardiserede arbejdsgange, der kræver identisk behandling af flere prøver |
| Ultralydsapparat til mikroplader UIP400MTP |
• Kontaktfri sonikering af hele mikroplader (formater med 96 brønde og 384 brønde) • Ensartet fordeling af ultralydsenergi i alle brønde • Muliggør automatisering og integration af robotter i analytiske arbejdsgange • Høj prøvekapacitet med præcis kontrol over amplitude og sonikeringstid |
• UHPLC-screeningsarbejdsgange med høj prøvekapacitet • Biblioteker med farmaceutiske forbindelser og prøveforberedelse til metabolomik • Pladebaseret ekstraktion til analyseforløb med LC-MS eller UHPLC |
| Laboratorieultralydsapparater med mikrospids (direkte sonikering) |
• Maksimal ultralydsintensitet til effektiv nedbrydning af matricer • Meget hurtig ekstraktion af analytter fra faste, viskøse eller heterogene prøver • Justerbare amplitude- og pulsparametre til optimerede ekstraktionsbetingelser • Høj kavitationsenergi forbedrer genfindingen af analytter og ekstraktionsudbyttet |
• Ekstraktion fra vanskelige matricer såsom plantevæv, fødevareprøver eller polymerer • Homogenisering før SPE, filtrering eller væske–væske-ekstraktion • Metodeudvikling til prøveforberedelse med ultralyd til HPLC |
| CupHorn (“højintensitetsbad” til bægerglas og rør) |
• Indirekte sonikering forhindrer probekontaminering • Ensartet ultralydsfelt til flere rør samtidig • Ideelt til sterile, farlige eller flygtige prøver, der skal forblive forseglede • Forenkler håndteringen og opretholder samtidig kraftig kavitationsenergi |
• Parallel ekstraktion af flere HPLC-prøver i forseglede centrifugerør • Forberedelse af biologiske, farmaceutiske eller miljømæssige prøver • Arbejdsgange, hvor kontamineringsfri indirekte sonikering er påkrævet |
Videnskabelig relevans for analytisk kemi
I takt med at analytisk kemi bevæger sig mod hurtigere og mere bæredygtig laboratoriepraksis, er prøveforberedelse med ultralyd blevet en effektiv teknologi, der åbner nye muligheder. Sonikering understøtter udviklingen af hurtige analysemetoder med lavere forbrug af opløsningsmidler, forbedret ekstraktionseffektivitet og robuste valideringsparametre.
Den voksende litteratur om ultralydsekstraktion viser, at sonikeringsassisteret prøveforberedelse til HPLC ikke blot er en praktisk hjælp – det er en videnskabeligt valideret fremgangsmåde, der forbedrer den analytiske ydeevne. Ved at kombinere ultralydsekstraktion med moderne kromatografiske teknikker kan laboratorier opnå pålidelig detektion af sporanalytter i stadig mere komplekse prøvematricer.
HPLC-arbejdsgange forbedret med sonikering
Med løbende fremskridt inden for analytisk instrumentering og teknologier til prøveforberedelse vil ultralydsekstraktion sandsynligvis spille en endnu større rolle i kromatografiske laboratorier. Dens evne til at effektivisere arbejdsgange, forbedre datakvaliteten og reducere miljøpåvirkningen stemmer godt overens med de skiftende krav inden for moderne analytisk videnskab.
For analytiske kemikere og industrielle laboratorier, der ønsker at optimere prøveforberedelsen til HPLC, tilbyder ultralydsekstraktion en gennemprøvet, skalerbar og videnskabeligt robust løsning. Ved at integrere sonikering i rutinemæssige prøveforberedelsesprotokoller kan laboratorier forbedre både effektiviteten og pålideligheden af kromatografiske analyser betydeligt.
Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielschers ultralydsapparater er velkendte for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores ultralydsapparater i industrianlæg. Hielschers ultralydsapparater håndterer let barske forhold og krævende miljøer.
Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og høj brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater er naturligvis CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
Litteratur / referencer
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Ofte stillede spørgsmål
Hvad er HPLC?
Højtydende væskekromatografi (HPLC) er en analytisk separationsteknik, der bruges til at identificere, kvantificere og oprense komponenter i en blanding. Ved HPLC transporterer en flydende mobilfase opløste analytter gennem en kolonne pakket med en stationær fase under højt tryk. Forskelle i interaktionerne mellem analytterne, den stationære fase og mobilfasen får forbindelserne til at separere, mens de bevæger sig gennem kolonnen. Detektorer såsom UV-Vis-, fluorescens- eller massespektrometridetektorer måler de separerede forbindelser, hvilket muliggør præcis kvalitativ og kvantitativ analyse.
Hvilke typer væskekromatografi findes der?
Væskekromatografi kan klassificeres efter den separationsmekanisme, der anvendes mellem analytten, den stationære fase og mobilfasen. De mest almindelige typer er omvendt fase-kromatografi, hvor en upolær stationær fase separerer forbindelser ud fra hydrofobe interaktioner; normalfasekromatografi, som anvender en polær stationær fase og separerer forbindelser efter polaritet; ionbytningskromatografi, hvor ladede stationære faser separerer analytter ud fra ioniske interaktioner; og størrelseseksklusionskromatografi, som separerer molekyler efter deres hydrodynamiske størrelse og molekylvægt. Yderligere specialiserede metoder omfatter affinitetskromatografi og hydrofil interaktionskromatografi (HILIC), som er målrettet specifikke molekylære interaktioner eller polære forbindelser.
Hvilke vials bruges til HPLC?
HPLC-analyser anvender typisk små vials af glas eller polymer, som er beregnet til at indeholde forberedte prøver før injektion i det kromatografiske system. Det mest almindelige format er autosamplervials på 2 mL, som er kompatible med de fleste HPLC-autosamplere. Disse vials er normalt fremstillet af borosilikatglas for at sikre kemisk resistens og minimal interaktion med opløsningsmidler og analytter. Afhængigt af prøvetypen kan vials have indsatser til prøver med lille volumen, skruelåg eller krympelukninger samt septa fremstillet af materialer såsom PTFE/silikone for at bevare prøvens integritet.
Hvad er autosamplervials?
Autosamplervials er specialiserede prøvebeholdere beregnet til automatiserede injektionssystemer i HPLC- og UHPLC-instrumenter. De indeholder den forberedte prøveopløsning og placeres i instrumentets autosamplerbakke, hvor systemet automatisk udtager et defineret volumen til injektion i den kromatografiske kolonne. Autosamplervials fremstilles med præcise dimensioner for at sikre kompatibilitet med robotstyrede prøvetagningsnåle og minimere fordampning, kontaminering eller adsorption af prøven. Deres design muliggør reproducerbare analyser med høj prøvekapacitet i moderne kromatografiske laboratorier.
Hvilke trin indgår i HPLC?
Den typiske arbejdsgang for højtydende væskekromatografi (HPLC) består af flere på hinanden følgende trin, der sikrer pålidelig separation og detektion af analytter.
- Først udføres prøveforberedelse for at opløse analytten, fjerne partikler og ofte ekstrahere eller koncentrere målforbindelser fra prøvematricen. Dette trin kan omfatte filtrering, fortynding eller ekstraktionsteknikker såsom ultralydsekstraktion, fastfaseekstraktion eller væske–væske-ekstraktion.
- Derefter placeres den forberedte prøve i en HPLC-vial og sættes i autosampleren. Autosampleren injicerer et præcist volumen af prøven i den strømmende mobilfase.
- I trinnet for tilførsel af mobilfasen transporteres den injicerede prøve derefter gennem systemet ved hjælp af en højtrykspumpe. Mobilfasen transporterer analytterne gennem den kromatografiske kolonne ved en kontrolleret flowhastighed.
- Inde i den kromatografiske kolonne finder separationen sted. Kolonnen indeholder en stationær fase, typisk pakkede partikler med definerede kemiske egenskaber. Når analytterne bevæger sig gennem kolonnen, interagerer de forskelligt med den stationære fase og mobilfasen, hvilket får dem til at eluere på forskellige tidspunkter.
- Efter separationen passerer forbindelserne gennem en detektor, såsom en UV-Vis-, fluorescens- eller massespektrometridetektor. Detektoren måler tilstedeværelsen og koncentrationen af de eluerende forbindelser og omdanner signalet til elektroniske data.
- Til sidst udføres dataopsamling og analyse ved hjælp af kromatografisoftware. Systemet genererer et kromatogram, hvor toppene svarer til individuelle forbindelser. Toppenes retentionstider hjælper med at identificere analytter, mens toppenes arealer eller højder muliggør kvantitativ bestemmelse af deres koncentration.
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra laboratoriestørrelse til industriel størrelse.