Ultrazvuková disaggregace buněk v bakteriálních vzorcích

Bakteriální vzorky se málokdy dodávají ve formě skutečných jednobuněčných suspenzí. Kultury rostou v řetězcích a shlucích, izoláty z přírodního prostředí tvoří agregáty vázané extracelulárními polymerními látkami a odstředěné pelety často odolávají resuspenzí i přes důkladné promíchání na vortexu. Počty životaschopných buněk, optická hustota, průtoková cytometrie i profilování mikrobiomu vycházejí z předpokladu, že jedna částice odpovídá jedné buňce. Ultrazvuková disaggregace buněk tento rozpor řeší: krátké, řízené ultrazvukové impulzy rozdělí agregáty na jednotlivé buňky, aniž by je rozložily.

Proč agregace buněk zkresluje vaše výsledky

Agregace je biologický jev, nikoli chyba při přípravě vzorku. Bakterie rodu Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces a mnoho dalších druhů vyskytujících se v životním prostředí rostou v řetězcích, shlucích nebo fragmentech biofilmu, přičemž extracelulární DNA a polysacharidy spojují buňky do pelet a eluátů z výtěrů. Analytické důsledky jsou systematické:

• Počet kolonií je podhodnocen, protože jeden shluk tvoří jednu kolonii bez ohledu na to, kolik buněk obsahuje.
• Optická hustota a čítače částic zaznamenávají agregáty namísto buněk, což zkresluje růstové křivky.
• Při průtokové cytometrii a třídění buněk dochází k nesprávnému spočítání shluků buněk, které jsou následně z analýzy vyloučeny.
• Extrakce DNA a bílkovin zahrnují pouze buňky na povrchu agregátu, což vede ke zkreslení údajů o mikrobiomu a omických analýzách.

Běžné metody jsou pomalé, neúplné nebo vedou k chemickým změnám. Intenzivní pipetování a míchání ve vortexu zanechávají mikroagregáty. Enzymatická disperze nebo disperze pomocí chelátorů mění povrch buněk, které chcete analyzovat. Mechanická dezagregace pomocí řízené kavitace působí během několika sekund a nevyžaduje žádná aditiva.

Jak ultrazvuk rozrušuje buněčné shluky, aniž by je rozrušil

Ultrazvuková deaglomerace buněk využívá rozdílu v mechanické pevnosti. Bakteriální agregáty jsou drženy pohromadě relativně slabými mezibuněčnými vazbami a extracelulární matricí, zatímco neporušená buněčná membrána odolává podstatně většímu smykovému namáhání. Jakmile kalibrované ultrazvukové vlny proniknou do suspenze, akustická kavitace generuje mikroproudění, tlakové pulzy a smykové síly, které působí nejprve na rozhraních agregátů. Shluky, řetězce a fragmenty biofilmu jsou rozštěpeny (deaglomerace) ještě předtím, než je dosaženo energetické úrovně, při které dochází k prasknutí membrán (lýza).

Ultrazvukové rozrušení shluků bakteriálních buněk

Rozklad nebo lýza – Proč jsou parametry sonikace důležité

Z toho v praxi vyplývá, že dezagregace a lýza představují stejný přístroj provozovaný s odlišnými parametry. Při mírné amplitudě, krátkých pulzních cyklech a řízené teplotě získáte životaschopnou suspenzi jednotlivých buněk. Zvýšením amplitudy, doby působení nebo teploty vzorku se proces posune směrem k úplnému rozrušení buněk pro intracelulární cíle. Generátory Hielscher umožňují přesně nastavit amplitudu, výkon, pulz a příkon energie a uložit danou metodu, takže krok dezagregace je reprodukovatelný napříč vzorky, obsluhou i jednotlivými cykly.

Účinná bezkontaktní sonikace

Ultrazvukové čištění v lázni nemůže tuto přesnost zajistit. Ultrazvukové čisticí lázně a nádrže poskytují pouze nízkou úroveň ultrazvukové energie, což vede k neúplné přípravě vzorků, a kavitace probíhá nerovnoměrně, takže každá zkumavka je ošetřena v závislosti na své poloze v lázni. Zařízení VialTweeter přenáší intenzivní, soustředěné ultrazvukové síly přímo skrz stěnu nádoby až do 10 uzavřených vzorků současně. Úpravy, které vyžadují dlouhou a proměnlivou expozici v lázni, jsou dokončeny ve standardizovaném pulzním režimu.
Bezkontaktní ultrazvukové přístroje společnosti Hielscher aplikují intenzivní, fokusovaný ultrazvuk skrz stěny uzavřených zkumavek. Přístroj VialTweeter zpracovává až 10 zkumavek současně se stejnou intenzitou, a to bez sondy ve vzorku, bez křížové kontaminace a bez uvolňování aerosolů. Tam, kde to vyžaduje průchodnost, sonikátory pro mikrotitrační destičky UIP400MTP a UIP550MTP rozšiřují stejný řízený přenos energie na destičky s více jamkami.

Výhody bezkontaktní ultrazvukové dispergace

• Žádná křížová kontaminace: Vzhledem k tomu, že zkumavky zůstávají trvale uzavřené a do vzorku není ponořena žádná sonda, je zcela vyloučena křížová kontaminace i ztráta vzorku. Mezi jednotlivými vzorky není třeba nic sterilizovat a jeden cyklus nemůže ovlivnit ten následující.
• Ochrana před aerosoly: Ultrazvuková léčba s otevřenou sondou vede ke vzniku infekčních aerosolů a ke kontaminaci povrchů přístrojů. Ultrazvuková léčba v uzavřené zkumavce udržuje vzorek uvnitř vlastní zkumavky, což je důležité při manipulaci s patogenními bakteriemi, jako je Mycobacterium tuberculosis, a dalšími agensy vyžadujícími bezpečnostní úroveň BSL-2 nebo BSL-3.
• Žádné snížení spropitného: Titanové sondy mohou během provozu uvolňovat do vzorku malé množství mikročástic. Tyto částice ovlivňují optickou hustotu a počet částic v následujícím úseku. Nepřímé ultrazvukové ozařování přes stěnu nádoby tento zdroj pevných látek zcela eliminuje.
• Rovnoměrná propustnost: Zařízení VialTweeter dodává stejnou intenzitu ultrazvuku do každé z až 10 zkumavek, takže výsledky sonikace jsou rovnoměrné a reprodukovatelné. Odpadají tak vlivy polohy, které trápí uživatele ultrazvukových lázní a sondování jednotlivých vzorků, a vaše výchozí hodnoty zůstávají srovnatelné napříč opakovanými měřeními.
• Integrita vzorku: Zkumavky zůstávají během celého zpracování uzavřené, takže vzorek nemůže být kontaminován, znehodnocen ani se vypařit. Malé objemy lze zpracovávat bez ředění, včetně cenných klinických pelet, u nichž si nelze dovolit další krok přenosu.
• Řízení procesu: Amplituda je nastavitelná v rozmezí od 20 do 100 %, pulzní režim v rozmezí od 0 do 100 % a systémy podporují monitorování teploty, takže tepelně citlivé kmeny a proteiny zůstávají pod prahovými hodnotami, které by mohly způsobit poškození.

Typické aplikace

• Analýza mikrobiomu a obsahu střev: rozptýlení bakterií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium a vzorků stolice před nanesením na agarové destičky nebo sekvenováním, aby počet bakterií nebyl snížen v důsledku shlukování.
• Mikrobiologie potravin a vody: rozptylování vloček ve stěrech, výplachech a obohacovacích živných médiích pro přesné stanovení počtu kolonií a životaschopnosti.
• Výzkum biofilmů: izolace buněk z nosičů a povrchů ve formě suspenzí jednotlivých buněk, a to bez enzymatického ošetření, které by odstranilo povrchové proteiny.
• Klinická diagnostika: resuspendování sputa, hnisu a eluátů z výtěrů za podmínek izolace.
• Buněčná kultura: oddělování shluků savčích, hmyzích a CHO buněk před spočítáním a pasážováním.
• Příprava celého pracovního postupu: stejný přístroj, který provádí rozdělení při nízké amplitudě, zajišťuje při vyšších nastaveních úplné rozrušení buněk, takže na to navazuje lýza, extrakce bílkovin a fragmentace DNA bez nutnosti přelévání do jiných zkumavek.

Literatura / Reference