Ultrazvuková disagregace buněk v bakteriálních vzorcích

Bakteriální vzorky jen zřídka představují skutečné jednobuněčné suspenze. Kultury rostou v řetízcích a vločkách, environmentální izoláty tvoří agregáty spojené extracelulárními polymerními látkami a centrifugované pelety často odolávají resuspendaci i přes důkladné vortexování. Počty životaschopných buněk, optická hustota, průtoková cytometrie i profilování mikrobiomu shodně předpokládají, že jedna částice odpovídá jedné buňce. Ultrazvuková disagregace buněk tento rozpor řeší: krátké, řízené sonikační pulzy rozdělí agregáty na jednotlivé buňky, aniž by je lyzovaly.

Proč agregace buněk ohrožuje vaše výsledky

Agregace je biologickou vlastností, nikoli chybou přípravy. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces a mnoho environmentálních druhů roste v řetízcích, shlucích nebo fragmentech biofilmu a extracelulární DNA a polysacharidy slepují buňky v peletách a v eluátech ze stěrů. Analytické důsledky jsou systematické:

• Počty kolonií jsou podhodnoceny, protože jeden shluk vytvoří jednu kolonii bez ohledu na to, kolik buněk obsahuje.
• Optická hustota a čítače částic vykazují místo buněk agregáty, což zkresluje růstové křivky.
• Průtoková cytometrie a třídění buněk chybně počítají shlukované události a vylučují je z analýzy.
• Extrakce DNA a proteinů reprezentují pouze buňky na povrchu agregátů, což zkresluje data o mikrobiomu i omická data.

Konvenční řešení jsou pomalá, neúplná nebo chemicky pozměňující. Intenzivní pipetování a vortexování zanechávají mikroagregáty. Enzymatická disperze nebo disperze založená na chelátorech modifikuje povrch buněk, který možná zamýšlíte analyzovat. Mechanická disagregace řízenou kavitací působí během několika sekund a nevyžaduje žádná aditiva.

Jak sonikace disagreguje buňky, aniž by je lyzovala

Ultrazvuková disagregace buněk využívá rozdílu v mechanické pevnosti. Bakteriální agregáty drží pohromadě relativně slabé mezibuněčné vazby a extracelulární matrix, zatímco intaktní buněčný obal odolá podstatně vyššímu smyku. Když kalibrovaný ultrazvuk vstupuje do suspenze, akustická kavitace vytváří mikroproudění, tlakové pulzy a smykové síly, které působí nejprve na rozhraních agregátů. Shluky, řetízky a fragmenty biofilmu jsou smykem rozděleny (deaglomerace) dříve, než je dosaženo energetické úrovně, při níž dochází k ruptuře membrán (lyze).

Ultrazvuková disagregace bakteriálních shluků buněk

Disagregace, nebo lyze – proč na parametrech sonikace záleží

Praktickým důsledkem je, že disagregace i lyze se provádějí stejným přístrojem provozovaným při různých parametrech. Při mírné amplitudě, krátkých pulzních cyklech a řízené teplotě získáte životaschopnou jednobuněčnou suspenzi. Zvýšení amplitudy, doby expozice nebo teploty vzorku posouvá proces směrem k úplné dezintegraci buněk pro intracelulární cíle. Generátory Hielscher vám umožňují přesně nastavit amplitudu, výkon, pulzy a energetický vstup a uložit metodu, takže krok disagregace je reprodukovatelný napříč vzorky, operátory i běhy.

Účinná bezkontaktní sonikace

Sonikace v lázni takové míře řízení nemůže konkurovat. Ultrazvukové čisticí lázně a vany poskytují pouze nízkou ultrazvukovou energii, což vede k neúplné přípravě, a kavitace vzniká nerovnoměrně, takže každá zkumavka je ošetřena podle své polohy v lázni. VialTweeter přenáší intenzivní, fokusované ultrazvukové síly přímo přes stěnu nádobky až do 10 uzavřených vzorků současně. Ošetření, která v lázni vyžadují dlouhou a proměnlivou expozici, jsou dokončena ve standardizovaném pulzním režimu.
Bezkontaktní sonikátory Hielscher aplikují intenzivní, fokusovaný ultrazvuk přes stěny uzavřených vialek. VialTweeter zpracovává až 10 vialek současně se stejnou intenzitou, bez sondy ve vzorku, bez křížové kontaminace a bez uvolňování aerosolu. Tam, kde to kapacita zpracování vzorků vyžaduje, rozšiřují mikrodestičkové sonikátory UIP400MTP a UIP550MTP stejný řízený přenos energie na vícejamkové destičky.

Výhody bezkontaktní ultrazvukové disagregace

• Nulová křížová kontaminace: Protože vialky zůstávají trvale uzavřené a do vzorku není ponořena žádná sonda, křížové kontaminaci i ztrátám vzorku se zcela předejde. Mezi vzorky není třeba nic sterilizovat a jeden běh nemůže ovlivnit další.
• Ochrana před aerosoly: Otevřená sonikace sondou vytváří infekční aerosoly a kontaminuje povrchy přístroje. Při sonikaci v uzavřených vialkách zůstává vzorek uvnitř vlastní zkumavky, což je důležité při práci s patogenními bakteriemi, jako je Mycobacterium tuberculosis, a dalšími agens BSL-2 nebo BSL-3.
• Žádná eroze hrotu: Titanové sondy mohou během provozu uvolňovat do vzorku malé množství mikročástic. Tyto částice v navazujících analýzách posouvají hodnoty optické hustoty a počty částic. Nepřímá sonikace přes stěnu nádobky tento zdroj pevných částic zcela eliminuje.
• Rovnoměrné zpracování vzorků: VialTweeter dodává stejnou intenzitu ultrazvuku do každé z až 10 vialek, takže výsledky sonikace jsou rovnoměrné a reprodukovatelné. Poziční efekty, které trápí lázně i sonikaci jednotlivých vzorků sondou, mizí a vaše výchozí hodnoty zůstávají srovnatelné napříč replikáty.
• Integrita vzorku: Zkumavky zůstávají po celou dobu zpracování uzavřené, takže vzorek nemůže být kontaminován, znehodnocen ani se odpařit. Malé objemy lze zpracovat bez ředění, včetně cenných klinických pelet, u nichž si nelze dovolit další krok přenosu.
• Řízení procesu: Amplitudu lze nastavit od 20 do 100 %, pulzní režim od 0 do 100 % a systémy podporují monitorování teploty, takže termosenzitivní kmeny a proteiny zůstávají pod škodlivými prahovými hodnotami.

Typické aplikace

• Analýza mikrobiomu a střevního obsahu: dispergace Lactobacillus, Bifidobacterium a fekálních vzorků před vyséváním nebo sekvenováním, aby počty nebyly snižovány shluky.
• Mikrobiologie potravin a vody: disagregace vloček ve stěrech, oplachových vzorcích a obohacovacích půdách pro přesné stanovení kolonií a životaschopnosti.
• Výzkum biofilmů: získávání buněk z nosičů a povrchů ve formě jednobuněčných suspenzí bez enzymatického ošetření, které by odstranilo povrchové proteiny.
• Klinická diagnostika: resuspendace sputa, hnisu a eluátů ze stěrů za uzavřených (kontejnmentových) podmínek.
• Buněčné kultury: oddělování shlukovaných savčích, hmyzích a CHO agregátů před počítáním a pasážováním.
• Příprava v rámci celého pracovního postupu: tentýž přístroj, který při nízké amplitudě disagreguje, provádí při vyšším nastavení úplnou dezintegraci buněk, takže lyze, extrakce proteinů a fragmentace DNA následují bez přenášení do jiných zkumavek.

Literatura / Reference

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.