Testovací protokol MBEC využívající 96jamkovou desku Sonicator UIP400MTP

Test MBEC se používá ke stanovení koncentrace antimikrobiálních látek potřebných k odstranění biofilmů vytvořených na víčkách. Aby bylo možné posoudit životaschopnost biofilmu, musí být biofilmy nejprve odděleny od kolíkových víček 96jamkové destičky. Sonikace je nejspolehlivější a nejúčinnější metodou pro toto oddělení. Vícejamkový sonik UIP400MTP átor s více jamkami je speciálně navržen pro zpracování testovacích destiček s maximální účinností a pohodlím, zefektivňuje a urychluje vysoce výkonné testy MBEC.

Sonikace pro oddělení biofilmu

Sonikace je zásadním krokem v testech minimální koncentrace eradikace biofilmu (MBEC), což umožňuje účinné uvolnění buněk biofilmu z jejich povrchového připojení. Biofilmy jsou inherentně strukturovaná společenství mikroorganismů uzavřená v mezibuněčné matrici, díky čemuž jsou výrazně odolnější vůči antimikrobiálním látkám ve srovnání s planktonními buňkami. Během testů MBEC využívá sonikace ultrazvukové vlny k vytvoření řízené kavitace, narušení matrice biofilmu a uvolnění vložených buněk do suspenze. Tento krok zajišťuje, že buňky biofilmu jsou rovnoměrně rozptýleny v médiu pro regeneraci, což usnadňuje přesné posouzení životaschopnosti pomocí pokovování, ředění nebo spektrofotometrických metod. Bez správného oddělení biofilmu by zbytkové složky matrice mohly chránit buňky, což by vedlo k podcenění antimikrobiální účinnosti. Proto je sonikace nepostradatelná pro získání spolehlivých a reprodukovatelných hodnot MBEC, které odrážejí skutečný eradikační potenciál testovaných látek. Vícejamkový sonikátor destiček UIP400MTP umožňuje snadnou přípravu vzorků s vysokou propustností v testovacích destičkách.

Protokol o stanovení minimální koncentrace eradikace biofilmu (MBEC)

Krok 1: Tvorba biofilmu

1. Připravte bakteriální suspenzi:
   Pěstujte bakterie ve vhodných médiích pro růst v logaritmické fázi.
   Zřeďte bakteriální kulturu na definovanou optickou hustotu (např. OD600 ~0,1).
2. Naočkujte 96jamkovou destičku:
   Bakteriální suspenze (např. 150–200 μl) se přidá do každé jamky standardní 96jamkové mikrotitrační destičky.
3. Připevněte víko kolíku:
   Umístěte víko kolíku na naočkovanou destičku, aby se na povrchu kolíku vytvořil biofilm.
4. Inkubujte destičku:
   Inkubujte zařízení při vhodné teplotě (např. 37 °C) po dobu 24–48 hodin bez protřepávání, aby se podpořil růst biofilmu.

Krok 2: Léčba antimikrobiálními látkami

• Připravte si antimikrobiální roztoky:
  Připravte si řadu antimikrobiálních koncentrací v čerstvých médiích.
  Vystavte biofilmy antimikrobiálním látkám:
  Sejměte víko z bakteriální kultury a opláchněte jej ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili planktoní buňky.
  Umístěte víko do nové 96jamkové destičky obsahující antimikrobiální roztoky.
• Inkubujte destičku:
  Inkubuje se po definovanou dobu (např. 24 hodin), aby se umožnila antimikrobiální expozice.

Krok 3: Sonikace s 96-jamkovou deskou Sonicator UIP400MTP

Krok sonikace je rozhodující pro oddělení biofilmů z víček kolíků pro posouzení životaschopnosti. Pro UIP400MTP sonicator postupujte takto:

1. Připravte si nastavení:
   Naplňte čerstvou 96jamkovou destičku regeneračním médiem (např. neutralizačním vývarem nebo čerstvým růstovým médiem) do každé jamky.
2. Přeneste víko kolíku:
   Sejměte víko kolíku z destičky pro antimikrobiální úpravu.
   Opláchněte víko kolíku ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili zbytkové antimikrobiální látky.
3. Umístěte desku a sonikátor:
   Připevněte víko kolíku k desce regeneračního média.
   Umístěte desku regeneračního média na platformu UIP400MTP sonicator a ujistěte se, že je deska vystředěná a stabilní.
4. Upravte parametry sonikace:
   Nastavte parametry sonikace na UIP400MTP (Nastavení lze upravit podle biofilmu):
   Amplituda: 70–100 %.
   Doba sonikace: 1–3 minuty (upravte na základě robustnosti biofilmu) v režimu cyklu.
5. Sonikát:
   Spusťte proces sonikace. Ultrazvukové vibrace uvolní biofilmy z povrchů kolíků do regeneračního média.
6. Sledujte proces:
   Pomocí zásuvného teplotního senzoru můžete sledovat teplotu vzorku v jamkách. UIP400MTP lze připojit k laboratorní chladicí jednotce pro chlazení.
7. Zpracování po sonikaci:
   Regenerační médium (nyní obsahující oddělené biofilmy) se okamžitě převede do čerstvé sterilní destičky pro následnou analýzu.

(A) Destička obsahující TSB s 2 % glukózy používané pro tvorbu biofilmu, obnovu buněk a
stanovení MIC a MBCB; (B) Víko s kolíky pro tvorbu stafylokokových biofilmů. stanovení MIC a MBCB; (B) Víko s kolíky pro tvorbu stafylokokových biofilmů.
Biofilmové buňky vytvořené na kolíkech byly uvolněny sonikací (Hielscher Ultrasound Technology) po dobu 5 minut v 96jamkových destičkách obsahujících čerstvé kultivační médium pro regeneraci buněk.
(Obrázek a studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Krok 4: Posouzení životaschopnosti

Biofilmy oddělené od destiček a kultur:

1. Provede se sériové ředění regeneračního média a destička na agar, aby se vypočítaly jednotky tvořící kolonie (CFU).
   Případně použijte kolorimetrický nebo fluorescenční test životaschopnosti.
2. Záznam výsledků:
   Určete MBEC jako nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která vymýtila životaschopnost detekovatelného biofilmu.

Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrasonicators jsou dobře známé pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrasonicators do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnuty Hielscherovými sonikátory.

Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Zde si přečtěte, jak se UIP400MTP používá k oddělení biofilmu jako kroku přípravy vzorku během protokolu ASTM E2799 pro testování dezinfekční účinnosti proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocí testu MBEC.