Protokol testu MBEC s využitím sonikátoru pro 96jamkové destičky UIP400MTP

Test MBEC se používá ke stanovení koncentrace antimikrobiálních látek potřebné k eliminaci biofilmů vytvořených na víčkách s kolíčky. Pro posouzení viability biofilmu je nutné biofilmy nejprve oddělit od víček s kolíčky 96jamkové destičky. Sonikace je pro toto oddělení nejspolehlivější a nejúčinnější metodou. Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP je speciálně navržen ke zpracování testovacích destiček s maximální účinností a pohodlím, čímž zjednodušuje a urychluje vysokokapacitní testy MBEC.

Sonikace pro oddělení biofilmu

Sonikace je klíčovým krokem testů minimální koncentrace eradikující biofilm (MBEC), který umožňuje účinné uvolnění buněk biofilmu z povrchu, k němuž jsou přichyceny. Biofilmy jsou ze své podstaty strukturovaná společenství mikroorganismů uzavřená v extracelulární matrix, díky čemuž jsou ve srovnání s planktonními buňkami výrazně odolnější vůči antimikrobiálním látkám. Během testů MBEC využívá sonikace ultrazvukové vlny k vytvoření řízené kavitace, která narušuje matrix biofilmu a uvolňuje zabudované buňky do suspenze. Tento krok zajišťuje rovnoměrné rozptýlení buněk biofilmu v regeneračním médiu, což usnadňuje přesné hodnocení viability výsevem, ředěním nebo spektrofotometrickými metodami. Bez řádného oddělení biofilmu by zbytkové složky matrix mohly buňky chránit, což by vedlo k podhodnocení antimikrobiální účinnosti. Sonikace je proto nepostradatelná pro získání spolehlivých a reprodukovatelných hodnot MBEC, které odrážejí skutečný eradikační potenciál testovaných látek. Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP umožňuje snadnou vysokokapacitní přípravu vzorků v testovacích destičkách.

Protokol testu minimální koncentrace eradikující biofilm (MBEC)

Krok 1: Tvorba biofilmu

1. Připravte bakteriální suspenzi:
   Kultivujte bakterie ve vhodném médiu do logaritmické fáze růstu.
   Zřeďte bakteriální kulturu na definovanou optickou hustotu (např. OD600 ~0,1).
2. Inokulujte 96jamkovou destičku:
   Do každé jamky standardní 96jamkové mikrotitrační destičky přidejte bakteriální suspenzi (např. 150–200 µL).
3. Nasaďte víčko s kolíčky:
   Umístěte víčko s kolíčky na inokulovanou destičku, aby se na povrchu kolíčků mohl vytvořit biofilm.
4. Inkubujte destičku:
   Inkubujte sestavu při vhodné teplotě (např. 37°C) po dobu 24–48 hodin bez třepání, aby se podpořil růst biofilmu.

Krok 2: Ošetření antimikrobiálními látkami

• Připravte antimikrobiální roztoky:
  Připravte řadu antimikrobiálních koncentrací v čerstvém médiu.
  Vystavte biofilmy antimikrobiálním látkám:
  Vyjměte víčko s kolíčky z bakteriální kultury a opláchněte jej ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili planktonní buňky.
  Umístěte víčko s kolíčky do nové 96jamkové destičky obsahující antimikrobiální roztoky.
• Inkubujte destičku:
  Inkubujte po definovanou dobu (např. 24 hodin), aby mohlo proběhnout antimikrobiální působení.

Krok 3: Sonikace pomocí sonikátoru pro 96jamkové destičky UIP400MTP

Krok sonikace je zásadní pro oddělení biofilmů od víček s kolíčky za účelem posouzení viability. U sonikátoru UIP400MTP postupujte podle těchto kroků:

1. Připravte sestavu:
   Naplňte každou jamku čerstvé 96jamkové destičky regeneračním médiem (např. neutralizačním bujónem nebo čerstvým růstovým médiem).
2. Přeneste víčko s kolíčky:
   Vyjměte víčko s kolíčky z destičky s antimikrobiálním ošetřením.
   Opláchněte víčko s kolíčky ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili zbytky antimikrobiálních látek.
3. Umístěte destičku a sonikátor:
   Nasaďte víčko s kolíčky na destičku s regeneračním médiem.
   Umístěte destičku s regeneračním médiem na platformu sonikátoru UIP400MTP a zajistěte, aby byla destička vystředěná a stabilní.
4. Nastavte parametry sonikace:
   Nastavte parametry sonikace na UIP400MTP (nastavení lze přizpůsobit biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Doba sonikace: 1–3 minuty (upravte podle odolnosti biofilmu) v cyklickém režimu.
5. Sonikujte:
   Spusťte proces sonikace. Ultrazvukové vibrace uvolní biofilmy z povrchu kolíčků do regeneračního média.
6. Sledujte proces:
   Ke sledování teploty vzorků v jamkách použijte připojitelné teplotní čidlo. UIP400MTP lze pro chlazení připojit k laboratornímu chladiči.
7. Zpracování po sonikaci:
   Ihned přeneste regenerační médium (nyní obsahující oddělené biofilmy) do čerstvé sterilní destičky pro následnou analýzu.

(A) Destička obsahující TSB s 2% glukózy použitá pro tvorbu biofilmu, získání buněk a
stanovení MIC a MBCB; (B) Víčko s trny pro tvorbu stafylokokových biofilmů. stanovení MIC a MBCB; (B) Víčko s trny pro tvorbu stafylokokových biofilmů.
Buňky biofilmu vytvořené na trnech byly uvolněny sonikací (Hielscher Ultrasound Technology) po dobu 5 min v 96jamkových destičkách obsahujících čerstvé kultivační médium pro získání buněk.
(Obrázek a studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Krok 4: Hodnocení viability

Vysejte a kultivujte oddělené biofilmy:

1. Proveďte sériová ředění regeneračního média a vysejte je na agar ke stanovení počtu kolonií tvořících jednotek (CFU).
   Alternativně použijte kolorimetrický nebo fluorescenční test viability.
2. Zaznamenejte výsledky:
   Stanovte MBEC jako nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která eradikovala detekovatelnou viabilitu biofilmu.

Design, výroba a poradenství – kvalita vyrobená v Německu

Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou známé svou nejvyšší kvalitou a standardy designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových přístrojů do průmyslových zařízení. Sonikátory Hielscher snadno zvládají drsné podmínky i náročná prostředí.

Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou samozřejmě v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Přečtěte si zde, jak se UIP400MTP používá k oddělení biofilmu jako krok přípravy vzorků v rámci protokolu ASTM E2799 pro testování účinnosti dezinfekčních prostředků proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocí testu MBEC.