Protokol o stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC).

Test minimální inhibiční koncentrace (MIC) na bázi biofilmu je základní metodou pro hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek proti mikroorganismům spojeným s biofilmem, které vykazují zvýšenou odolnost díky své ochranné extracelulární matrici. Zásadním krokem v tomto testu je narušení struktur biofilmu za účelem uvolnění vložených buněk pro přesné posouzení životaschopnosti. UIP400MTP vícejamkový destičkový sonikátor usnadňuje tento proces tím, že využívá fokusovaný ultrazvuk k vytvoření řízené kavitace, účinně odděluje buňky biofilmu a disperguje je do rovnoměrné suspenze. Toto přesné a reprodukovatelné narušení biofilmu zvyšuje spolehlivost a propustnost testů MIC, což z UIP400MTP činí nezbytný nástroj pro pokrok ve výzkumu biofilmu.

Sonikace pro oddělení biofilmu

Test MIC založený na biofilmu obvykle měří životaschopnost bakterií nebo inhibici růstu pomocí metod, jako je pokovování, počítání kolonií nebo měření optické hustoty. Sonikace je kritickým krokem v testech MIC založených na biofilmu při hodnocení antimikrobiální citlivosti mikroorganismů spojených s biofilmem. Jeho primární funkcí je oddělit a dispergovat buňky zabudované do matrice biofilmu do rovnoměrné suspenze pro přesnou analýzu.
Biofilmy jsou výrazně odolnější vůči antimikrobiálním látkám ve srovnání s planktonními buňkami, takže správné oddělení je pro přesnou analýzu zásadní. Během tohoto procesu ultrazvukové vlny generují řízenou kavitaci, rozbíjejí matrici biofilmu a uvolňují vložené buňky do jednotné suspenze v regeneračním médiu. Tento krok umožňuje přesné posouzení životaschopnosti buněk dispergovaných v biofilmu pomocí metod, jako je pokovování, ředění a počítání kolonií. Správné narušení biofilmu prostřednictvím sonikace zabraňuje zbytkovým složkám matrice ze stínění buněk, což by jinak mohlo vést k podcenění antimikrobiální aktivity. Vícejamkový deskový sonikátor UIP400MTP je pro tento účel obzvláště vhodný a nabízí přesné a reprodukovatelné podmínky sonikace pro zajištění spolehlivé a vysoce výkonné přípravy testovacích destiček.

Proč je sonikace nezbytná v testech minimální inhibiční koncentrace na bázi biofilmu

Pro měření životaschopnosti a počítání buněk je vyžadována úplná a spolehlivá separace a disperze jednotlivých buněk. UIP400MTP podporuje rovnoměrné, nepoškozující oddělení biofilmu a disperzi buněk pro robustní výsledky testu.

• Složitost biofilmu: Biofilmy jsou strukturovaná mikrobiální společenství uzavřená v matrici z extracelulární polymerní látky (EPS), která chrání mikroorganismy a činí je odolnějšími vůči antimikrobiálním látkám.
• Rovnoměrná disperze: Aby bylo možné přesně změřit životaschopnost buněk zabudovaných v biofilmu nebo jejich citlivost na antimikrobiální látky, musí být biofilm nejprve uvolněn a rozložen na homogenní suspenzi.

Protokol stanovení minimální inhibiční koncentrace na bázi biofilmu

Test minimální inhibiční koncentrace (MIC) určuje nejnižší koncentraci antimikrobiálního činidla potřebnou k inhibici viditelného růstu mikroorganismů. Tento protokol je určen pro mikroorganismy spojené s biofilmem, UIP400MTP používá vícejamkový destičkový sonikátor pro narušení biofilmu.

Krok 1: Příprava bakteriálního inokula

1. Připravte bakteriální suspenzi:
   Pěstujte bakterie ve vhodných médiích do střední logaritmické fáze.
   Zřeďte kulturu, abyste dosáhli standardizované hustoty buněk (např. 0,5 McFarlandova standardu nebo OD600 ~0,1).
2. Připravte si antimikrobiální roztoky:
   Zřeďte antimikrobiální činidlo ve vhodném médiu, abyste vytvořili rozsah koncentrací (např. dvojnásobné sériové ředění).
3. Dávkujte do 96jamkové destičky:
   Antimikrobiální roztoky se přidají do jamek standardní 96jamkové destičky s konečným objemem jamky ~150–200 μl.
   Zahrňte kontroly růstu (bez antimikrobiálních) a sterility (bez bakteriálního inokula).

Krok 2: Tvorba biofilmu na víku kolíku

• Připevněte víko kolíku:
  Umístěte speciální víko na naočkované jamky a ujistěte se, že jsou kolíky zcela ponořeny v bakteriální suspenzi.
• Inkubujte destičku:
  Inkubuje se při vhodné teplotě (např. 37 °C) po stanovenou dobu (např. 24 hodin) za statických podmínek, aby se na kolíčcích vytvořil biofilm.

Krok 3: Antimikrobiální expozice

• Opláchněte kolíčky:
  Sejměte víko z bakteriální suspenze a jemně opláchněte ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili volně připojené planktonní buňky.
• Vystavte antimikrobiálním látkám:
  Přeneste víko do nové 96jamkové destičky obsahující antimikrobiální ředění připravená dříve.
  Inkubace po definovanou dobu (např. 24 hodin) za statických podmínek, aby antimikrobiální činidlo mohlo působit na biofilmy.

Krok 4: Sonikace pomocí Microplate Sonicator UIP400MTP

Krok sonikace je rozhodující pro oddělení biofilmů z víček kolíků pro posouzení životaschopnosti. Pro UIP400MTP sonicator postupujte takto:

1. Připravte si nastavení:
   Naplňte čerstvou 96jamkovou destičku regeneračním médiem (např. neutralizačním vývarem nebo sterilním růstovým médiem) do každé jamky.
2. Přeneste víko kolíku:
   Sejměte víko kolíku z destičky pro antimikrobiální úpravu.
   Opláchněte víko kolíku ve sterilním fyziologickém roztoku nebo PBS, abyste odstranili zbytkové antimikrobiální látky.
3. Umístěte desku do sonikátoru:
   Připevněte víko kolíku k desce regeneračního média.
   Umístěte desku regeneračního média do UIP400MTP sonikátoru a ujistěte se, že deska sedí vystředěná a stabilní, jak je popsáno v návodu.
4. Upravte parametry sonikace:
   Nastavte parametry sonikace na UIP400MTP (nastavení lze upravit podle biofilmu):
   Amplituda: 70–100 %.
   Doba sonikace: 1–3 minuty (upravte na základě struktury biofilmu) v režimu cyklu.
5. Sonikát:
   Spusťte proces sonikace. Ultrazvukové vlny naruší matrici biofilmu a uvolní buňky do regeneračního média.
6. Sledujte proces:
   Pomocí zásuvného teplotního senzoru můžete sledovat teplotu vzorku v jamkách. UIP400MTP lze připojit k laboratorní chladicí jednotce pro chlazení.
7. Zpracování po sonikaci:
   Okamžitě se převede regenerační médium obsahující oddělené biofilmy na čerstvou sterilní destičku pro následnou analýzu.

(A) Destička obsahující TSB s 2% glukózy použitá pro tvorbu biofilmu, obnovu buněk a stanovení MIC a MBEC; (B) Víko s kolíky pro tvorbu stafylokokových biofilmů.
Biofilmové buňky vytvořené na kolíkech byly uvolněny sonikací (Hielscher Ultrasound Technology) po dobu 5 minut v 96jamkových destičkách obsahujících čerstvé kultivační médium pro regeneraci buněk.
(Obrázek a studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Krok 4: Posouzení životaschopnosti

Biofilmy oddělené od destiček a kultur:

1. Provede se sériové ředění regeneračního média a destička na agar, aby se vypočítaly jednotky tvořící kolonie (CFU).
2. Vyhodnotit MIC:
   Určete MIC jako nejnižší antimikrobiální koncentraci, která zcela inhibuje viditelný mikrobiální růst v médiu pro regeneraci.

Minimální inhibiční koncentrace MIC: Příklad mikrotitrační destičky a interpretace výsledků mikrodiluce.
(Studie a obrázek: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrasonicators jsou dobře známé pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrasonicators do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnuty Hielscherovými sonikátory.

Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Zde si přečtěte, jak se UIP400MTP používá k oddělení biofilmu v protokolu ASTM E2799 – Testování dezinfekční účinnosti proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocí testu MBEC.