Protokol ASTM E2799-22 pro antimikrobiální hodnocení

Hielscher UIP400MTP je výkonný a účinný vícejamkový sonikátor navržený tak, aby zefektivnil krok sonikace v protokolu ASTM E2799-22. Tím, že dodává rovnoměrnou ultrazvukovou energii po celé mikrotitrační destičce, UIP400MTP zajišťuje konzistentní a spolehlivé oddělení biofilmů z kolíkových víček bez poškození buněk nebo narušení integrity vzorku. Jeho vysoká kapacita a uživatelsky přívětivý provoz výrazně zkracují dobu zpracování a zároveň zvyšují reprodukovatelnost, což z něj činí ideální řešení pro laboratoře provádějící testy životaschopnosti biofilmu a testování antimikrobiální účinnosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 je standardizovaná zkušební metoda určená k hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek proti biofilmům, konkrétně se zaměřením na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmy jsou složitá mikrobiální společenství, která přilnou k povrchům a vykazují zvýšenou odolnost vůči antimikrobiální léčbě, což z nich činí významnou výzvu ve zdravotnictví, průmyslu a životním prostředí. Tato metoda využívá test minimální eradikační koncentrace biofilmu (MBEC), který poskytuje spolehlivý a reprodukovatelný rámec pro testování dezinfekčních prostředků za realistických podmínek biofilmu.

Jak přispívá sonikace k ASTM E2799?

Sonikace hraje zásadní roli v protokolu ASTM E2799 tím, že usnadňuje oddělení biofilmů z testovacích povrchů a zajišťuje přesné posouzení mikrobiální životaschopnosti po léčbě. Použitím řízené ultrazvukové energie dosahuje protokol účinného a konzistentního narušení biofilmu bez poškození buněk, což umožňuje přesné a reprodukovatelné výsledky. Díky tomu je ASTM E2799 nezbytným nástrojem pro pokrok ve výzkumu biofilmů a vývoj účinných antimikrobiálních strategií.

Jak provést test MBEC v souladu s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 popisuje kroky pro hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek proti biofilmům. Při použití Hielscher UIP400MTP mikrotitrační desky sonikátoru může být protokol upraven tak, aby zahrnoval tuto pokročilou metodu sonikace pro oddělení biofilmu. Níže je uveden popis kroků přizpůsobených použití UIP400MTP sonikátoru mikrodestiček:

1. Příprava biofilmů
   Připravte si sterilní 96jamkovou mikrotitrační destičku s odnímatelnými víčky.
   Jamky naočkujte standardizovanou bakteriální suspenzí ve vhodném růstovém médiu.
   Umístěte víko kolíku na desku a ujistěte se, že jsou kolíky zcela ponořeny do bakteriální suspenze.
   Destičku inkubujte za kontrolovaných podmínek (např. teplota a čas), aby se na kolíčcích vytvořil biofilm.
2. Léčba antimikrobiálními látkami
   Po vytvoření biofilmu vyměňte médium za čerstvé médium obsahující testovaná antimikrobiální činidla v různých koncentracích.
   Znovu nasaďte víko kolíku a inkubujte za podmínek specifikovaných v návrhu zkoušky.
3. Příprava na oddělení biofilmu
   Po ošetření opláchněte víko kolíku ponořením do sterilního oplachovacího roztoku, abyste odstranili zbytkové antimikrobiální látky a volně přilnavé planktoní buňky.
4. Oddělení biofilmu pomocí UIP400MTP Sonicator
   Připravte si čerstvou 96jamkovou mikrotitrační destičku obsahující regenerační médium (např. neutralizační vývar).
   Oddělte biofilmy umístěním víka do jamek destičky regeneračního média.
   Vložte desku do UIP400MTP sonikátoru a ujistěte se, že víko a deska jsou správně zarovnány.
   Nastavte sonikátor na amplitudu 70%-80% a sonikujte po dobu 3-4 minut v režimu cyklu, abyste zajistili konzistentní oddělení biofilmu bez lýzy buněk.
5. Posouzení životaschopnosti biofilmu
   Po sonikaci zpracujte regenerační médium obsahující oddělené buňky biofilmu pomocí standardních mikrobiologických nebo analytických technik, jako jsou:
   • Počty jednotek tvořících kolonie (CFU): Proveďte sériové ředění a destičku na agaru pro životaschopný počet buněk.
   • Měření optické hustoty (OD): K posouzení hustoty buněk použijte spektrofotometrickou analýzu.
   • Testy životaschopnosti založené na fluorescenci: Kvantifikujte živé a mrtvé buňky pomocí fluorescenčních barviv.
6. Analýza dat
   Porovnejte údaje o životaschopnosti ošetřených a neošetřených biofilmů a určete účinnost antimikrobiálních látek.
   Vypočítejte minimální koncentraci eradikace biofilmu (MBEC) na základě koncentrace potřebné k odstranění životaschopných buněk biofilmu.
7. Kontrola kvality
   Zajistěte konzistentní podmínky sonikace pravidelnou kalibrací UIP400MTP a ověřením, že proces odloučení biofilmu nevede k významné lýze nebo destrukci buněk.
   Zahrňte vhodné kontroly, jako jsou neošetřené biofilmy a slepé vzorky obsahující pouze médium, k ověření výsledků.

Biofilmové buňky vytvořené na kolíkech byly uvolněny sonikací (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Německo, UIP250MTP) po dobu 5 minut v 96jamkových destičkách obsahujících čerstvé kultivační médium pro regeneraci buněk.
(Obrázek a studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Integrací UIP400MTP do pracovního postupu ASTM E2799-22 je proces oddělování biofilmu optimalizován pro konzistenci, účinnost a aplikace s vysokou propustností.