Protokol ASTM E2799-22 pro hodnocení antimikrobiální účinnosti

Hielscher UIP400MTP je výkonný a efektivní sonikátor pro vícejamkové destičky, navržený k zefektivnění kroku sonikace v protokolu ASTM E2799-22. Díky rovnoměrnému přenosu ultrazvukové energie na celou mikrotitrační destičku zajišťuje UIP400MTP konzistentní a spolehlivé oddělení biofilmů z vík s kolíčky bez poškození buněk nebo narušení integrity vzorků. Jeho vysoká kapacita zpracování vzorků a uživatelsky přívětivé ovládání výrazně zkracují dobu zpracování a zároveň zlepšují reprodukovatelnost, což z něj činí ideální řešení pro laboratoře provádějící testy viability biofilmu a testování antimikrobiální účinnosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 je standardizovaná zkušební metoda určená k hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek proti biofilmům, se zvláštním zaměřením na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmy jsou komplexní mikrobiální společenstva, která ulpívají na površích a vykazují zvýšenou odolnost vůči antimikrobiálnímu ošetření, což z nich činí významný problém ve zdravotnictví, v průmyslu i v životním prostředí. Tato metoda využívá test minimální koncentrace eradikující biofilm (MBEC) a poskytuje spolehlivý a reprodukovatelný rámec pro testování dezinfekčních prostředků za realistických podmínek biofilmu.

Jak přispívá sonikace k ASTM E2799?

Sonikace hraje v protokolu ASTM E2799 klíčovou roli, protože usnadňuje oddělení biofilmů od testovaných povrchů, a zajišťuje tak přesné posouzení mikrobiální viability po ošetření. Díky použití řízené ultrazvukové energie dosahuje protokol účinného a konzistentního narušení biofilmu bez poškození buněk, což umožňuje přesné a reprodukovatelné výsledky. Díky tomu je ASTM E2799 nezbytným nástrojem pro rozvoj výzkumu biofilmů a vývoj účinných antimikrobiálních strategií.

Jak provést test MBEC v souladu s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 popisuje kroky pro hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek proti biofilmům. Při použití sonikátoru pro mikrotitrační destičky Hielscher UIP400MTP lze protokol upravit tak, aby zahrnoval tuto pokročilou metodu sonikace pro oddělení biofilmu. Níže je popis kroků přizpůsobených použití sonikátoru pro mikrodestičky UIP400MTP:

1. Příprava biofilmů
   Připravte sterilní 96jamkovou mikrotitrační destičku s odnímatelnými víky s kolíčky.
   Naočkujte jamky standardizovanou bakteriální suspenzí ve vhodném kultivačním médiu.
   Nasaďte víko s kolíčky na destičku a zajistěte, aby byly kolíčky zcela ponořeny do bakteriální suspenze.
   Inkubujte destičku za kontrolovaných podmínek (např. teplota a doba), aby se na kolíčcích vytvořil biofilm.
2. Ošetření antimikrobiálními látkami
   Po vytvoření biofilmu nahraďte médium čerstvým médiem obsahujícím testované antimikrobiální látky v různých koncentracích.
   Znovu nasaďte víko s kolíčky a inkubujte za podmínek stanovených v návrhu testu.
3. Příprava na oddělení biofilmu
   Po ošetření opláchněte víko s kolíčky ponořením do sterilního oplachového roztoku, abyste odstranili zbytkové antimikrobiální látky a volně ulpívající planktonní buňky.
4. Oddělení biofilmu pomocí sonikátoru UIP400MTP
   Připravte čerstvou 96jamkovou mikrotitrační destičku obsahující zotavovací médium (např. neutralizační bujón).
   Biofilmy oddělte umístěním víka s kolíčky do jamek destičky se zotavovacím médiem.
   Vložte destičku do sonikátoru UIP400MTP a zajistěte, aby víko a destička byly správně zarovnány.
   Nastavte sonikátor na amplitudu 70 %–80 % a sonikujte po dobu 3–4 minut v cyklickém režimu, abyste zajistili konzistentní oddělení biofilmu bez lýzy buněk.
5. Hodnocení viability biofilmu
   Po sonikaci zpracujte zotavovací médium obsahující oddělené buňky biofilmu pomocí standardních mikrobiologických nebo analytických technik, jako jsou:
   • Stanovení počtu kolonie tvořících jednotek (CFU): Proveďte sériová ředění a vyočkujte na agar pro stanovení počtu životaschopných buněk.
   • Měření optické hustoty (OD): Pomocí spektrofotometrické analýzy posuďte hustotu buněk.
   • Testy viability založené na fluorescenci: Kvantifikujte živé a mrtvé buňky pomocí fluorescenčních barviv.
6. Analýza dat
   Porovnejte údaje o viabilitě ošetřených a neošetřených biofilmů a určete účinnost antimikrobiálních látek.
   Vypočítejte minimální koncentraci eradikující biofilm (MBEC) na základě koncentrace potřebné k eliminaci životaschopných buněk biofilmu.
7. Kontrola kvality
   Zajistěte konzistentní podmínky sonikace pravidelnou kalibrací UIP400MTP a ověřováním, že proces oddělení biofilmu nevede k významné lýze nebo destrukci buněk.
   K validaci výsledků zahrňte vhodné kontroly, jako jsou neošetřené biofilmy a slepé vzorky obsahující pouze médium.

Buňky biofilmu vytvořené na kolíčcích byly uvolněny sonikací (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Německo, UIP250MTP) po dobu 5 min v 96jamkových destičkách obsahujících čerstvé kultivační médium pro zotavení buněk.
(Obrázek a studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Integrací UIP400MTP do pracovního postupu ASTM E2799-22 je proces oddělení biofilmu optimalizován z hlediska konzistence, efektivity a vysokokapacitních aplikací.