Protokol o kultivaci a oddělení biofilmu Staphylococcus

Standardizované metody jsou nezbytné pro spolehlivé výsledky výzkumu. Zde naleznete kultivační a oddělovací protokol pro stafylokokové biofilmy. Tento protokol se zaměřuje na efektivní přípravu vzorků s vysokou propustností pomocí UIP400MTP vícejamkového sonikátoru destiček pro efektivní a vysoce výkonné odstraňování biofilmu v 96jamkových destičkách. Protokol obsahuje také klíčové kroky pro kultivaci, praní a vizualizaci biofilmu se zaměřením na minimalizaci variability a zajištění reprodukovatelnosti.

Výzkum biofilmu a antibiotik Staphylococcus

Biofilmy Staphylococcus hrají zásadní roli při přetrvávajících infekcích kvůli jejich rezistenci vůči antibiotikům a imunitním reakcím. Tvorba biofilmu poskytuje ochranné prostředí pro bakterie, což ztěžuje léčbu infekcí. Výzkum biofilmů se často zaměřuje na pochopení jejich tvorby, chování a náchylnosti k antimikrobiálním látkám, s důrazem na vysoce výkonné metody pro zefektivnění experimentálních pracovních postupů.
UIP400MTP vícejamkový sonikátor nabízí významnou výhodu ve výzkumu biofilmu tím, že umožňuje rychlé a účinné oddělení biofilmů z 96jamkových destiček. Toto zařízení poskytuje rovnoměrnou ultrazvukovou energii do všech jamek, což zajišťuje konzistentní výsledky a zároveň minimalizuje variabilitu.

Protokol pro kultivaci a oddělení biofilmu Staphylococcus

Níže vás provedeme krok za krokem procesem kultivace a oddělování stafylokokového biofilmu. Jako příkladný analytický krok vám ukážeme, jak spektrofotometricky kvantifikovat kultivovanou biomasu barvením krystalovou violetí.

Kultivace biofilmu Staphylococcus

Požadované materiály:

• Sterilní 96jamkové mikrotitrační destičky ošetřené tkáňovými kulturami s plochým dnem a víčky
• Tryptický sójový vývar (TSB) s 0,25 % glukózy
• Biologický bezpečnostní box

Schody:

1. Připravte si sterilní pracovní prostředí v biologické bezpečnostní skříni, abyste minimalizovali kontaminaci.
2. Přidejte TSB obsahující 0,25 % glukózy do jamek s mikrotitrační destičkou. TSB bez glukózy obecně nepodporuje tvorbu biofilmu a měl by být používán pouze jako kontrola v případě potřeby.
3. Naočkujte jamky bakteriálními kmeny připravenými podle níže uvedeného popisu:
4. Připravte bakteriální suspenze a zajistěte, aby neexistovaly žádné již existující shluky buněk, homogenizací suspenzí pomocí sonikace nebo rozbitím shluků jehlou o průměru 23 a krátkým vírem.
5. Destička se uzavře víkem a inkubuje se za podmínek optimálních pro tvorbu biofilmu (např. 37 °C po dobu 24 hodin).
6. Proveďte experiment ve třech vyhotoveních pro každý bakteriální kmen (tři jamky na kmen), abyste zajistili spolehlivost.
7. Přidělte šest jamek na destičku pro negativní kontroly. Na jednu 96jamkovou destičku lze testovat až 30 kmenů.

Vizualizace a mytí biofilmu

1. Po inkubaci médium opatrně zlikvidujte, aby nedošlo k narušení biofilmu.
2. Každý dobře omyjte čtyřikrát fyziologickým roztokem, abyste odstranili planktonní bakterie.
3. Zkontrolujte dno jamek, zda na něm nejsou bílé skvrny svědčící o přítomnosti biofilmu.

Oddělení biofilmu pomocí vícejamkové destičky sonikátoru UIP400MTP

Nastavení a parametry zařízení:

• UIP400MTP vícejamkový destičkový sonikátor
• Provozní nastavení: 60% amplituda, režim cyklu s 60 sekundami ZAPNUTO / 30 sekund VYPNUTO

Schody:

1. Umístěte promytou mikrotitrační destičku na UIP400MTP plošinu.
2. Sonikujte vzorky při doporučeném nastavení (60% amplituda, 60 sekund zapnuto, 30 sekund vypnuto). Upravte nastavení na kmen bakterií.
3. Zahajte proces sonikace, abyste oddělili biofilm. Ultrazvukové vlny narušují matrici biofilmu a uvolňují přilnavé bakterie.
4. UIP400MTP zajišťuje rovnoměrnou expozici ve všech jamkách pro konzistentní výsledky oddělení.

Analytický krok: Kvantifikace oddělené biofilmové biomasy Staphylococcus pomocí krystalové violeti (CV)

Požadované materiály:

• 0.1% roztok krystalové violeti (CV)
• 95% ethanol nebo 30% kyselina octová (pro solubilizaci)
• Čtečka mikrodestiček schopná číst při 570 nm
• Sterilní mikrotitrační destičky pro barvení

Schody:

1. Příprava barvicí destičky: Přeneste 100 μl oddělené suspenze biofilmu z každé jamky sonikované destičky do odpovídajících jamek čisté, sterilní 96jamkové mikrotitrační destičky. Tím je zajištěno jasné a rovnoměrné prostředí pro barvení.
2. Barvení odděleného biofilmu: Přidejte 150 μl 0,1% roztoku krystalové violeti do každé jamky obsahující oddělenou suspenzi biofilmu. Jemně pipetujte, abyste zajistili rovnoměrné promíchání suspenze biofilmu a krystalové violeti.
3. Inkubace: Nechte destičku inkubovat při pokojové teplotě po dobu 15 minut, aby krystalová violet mohla účinně obarvit biomasu.
4. Praní: Po inkubaci opatrně vyhoďte roztok krystalové violeti z jamek, aniž byste narušili biomasu. Každý dobře omyjte třikrát sterilním fyziologickým roztokem, abyste odstranili nespoutané skvrny.
5. Sušení: Nechte desku uschnout na vzduchu při pokojové teplotě nebo pod sterilním krytem s prouděním vzduchu. Vyhněte se zahřívání, protože by to mohlo změnit výsledky.
6. Solubilizace: Přidejte 200 μl 95% ethanolu (nebo 30% kyseliny octové, v závislosti na standardních laboratorních postupech) do každé jamky, aby se solubilizovala navázaná křišťálová violet. Jemně promíchejte pipetováním nebo protřepáváním destičky po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
7. Měření: Změřte optickou hustotu (OD) solubilizovaného roztoku krystalové violeti při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček.
8. Analýza dat: Odečtěte průměrnou hodnotu OD570 negativních kontrol (jamky s TSB, ale bez bakteriálního inokula) z experimentálních jamek, abyste zohlednili barvení pozadí. Zaznamenávejte a analyzujte data.

Poznámka: Experiment proveďte pro každou podmínku ve trojím vyhotovení, abyste zajistili reprodukovatelnost. Zajistěte správné zacházení s křišťálovou violetí a etanolem, dodržujte bezpečnostní a likvidační protokoly.
 

Přehled klíčových výhod UIP400MTP:

• Zpracování s vysokou propustností: Navrženo speciálně pro vícejamkové destičky, což vám umožní zpracovávat více vzorků současně.
• Rovnoměrné ultrazvukové rozložení: Zajišťuje stejnou intenzitu ultrazvuku napříč jamkami a poskytuje konzistentní výsledky napříč všemi vzorky.
• Použijte jakoukoli standardní desku: UIP400MTP si poradí se všemi standardními vícejamkovými destičkami, Petriho miskami a stojánky na zkumavky. Nejsou potřeba žádné drahé proprietární značky!
• Uživatelsky přívětivé rozhraní: Snadno se nastavuje a ovládá, což z něj činí vynikající nástroj pro zvýšení produktivity laboratoře. Programovatelné nastavení a automatizace usnadňují standardizaci procesů!