Protokol kultivace a oddělování stafylokokového biofilmu

Standardizované metody jsou nezbytné pro spolehlivé výsledky výzkumu. Zde naleznete protokol kultivace a oddělování stafylokokových biofilmů. Tento protokol se zaměřuje na zefektivněnou vysokokapacitní přípravu vzorků pomocí sonikátoru pro vícejamkové destičky UIP400MTP pro efektivní vysokokapacitní oddělování biofilmu v 96jamkových destičkách. Protokol rovněž obsahuje klíčové kroky kultivace, promývání a vizualizace biofilmu se zaměřením na minimalizaci variability a zajištění reprodukovatelnosti.

Stafylokokový biofilm a výzkum antibiotik

Stafylokokové biofilmy hrají zásadní roli u perzistentních infekcí díky své odolnosti vůči antibiotikům a imunitním reakcím. Tvorba biofilmu poskytuje bakteriím ochranné prostředí, a proto se infekce obtížně léčí. Výzkum biofilmů se často zaměřuje na pochopení jejich tvorby, chování a citlivosti k antimikrobiálním látkám, s důrazem na vysokokapacitní metody, které zefektivňují experimentální postupy.
Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP nabízí ve výzkumu biofilmů významnou výhodu, protože umožňuje rychlé a efektivní oddělení biofilmů z 96jamkových destiček. Toto zařízení dodává rovnoměrnou ultrazvukovou energii do všech jamek, čímž zajišťuje konzistentní výsledky a zároveň minimalizuje variabilitu.

Protokol kultivace a oddělování stafylokokového biofilmu

Níže vás krok za krokem provedeme procesem kultivace a oddělení stafylokokového biofilmu. Jako příkladný analytický krok vám ukážeme, jak spektrofotometricky kvantifikovat kultivovanou biomasu barvením krystalovou violetí.

Kultivace stafylokokového biofilmu

Potřebný materiál:

• Sterilní 96jamkové polystyrenové mikrotitrační destičky s plochým dnem, upravené pro tkáňové kultury, s víčky
• Tryptický sójový bujón (TSB) s 0,25% glukózy
• Biologický bezpečnostní box

Postup:

1. Připravte sterilní pracovní prostředí v biologickém bezpečnostním boxu, abyste minimalizovali kontaminaci.
2. Do jamek mikrotitrační destičky přidejte TSB obsahující 0,25% glukózy. TSB bez glukózy obecně nepodporuje tvorbu biofilmu a měl by se používat pouze jako kontrola, je-li to nutné.
3. Jamky inokulujte bakteriálními kmeny připravenými podle níže uvedeného popisu:
4. Připravte bakteriální suspenze a zajistěte, aby neobsahovaly předem existující shluky buněk, a to homogenizací suspenzí pomocí sonikace nebo rozbitím shluků jehlou o velikosti 23 G a krátkým vortexováním.
5. Uzavřete destičku víčkem a inkubujte za podmínek optimálních pro tvorbu biofilmu (např. 37°C po dobu 24 hodin).
6. Pro zajištění spolehlivosti proveďte experiment pro každý bakteriální kmen v triplikátu (tři jamky na kmen).
7. Na každé destičce vyhraďte šest jamek pro negativní kontroly. Na jedné 96jamkové destičce lze testovat až 30 kmenů.

Vizualizace a promývání biofilmu

1. Po inkubaci opatrně odstraňte médium, abyste biofilm nenarušili.
2. Každou jamku čtyřikrát promyjte fyziologickým roztokem, abyste odstranili planktonní bakterie.
3. Zkontrolujte dno jamek, zda se na něm nenacházejí bílé skvrny ukazující na přítomnost biofilmu.

Oddělení biofilmu pomocí sonikátoru pro vícejamkové destičky UIP400MTP

Nastavení zařízení a parametry:

• Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP
• Provozní nastavení: amplituda 60%, cyklický režim 60 sekund ZAP / 30 sekund VYP

Postup:

1. Umístěte promytou mikrotitrační destičku na platformu UIP400MTP.
2. Sonikujte vzorky při doporučeném nastavení (amplituda 60%, 60 sekund ZAP, 30 sekund VYP). Nastavení přizpůsobte bakteriálnímu kmeni.
3. Spusťte proces sonikace k oddělení biofilmu. Ultrazvukové vlny narušují matrici biofilmu a uvolňují adherentní bakterie.
4. UIP400MTP zajišťuje rovnoměrné působení ve všech jamkách pro konzistentní výsledky oddělení.

Analytický krok: Kvantifikace biomasy odděleného stafylokokového biofilmu pomocí krystalové violeti (CV)

Potřebný materiál:

• 0,1% roztok krystalové violeti (CV)
• 95% ethanol nebo 30% kyselina octová (pro solubilizaci)
• Čtečka mikrodestiček schopná měření při 570 nm
• Sterilní mikrotitrační destičky pro barvení

Postup:

1. Příprava barvicí destičky: Přeneste 100 µL suspenze odděleného biofilmu z každé jamky sonikované destičky do odpovídajících jamek čisté sterilní 96jamkové mikrotitrační destičky. Tím se zajistí čisté a jednotné prostředí pro barvení.
2. Barvení odděleného biofilmu: Do každé jamky obsahující suspenzi odděleného biofilmu přidejte 150 µL 0,1% roztoku krystalové violeti. Jemně pipetujte, aby se suspenze biofilmu a krystalová violeť rovnoměrně promíchaly.
3. Inkubace: Nechte destičku inkubovat při pokojové teplotě 15 minut, aby krystalová violeť účinně obarvila biomasu.
4. Promývání: Po inkubaci opatrně odstraňte roztok krystalové violeti z jamek, aniž byste narušili biomasu. Každou jamku třikrát promyjte sterilním fyziologickým roztokem, abyste odstranili nenavázané barvivo.
5. Sušení: Nechte destičku uschnout na vzduchu při pokojové teplotě nebo pod sterilním laminárním boxem. Vyhněte se zahřívání, protože by mohlo změnit výsledky.
6. Solubilizace: Do každé jamky přidejte 200 µL 95% ethanolu (nebo 30% kyseliny octové, v závislosti na standardní laboratorní praxi), aby se navázaná krystalová violeť rozpustila. Jemně promíchejte pipetováním nebo třepáním destičky po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
7. Měření: Změřte optickou hustotu (OD) solubilizovaného roztoku krystalové violeti při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček.
8. Analýza dat: Od hodnot experimentálních jamek odečtěte průměrnou hodnotu OD570 negativních kontrol (jamky s TSB, ale bez bakteriálního inokula), abyste zohlednili barvení pozadí. Data zaznamenejte a analyzujte.

Poznámka: Pro zajištění reprodukovatelnosti proveďte experiment pro každou podmínku v triplikátu. Zajistěte správné zacházení s krystalovou violetí a ethanolem a dodržujte bezpečnostní předpisy a postupy pro likvidaci.

Hlavní výhody UIP400MTP v kostce:

• Vysokokapacitní zpracování: Navrženo speciálně pro vícejamkové destičky, což vám umožňuje zpracovávat více vzorků současně.
• Rovnoměrná distribuce ultrazvuku: Zajišťuje stejnou intenzitu ultrazvuku ve všech jamkách a poskytuje tak konzistentní výsledky u všech vzorků.
• Použijte jakoukoli standardní destičku: UIP400MTP pojme jakékoli standardní vícejamkové destičky, Petriho misky a stojánky na zkumavky. Nejsou potřeba žádné drahé proprietární destičky!
• Uživatelsky přívětivé rozhraní: Snadné nastavení a ovládání z něj činí vynikající nástroj pro zvýšení produktivity laboratoře. Programovatelná nastavení a automatizace usnadňují standardizaci procesů!