Protokol pro použití vícevzorkových sonikátorů Hielscher při analýze biofilmu a proteomické analýze

Vícevzorkové sonikátory, jako je sonikátor pro více zkumavek VialTweeter a sonikátor mikrodestiček UIP400MTP, zjednodušují laboratorní pracovní postupy pro vysokokapacitní aplikace. Obě zařízení umožňují přesné a rovnoměrné ultrazvukové zpracování více vzorků najednou, čímž minimalizují variabilitu a zlepšují reprodukovatelnost. To je výhodné zejména u experimentů, které vyžadují konzistentní lyzi vzorků, uvolnění biofilmu, extrakci proteinů nebo proteolytické štěpení. Ruční metody a metody zpracovávající jeden vzorek jsou v těchto případech méně efektivní a náchylné k nekonzistentnosti.

Zjednodušte pracovní postupy pomocí vícevzorkových sonikátorů

Například UIP400MTP umožňuje současné ultrazvukové ošetření jamek mikrodestičky a zajišťuje rovnoměrné uvolnění biofilmů nebo buněčného materiálu. VialTweeter zase nabízí přesnou lyzi a homogenizaci více vzorků ve zkumavkách bez křížové kontaminace. Tyto sonikátory výrazně zkracují dobu zpracování, zlepšují reprodukovatelnost experimentů a zachovávají vysokou integritu vzorků. Jsou proto nepostradatelnými nástroji ve výzkumu v mikrobiologii, proteomice a molekulární biologii.
Níže je uveden podrobný protokol, který ukazuje použití vícevzorkových sonikátorů Hielscher – sonikátoru pro více zkumavek VialTweeter a sonikátoru mikrodestiček UIP400MTP – ve studii zabývající se tvorbou biofilmu E. coli a následnou proteomickou analýzou.

Protokol: Tvorba biofilmu, jeho uvolnění a proteomická analýza s využitím vícevzorkových sonikátorů Hielscher

1. Příprava bakteriální kultury

• Kultivujte bakterie E. coli (kmen W3110) při 30°C, tedy při teplotě příznivé pro tvorbu biofilmu E. coli, v médiu tryptonový bujón (TB), které obsahuje:
  – 10 g/L tryptonu
  – 5 g/L NaCl
• Podle potřeby přidejte antibiotika, aby se zajistilo zachování plazmidů.
• Pro mikroskopii a studie aktivity promotorů použijte kmen E. coli W3110 s genomovým reportérem zesíleného GFP (eGFP) pod kontrolou promotoru rplL.
• K měření aktivit promotorů použijte reportérové plazmidy GFP pro různé promotory (např. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ).

2. Kultivace a uvolnění biofilmu

• Do každé jamky 12jamkové destičky (12jamkové destičky CellStar, Greiner Bio-One) naneste 1,5 mL zředěné bakteriální kultury.
• Inkubujte, aby se mohl vytvořit biofilm.
• Opatrně odstraňte planktonní (nepřisedlou) kulturu.

– Promyjte každou jamku 500 µL PBS.
– Uvolněte přisedlé buňky sonikací 12jamkové destičky v sonikátoru mikrodestiček UIP400MTP. UIP400MTP přivádí do všech jamek konzistentní ultrazvukovou energii, a zajišťuje tak rovnoměrné uvolnění.
– Nastavení sonikace: amplituda 60%, cyklický režim: 60 s zapnuto / 30 s vypnuto.

3. Sběr a lyze buněk

• Uvolněné buňky biofilmu centrifugujte při 4 500 g po dobu 5 minut.
• Peletované buňky promyjte PBS.
• Buňky resuspendujte ve 100 µL 2% laurylsarkosinátu sodného (SLS) a inkubujte při 95°C po dobu 15 minut.
• Pro úplnou lyzi buněk proveďte sonikaci pomocí sonikátoru pro více zkumavek VialTweeter.
  – Nastavení sonikace: amplituda 100%, 50 s zapnuto / 10 s vypnuto, celková doba běhu 10 min; vzorky udržujte na ledu.

4. Redukce a alkylace

• K redukci disulfidových vazeb přidejte 5 mM tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP) a inkubujte při 95°C po dobu 15 minut.
• Proteiny alkylujte 10 mM jodacetamidem po dobu 30 minut při 25°C.

5. Kvantifikace a štěpení proteinů

• Centrifugací odstraňte z lyzátů zbytky buněk.
• Celkový obsah proteinů stanovte pomocí soupravy Pierce BCA Protein Assay Kit.
• 50 µg celkového proteinu štěpte 1 µg trypsinu v roztoku obsahujícím 2% SLS a 100 mM hydrogenuhličitanu amonného.
• Štěpnou reakci inkubujte přes noc při 30°C.

6. Purifikace peptidů

• Vysrážejte SLS přidáním 1,5% kyseliny trifluoroctové (TFA) a poté centrifugujte.
• Peptidy purifikujte pomocí mikrocentrifugačních kolonek C18.
• Purifikované peptidy vysušte a resuspendujte v 0,1% TFA.

7. Kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS)

• Peptidy analyzujte na hmotnostním spektrometru Q-Exactive Plus propojeném se systémem Ultimate 3000 RSLC nano.
• Peptidy separujte na koloně HPLC s reverzní fází (75 µm × 42 cm) naplněné pryskyřicí C18 (2,4 µm).
• Použijte gradient rozpouštědla B (acetonitril s 0,15% kyseliny mravenčí) od 2% do 35% po dobu 140 minut.
• Data získejte pomocí MS skenů s vysokým rozlišením, po nichž následují tandemové MS/MS skeny 10 nejintenzivnějších iontů.

8. Analýza dat

• Nezpracovaná data LC-MS zpracujte v softwaru Progenesis.
• Exportujte soubory .mgf a analyzujte je v programu MASCOT.
• Kvantifikaci peptidů proveďte pomocí SafeQuant pro kontrolu kvality a korekci míry falešně pozitivních objevů.
• Pro zajištění reprodukovatelnosti provádějte všechny experimenty v duplikátech nebo triplikátech.

Vícevzorkové sonikátory pro vysokokapacitní přípravu vzorků

Vícevzorkové sonikátory VialTweeter a UIP400MTP výrazně zvyšují přesnost a efektivitu experimentálních pracovních postupů, zejména ve výzkumu biofilmů a v proteomice. Protože dokážou rovnoměrně zpracovat více vzorků, zajišťují vysokou kapacitu bez snížení kvality dat. Díky těmto výhodám a výše popsaným zjednodušeným pracovním postupům jsou vícevzorkové sonikátory Hielscher nezbytnými nástroji moderního biologického výzkumu.

Design, výroba a poradenství – kvalita vyrobená v Německu

Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou známé svou nejvyšší kvalitou a nejvyššími konstrukčními standardy. Díky robustnosti a snadné obsluze lze naše ultrazvukové přístroje hladce integrovat do průmyslových provozů. Ultrazvukové přístroje Hielscher si snadno poradí s drsnými podmínkami a náročným prostředím.

Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje, které kombinují nejmodernější technologii se snadným ovládáním. Ultrazvukové přístroje Hielscher samozřejmě vyhovují požadavkům CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.