Protokol využívající Hielscher Multi-Sample Sonicators v biofilmu a proteomické analýze

Použití vícevzorkových sonikátorů, jako je VialTweeter Multi-Tube Sonicator a UIP400MTP Microplate Sonicator, zefektivňuje laboratorní pracovní postupy pro aplikace s vysokou propustností. Obě zařízení umožňují přesné a rovnoměrné ultrazvukové zpracování více vzorků, minimalizují variabilitu a zvyšují reprodukovatelnost. To je výhodné zejména v experimentech vyžadujících konzistentní lýzu vzorku, oddělení biofilmu, extrakci proteinů nebo proteolytický rozklad, kde jsou manuální nebo jednovzorkové metody méně účinné a náchylné k nekonzistenci.

Zjednodušte pracovní postupy pomocí vícevzorkových sonicators

UIP400MTP například umožňuje současné ultrazvukové ošetření jamek mikrodestiček, čímž je zajištěno rovnoměrné oddělení biofilmů nebo buněčného materiálu. Mezitím VialTweeter nabízí přesnou lýzu a homogenizaci více vzorků zkumavek bez křížové kontaminace. Tyto sonikátory výrazně zkracují dobu zpracování, zlepšují experimentální reprodukovatelnost a udržují vysokou integritu vzorku, což z nich činí nepostradatelné nástroje v mikrobiologii, proteomice a molekulárně biologickém výzkumu.
Níže je uveden podrobný protokol ilustrující použití Hielscherových vícevzorkových modelů sonikátoru, VialTweeter Multi-Tube Sonicator a Microplate Sonicator UIP400MTP, ve studii zahrnující tvorbu biofilmu E. coli a následnou proteomickou analýzu.

Protokol: Tvorba, oddělení a proteomická analýza biofilmu pomocí Hielscherových vícevzorkových sonikátorů

1. Příprava bakteriální kultury

• Kultivujte bakterie E. coli (kmen W3110) při 30 °C, což je teplota příznivá pro tvorbu biofilmu E. coli, v médiu tryptonového bujónu (TBC) obsahujícím:
  – 10 g/l tryptonu
  – 5 g/l NaCl
• Doplňujte antibiotika podle potřeby, abyste zajistili retenci plazmidu.
• Pro mikroskopické studie a studie promotorové aktivity použijte kmen W3110 E. coli s genomem zesíleným GFP (eGFP) reportérem pod kontrolou promotoru rplL.
• Využijte reportérové plazmidy GFP pro různé promotory (např. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) k měření činnosti promotérů.

2. Kultivace a oddělení biofilmu

• Vysévejte 1,5 ml zředěné bakteriální kultury na jamku do 12jamkové destičky (12jamkové destičky CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubujte, aby se umožnila tvorba biofilmu.
• Planktonní (neadhezní) kulturu opatrně odstraňte.

– Každá jamka se promyje 500 μl PBS.
– Odpojte připojené buňky sonikací 12jamkové destičky v UIP400MTP sonikátoru mikrodestiček. UIP400MTP zajišťuje rovnoměrné oddělení tím, že dodává konzistentní ultrazvukovou energii do všech jamek.
– Nastavení sonikace: 60% amplituda, režim cyklu: 60 s ON / 30 sec OFF.

3. Sběr a lýza buněk

• Odstřeďujte oddělené biofilmové buňky při 4 500 g po dobu 5 minut.
• Peletované články promyjte PBS.
• Buňky se resuspendují ve 100 μl 2% lauroylsarkosinátu sodného (SLS) a inkubují se při 95 °C po dobu 15 minut.
• Sonikujte pomocí VialTweeter Multi-Tube Sonicator, abyste zajistili úplnou lýzu buněk.
  – Nastavení sonikace: 100% amplituda, 50 s ZAPNUTO / 10 s VYPNUTO po dobu 10 minut celkové doby provozu; Uchovávejte vzorky na ledu.

4. Redukce a alkylace

• Přidejte 5 mM Tris(2-karboxyethyl)fosfin (TCEP) pro redukci disulfidových vazeb a inkubujte při 95 °C po dobu 15 minut.
• Alkylátové proteiny s 10 mM jodoacetamidem po dobu 30 minut při 25 °C.

5. Kvantifikace a trávení bílkovin

• Odstředivou lyzátovou kyselinou se odstraní nečistoty.
• Kvantifikujte celkový obsah bílkovin pomocí sady Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Štěpte 50 μg celkového proteinu s 1 μg trypsinu v roztoku obsahujícím 2 % SLS a 100 mM hydrogenuhličitanu amonného.
• Inkubujte trávicí reakci přes noc při 30 °C.

6. Čištění peptidů

• Vysrážejte SLS přidáním 1,5% kyseliny trifluoroctové (TFA) a poté odstřeďujte.
• Purifikujte peptidy pomocí mikrospinových kolon C18.
• Suché purifikované peptidy a resuspenduje se v 0,1% TFA.

7. Kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS)

• Analyzujte peptidy na hmotnostním spektrometru Q-Exactive Plus ve spojení s nano systémem Ultimate 3000 RSLC.
• Separujte peptidy pomocí HPLC kolony s reverzní fází (75 μm × 42 cm) balené s pryskyřicí C18 (2,4 μm).
• Aplikujte gradient od 2 % do 35 % rozpouštědla B (acetonitril s 0,15 % kyseliny mravenčí) po dobu 140 minut.
• Získejte data pomocí MS skenů s vysokým rozlišením následovaných tandemovými MS/MS skeny 10 nejintenzivnějších iontů.

8. Analýza dat

• Zpracovávejte surová LC-MS data pomocí softwaru Progenesis.
• Exportujte soubory .mgf a analyzujte je pomocí MASCOTu.
• Provádějte kvantifikaci peptidů pomocí SafeQuant pro kontrolu kvality a úpravu falešného objevu.
• Všechny experimenty provádějte v duplikátech nebo trojitých vyhotoveních, abyste zajistili reprodukovatelnost.

Vícevzorkové sonikátory pro vysoce výkonnou přípravu vzorků

Vícevzorkové modely sonikátoru VialTweeter a UIP400MTP výrazně zvyšují přesnost a efektivitu experimentálních pracovních postupů, zejména ve výzkumu biofilmu a proteomice. Jejich schopnost rovnoměrně zpracovávat více vzorků zajišťuje vysokou kapacitu bez ohrožení kvality dat. Tyto výhody v kombinaci s výše popsanými zjednodušenými pracovními postupy činí z vícevzorkových sonikátorů Hielscher základní nástroje pro moderní biologický výzkum.

Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrasonicators jsou dobře známí pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových zařízení do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnutelné Hielscher ultrasonikators.

Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.